酶法輔助浸提茶葉有效成分

楊劉艷，江和源，張建勇，徐斌，劉千錄，王偉偉

1(中國農業科學院茶葉研究所,農業部茶樹生物學與資源利用重點實驗室,浙江省茶葉加工工程實驗室,浙江 杭州,310008)　2(中國農業科學院研究生院, 北京, 100081)

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酶法輔助浸提茶葉有效成分

楊劉艷1,2，江和源1*，張建勇1，徐斌1,2，劉千錄1,2，王偉偉1

1(中國農業科學院茶葉研究所,農業部茶樹生物學與資源利用重點實驗室,浙江省茶葉加工工程實驗室,浙江 杭州,310008)2(中國農業科學院研究生院, 北京, 100081)

摘要以粒徑為0.63 mm的茶葉為原料，比較了不同提取方式對其有效成分浸出效果的影響，并對復合酶輔助提取法進行工藝優化。結果表明，復合酶(纖維素酶和果膠酶)對有效成分的提取效果較好，且條件溫和、操作簡便。以茶多酚、氨基酸、水浸出物的提取率為響應值，在單因素實驗的基礎上，運用四因素三水平正交設計優化出浸提工藝條件為：酶解溫度50 ℃、酶解時間75 min、酶解pH 5.0、復合酶添加量0.2%。在此條件下有效成分提取率分別為：茶多酚77.79%、氨基酸70.62%、水浸出物83.05%、咖啡堿82.13%。

關鍵詞茶葉；酶法輔助；有效成分；優化

浸提是茶葉深加工的一個關鍵環節，浸提效率的高低將直接影響茶葉有效成分的得率及產品品質[1]。目前工業生產上應用較多的提取方法是傳統高溫浸提，雖然提取效率高、時間短，但一些茶葉品質成分在相對高溫條件下易聚合形成不溶于冷水的絡合物[2-3]。采用冷浸法[4]進行提取，茶葉品質成分的變化小，同時也可減少易溶于熱水的部分蛋白質及果膠的浸出[5]，但提取效率相對較低且浸提時間長。利用超聲波技術進行提取能夠縮短浸提時間，減少溶劑的消耗量[6]，增加浸出物含量，提高浸出速率[7]。

孫慶磊[8]比較了上述3種浸提方式對綠茶主要化學成分浸出的影響，結果表明，超聲波對生化成分的提取率高于低溫浸提，而與高溫浸提接近。隨著現代生物技術的不斷發展，生物酶在茶葉的提取加工中得到了較好的應用[9]。生物酶能夠將植物材料降解成更為疏松的結構，使細胞中的有效成分最大限度地浸出，此外，酶法提取反應條件溫和，在降低成本和能耗上具有一定的優勢。張衛紅等[10]使用纖維素酶及果膠酶提取茶多酚，提取率可達98%以上，兒茶素的相對浸出量較沸水提取高出9%～10%。蔣麗[11]比較了超聲波提取、酶法提取、常規提取及超聲波協同酶法提取對茶多酚提取率的影響。結果表明，酶法提取與酶法協同超聲波提取均能獲得較高的茶多酚提取率。但該研究中水解酶僅選用了纖維素酶一個種類 ，未涉及其他水解酶或復合水解酶提取效果的比較。

本研究在上述基礎上，增加了復合酶浸提、超聲波協同復合酶浸提對茶多酚、氨基酸、咖啡堿、水浸出物等提取效果的比較。并對復合酶提取的酶添加量、時間、溫度、復配比及pH等因子進行篩選，進一步優化酶解工藝技術參數，以期為生物酶提取技術在茶葉深加工中的應用提供參考。

1材料與方法

1.1試驗材料

鮮葉原料，采自廣東，采摘標準為一芽2、3葉，采摘后不經殺青、揉捻工序，以120 ℃直接烘干。磨碎后過篩，選粒徑為0.63 mm茶樣備用。

纖維素酶(44 000 U/g)、果膠酶(>30 000 U/g)，購自綿陽禾本生物工程有限公司。

1.2儀器與試劑

高效液相色譜儀(LC-20AD)，日本島津公司；電熱恒溫水浴鍋(DK-S26型)，上海精宏實驗設備有限公司；手提式高速粉碎機；循環式多用真空泵(SHB-ⅢA型)，河南省太康科教器材廠；紫外分光光度計(UV-3600型)。

乙腈(色譜純)，兒茶素、咖啡堿標準品(購自SIGMA公司)；乙酸、福林酚試劑、水合茚三酮、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、檸檬酸、檸檬酸鈉、無水碳酸鈉等均為分析純。

1.3測定指標及方法

1.3.1兒茶素及咖啡堿的HPLC分析條件

用0.45μm微孔濾膜(水膜)過濾，利用高效液相色譜儀對濾液進行分析。色譜柱：日本cosmosil 5C18-AR-Ⅱ柱(4.6 mm×250 mm)。流動相：A相為體積分數為2%的乙酸，B相為體積分數為100%的乙腈。洗脫梯度：0～16 min，B相體積分數由6.5%線性升至15%；16～20 min，B相體積分數由15%線性升至25%；20～25 min，B相體積分數由25%線性降至6.5%。流速為1.0 mL/min，柱溫為35 ℃，檢測波長為280 nm。

1.3.2茶多酚、游離氨基酸的測定

茶多酚：福林酚法GB/T 8313—2008。

氨基酸：水合茚三酮比色法GB/T 8314—2002。

1.3.3提取率的計算[公式(1)]

T/%=(m/M)×100

(1)

式中：T，某種成分的提取率，%；m，某種成分的含量，g/g干物質；M，提取的某種成分含量，g/g干物質。

1.4數據分析

2結果與分析

2.1茶葉中主要成分含量

2.2浸提方式對有效成分提取效果的影響

在茶水比為1∶20的條件下，將茶葉以不同方式進行提取，提取方式、提取條件及結果見表1。

表1　提取方式及條件對茶葉有效物質浸出的影響

注：CK—純水浸提；超+纖—超聲波協同纖維素酶浸提；超+果—超聲波協同果膠酶浸提；超+復合—超聲波協同復合酶浸提； 0.1+0.1—0.1%的纖維素酶與0.1%的果膠酶組成的復合酶；數據為3次重復的平均值；同一列數據中標注相同字母的差異不顯著；差異顯著性水平為P≤0.01。依據相關參考文獻及預實驗結果，將提取溫度設置為50 ℃。

表1表明，超聲波協同復合酶浸提下，茶葉主要生化成分的浸出量顯著高于其他提取方式，這是由于纖維素酶和果膠酶的作用，使細胞壁的結構被破壞，加之超聲波的機械破碎和空化作用，使物質能充分溶出。復合酶輔助浸提與常規浸提的效果相當，二者之間無顯著差異。超聲波協同單酶的提取效果優于單酶輔助提取，說明超聲波輔助對于酶法提取茶葉品質成分具有積極作用。纖維素酶的提取效果較果膠酶要好，這是因為纖維素酶對細胞壁的破壞較果膠酶更為徹底。單一酶法浸提及超聲波浸提比純水浸提效率高，純水浸提時，細胞壁存在使擴散阻力大，因此細胞內有效成分的提取率相對較低。

常規浸提雖然可以獲得較高的提取率，但同時會引起茶葉香氣大量揮發、茶湯顏色變化及混濁[12]。超聲波協同復合酶浸提，其浸提溫度雖比常規浸提低，但超聲波強烈的振動作用，使附著在茶葉上的雜物轉移到茶湯中[13]，加之酶對細胞壁的水解作用，使茶葉中許多易于茶多酚絡合的物質也大量溶出(表2)，這對于茶湯的貯存是不利的。目前，超聲波提取多用于實驗研究，離工業化生產還有一定距離。復合酶輔助浸提的物質提取率與常規浸提相當，且可在低溫下進行，與超聲波協同復合酶提取相比，副產物少，操作簡便。因此，選擇復合酶輔助浸提作為茶葉有效成分的提取方式。

2.3復合酶輔助浸提的單因素實驗

2.3.1復配比對提取的影響

紅色文化有著不同的形態，主要包含紅色根據地、革命遺址以及抗戰英雄故居等，也體現在革命精神及其道德文化傳統等方面。山西省紅色文化種類更加豐富，重要黨歷史事件以及相關的機構遺址有上千處，革命紀念館共有738處，抗戰英雄的故居共有213處。其中被納入到國家文物保護單位的有劉胡蘭紀念館、白求恩紀念館、晉綏邊區革命紀念館、晉西北行政公署遺址、晉綏解放區革命烈士陵園等。

在茶水比為1∶20(g∶mL)， pH 5.0，提取溫度50 ℃、提取時間60 min，復合酶添加量為0.2%(復合酶質量與樣品質量的百分比，下同)，復配比[m(纖維素酶)∶m(果膠酶)]為1∶3、2∶3、1∶1、3∶1、3∶2的條件下，分別測定茶多酚、氨基酸、咖啡堿及水浸出物的提取率。復配比與有效成分的提取率關系如圖1。

m(纖維素酶)∶m(果膠酶)1-咖啡堿；2-水浸出物；3-氨基酸；4-茶多酚圖1　復配比對茶葉有效成分提取率的影響Fig.1　Effects of the composite ratio on extraction rate of tea leaves effective components

從圖1可以看出，隨著復配比的增加，茶多酚、咖啡堿及水浸出物的提取率先增加，復配比為1∶1時，提取率達到最大值，繼續增加復配比，各物質的提取率下降。方差分析表明,氨基酸的提取率變化同上，其提取率達到最大值的復配比為3∶2。綜合方差分析結果及上述趨勢，后續實驗均采用[m(纖維素酶)∶m(果膠酶)]=1∶1的酶解方式進行。

2.3.2酶添加量對提取的影響

在茶水比為1∶20(g∶mL)， pH 5.0，提取溫度50 ℃、提取時間60 min，[m(纖維素酶)∶m(果膠酶)]為1∶1，復合酶添加量為0.05%、0.2%、0.35%、0.5%及0.65%的條件下，分別測定茶多酚、氨基酸、咖啡堿及水浸出物的提取率。復合酶添加量與有效成分的提取率關系如圖2。

1-水浸出物；2-咖啡堿；3-茶多酚；4-氨基酸圖2　酶添加量對茶葉有效成分提取率的影響Fig.2　Effects of the enzyme amount on extraction rate of tea leaves effective components

由圖2可知，隨著復合酶總量的增加，各物質的提取率增大，在酶添加量為0.2%時，茶多酚的提取率達到最大，之后趨于平衡。當添加量增加到0.35%時，其他3種成分的提取率達到最大。這是因為隨著復合酶用量的增加，底物與酶充分結合，促進物質不斷浸出。當酶添加量超過0.35%時，復合酶相對于底物濃度過飽和，物質的提取率不再提高。對提取率進行方差分析，發現各物質的提取率在同一處理水平下存在顯著差異，說明相同條件下，物質的浸出能力不同。從復合酶的利用率及物質的提取率考慮角度，選擇0.35%作為復合酶的添加量。

2.3.3溫度對提取的影響

在茶水比為1∶20(g∶mL)， pH 5.0，提取時間60 min，纖維素酶∶果膠酶為1∶1，復合酶添加量為0.35%，溫度為30、40、50、60、70 ℃的條件下，分別測定茶多酚、氨基酸、咖啡堿及水浸出物的提取率。提取溫度與有效成分的提取率關系如圖3所示。

圖3　溫度對茶葉有效成分提取率的影響Fig.3　Effects of the extraction temperature on extraction rate of tea leaves effective components

由圖3可知，各物質的提取率隨著提取溫度的升高不斷增加， 50 ℃時達到最大值，繼續升高溫度提取率開始下降，水浸出物提取率的下降程度顯著高于其他物質，說明溫度對水浸出物提取的影響較大。這是因為在一定溫度范圍內，隨著溫度的升高，酶活性加強，有利于復合酶對細胞的水解破壞，物質不斷浸出，此外，升高溫度還能提供酶解反應所需的活化能[14]；溫度過高時，導致酶變性，催化活性減弱，有效成分的溶出量相對降低。

2.3.4時間對提取的影響

在茶水比為1∶20(g∶mL)， pH 5.0，提取溫度50 ℃，纖維素酶∶果膠酶為1∶1，復合酶添加量為0.35%，時間為30、45、60、75、90 min的條件下，分別測定茶多酚、氨基酸、咖啡堿及水浸出物的提取率。提取時間與有效成分的提取率關系如圖4所示。

圖4　提取時間對茶葉有效成分提取率的影響Fig.4　Effects of the extraction time on extraction rate of tea leaves effective components

由圖4可知，在浸提前期(30～60 min)茶多酚、咖啡堿及水浸出物的提取率快速增加，浸提中后期(60～90 min)，茶多酚及水浸出物的提取率增加緩慢，并趨于平衡，氨基酸提取率略有下降，可能在反應初期，底物濃度和酶的活性均較高，酶解反應較充分，隨著反應進行，產物積累到一定程度時，抑制了酶的活力，物質較少或不再溶出。

2.3.5pH對提取的影響

在茶水比為1∶20(g∶mL)，提取溫度50 ℃，提取時間75 min，m(纖維素酶)∶m(果膠酶)為1∶1，復合酶添加量0.35%，pH為4.0、4.5、5.0、5.5、6.0的條件下，分別測定茶多酚、氨基酸、咖啡堿及水浸出物的提取率。pH與有效成分的提取率關系如圖5所示。

圖5　pH對茶葉有效成分提取率的影響Fig.5　Effects of pH on extraction rate of tea leaves effective components

由圖5可知，隨著pH的升高，茶多酚、咖啡堿及水浸出物的提取率逐漸下降?？赡苁莗H的升高使酶的構象發生改變，活性降低，與底物的結合能力較弱，因而不能促進有效成分進一步溶出。氨基酸的提取率受pH的影響較大，呈現先快速增加后趨于穩定的趨勢，這可能與茶湯過低的pH值影響了氨基酸測定過程中緩沖液的pH，從而使吸光度發生變化。此外，方差分析表明，當pH超過5.5時，各物質之間的提取率無顯著差異。

2.4復合酶輔助浸提正交實驗與優化

基于單因素試驗結果，在一定試驗條件下，茶多酚與咖啡堿提取率的變化趨勢基本一致，而氨基酸和水浸出物的提取率受某些條件的影響較大，因此，選取茶多酚、氨基酸及水浸出物的提取率作為工藝優化的響應值。工藝優化試驗選取酶解溫度(A)、酶解時間(B)、酶解pH(C)、復合酶添加量(D)4個因素，進行L9(34)正交實驗。試驗因素水平見表2；試驗設計及結果見表3。

表2　正交試驗因素水平表

表3　正交試驗設計及結果

由表3可知，影響茶多酚提取率的因子主次順序為C>A>D>B，提取的最佳組合為A3B3C2D2；影響氨基酸提取率的因子主次順序為C>B>A>D，提取的最佳組合為A2B2C3D2；影響水浸出物提取率的因子主次順序為C>A>D>B，提取最佳組合為A1B3C1D3。由于3個指標單獨分析確定的最優條件并不一致，因此需結合方差分析進行綜合考慮。

對茶多酚、氨基酸及水浸出物的提取率進行方差分析，結果見表4、表5和表6。

表4　茶多酚提取率的方差分析

表5　氨基酸提取率的方差分析

表6　水浸出物提取率的方差分析

方差分析結果表明，酶解pH對茶多酚及氨基酸的提取率有極顯著影響，對水浸出物的提取率有顯著影響； 酶解溫度對茶多酚的提取率有極顯著影響；酶解溫度及酶解時間對氨基酸的提取率有顯著影響。復合酶的添加量對各成分的提取率影響都不顯著。

對因素A而言，其對茶多酚的影響是極顯著的，選擇A3為好；而對氨基酸的影響是顯著的，選擇A2為好；對水浸出物無顯著影響。取A3時，茶多酚的提取率相對提高1.7%，水浸出物的提取率相對提高0.9%，取A2時，氨基酸的提取率相對提高1.9%，從生產成本角度，選擇A2(50 ℃)較好。同理對因素B、C、D進行分析，綜合平衡后確定出最優提取條件為A2B2C1D2。

2.5驗證實驗

對確定的最優條件，即酶解溫度為50 ℃、酶解時間75 min、酶解pH5.0、復合酶添加量為0.2%進行驗證實驗，結果見表7。該提取條件下，物質的綜合提取率相對較高。

表7　優化條件下有效成分的提取率

3結論

比較9種提取方式對茶葉有效成分提取率的影響，發現以纖維素酶與果膠酶按照1∶1的復配比組成的復合酶，對茶多酚、氨基酸及咖啡堿的提取率與常規浸提法相當。與其他方式相比，復合酶輔助提取法具有反應條件溫和、操作簡便等特點，具有較為廣闊的應用前景。實驗選擇復合酶輔助法對茶葉進行提取。

通過實驗，得到的最優提取條件為：酶解溫度50 ℃、酶解時間75 min、酶解pH5.0、復合酶添加量0.2%。在此條件下有效成分的提取率分別為：茶多酚77.79%、氨基酸70.62%、水浸出物83.05%、咖啡堿82.13%。

武永福[14]的實驗表明，纖維素酶和果膠酶的添加量各為0.25 %，原料粉碎至16目，溫度50 ℃，提取時間60 min，茶水比1∶15提取兩次(1∶8和1∶7)，在此條件下茶多酚的提取率較常規提取稍低，水浸出物為常規浸提的1.24倍。在本試驗優化條件下，茶多酚的提取率較常規提取高出10.72%，水浸出物的含量較常規提取高4.22%。譚淑宜[15]比較了不同酶組合對綠茶化學成分的提取效果發現，0.3%纖維素酶與0.1%果膠酶組合對水浸出物的提取效果較好，與對照相比高出21.8%，氨基酸的提取率比對照高出27%，但茶多酚和咖啡堿的提取效果不明顯。在本試驗最優條件下，各物質的提取率與對照相比都有明顯增加，其中茶多酚提取率比對照高出26.72%、咖啡堿高出23.90%、水浸出物高出11.51%，氨基酸增加1.03%。由于茶葉品種和處理方式不同，提取工藝條件也有區別，因此文獻中茶葉各種化學物質的提取率存在一定差異，但在本試驗的優化條件下，各物質均有較好的提取率，這對于實際生產具有一定的參考價值。

參考文獻

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Optimization of enzyme-assisted extraction on effective components from tea leaves

YANG Liu-yan1,2, JIANG He-yuan1*,ZHANG Jian-yong1, XU Bin1,2,LIU Qian-lu1,2, WANG Wei-wei1

1(Tea Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Key Laboratory of Tea Plants Biology and Resources Utilization of Agriculture Ministry,Key Laboratory of Tea Processing Engineering of Zhejiang, Hangzhou 310008, China)2(Graduate School of Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China)

ABSTRACTWith tea leaves crushed into particle size of 0.63 mm as the raw material, the effects of different extraction methods on the extraction of effective components were studied, and the conditions of composite enzyme-assisted extraction were optimized. The results showed that composite enzyme (cellulase and pectinase) was preferably used to extract the effective components, furthermore, the extraction condition of this method was mild and the manipulation was simple. The extraction rate of tea polyphenols, amino acid and water extracts were used as the response values. On the basis of single-factor test, the optimized extraction conditions using a orthogonal design of four factors at three levels were extraction temperature 50 ℃, extraction time 75 min, pH 5.0, and 0.2% composite enzyme. Under these conditions, the extraction rates of effective components were 77.9% of polyphenols, 70.62% of amino acids, 83.05% of water extracts, and 82.13% of caffeine, respectively.

Key wordstea leaves; enzyme-assisted; effective components; optimization

收稿日期：2015-07-14，改回日期：2015-10-13

基金項目：公益性行業(農業)科研專項(201503142-11)；中國農業科學院科技創新工程(CAAS-ASTIP-2015-TRICAAS)

DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201602038

第一作者：碩士研究生(江和源研究員為通訊作者，E-mail:jianghy@tricaas.com)。