正常培養條件下綿羊卵母細胞減數分裂從中期I至中期III的動態變化過程

李欣欣 白春玲 魏著英 李光鵬

（內蒙古大學 哺乳動物生殖生物學及生物技術教育部重點實驗室，呼和浩特 010021）

正常培養條件下綿羊卵母細胞減數分裂從中期I至中期III的動態變化過程

李欣欣 白春玲 魏著英 李光鵬

（內蒙古大學 哺乳動物生殖生物學及生物技術教育部重點實驗室，呼和浩特 010021）

以綿羊卵母細胞為研究對象，通過免疫組織化學的方法研究其染色體和紡錘體微管及微絲在體外成熟、孤雌激活過程中的動態變化。結果表明：（1）紡錘體的形態由中期的桶形，變成早后期的圓柱形及后期和末期細長而扁平的三角錐形，與椎體底面連接的染色質將來進入極體并最終被排出。（2）染色體形態從中期單個的清晰可見的狀態，變為后期和末期凝縮的染色質狀態，隨后在下一個中期再次呈現出清晰可見的形態。（3）第一次減數分裂中期（MI）紡錘體比第二次減數分裂中期（MII）和第三次減數分裂中期（MIII）大，但MII期紡錘體形態比MI期更接近桶形。（4）幾乎所有組成紡錘體的微管和微絲都被分配到極體中。

減數分裂；微管；微絲；紡錘體；卵母細胞；綿羊

哺乳動物配子形成的減數分裂過程，染色體只復制一次，細胞連續分裂兩次，使配子染色體數目減半，從而保證了受精后物種染色體數目的恒定。前減數分裂間期（Pre-meiotic interphase）是減數分裂前的間期，主要為減數分裂進行物質準備，包括DNA的復制、相關蛋白質的合成及細胞分裂相關因子的裝配。在前減數分裂間期之后有兩次連續的減數分裂過程。第一次減數分裂后，染色體數目減半，第二次減數分裂則類似于同物種的有絲分裂［1］。兩次連續的減數分裂，核是均等分裂的。對于雄性配子而言，胞質是均等分裂的，但是在雌性配子中，胞質呈不對稱分裂方式。一個初級卵母細胞通過減數分裂形成一個稍大的卵母細胞和2-3個非常小的極體。細胞的不對稱分裂一般發生在可以產生不同命運子細胞的體細胞中，相應地，其產生的子細胞大小也存在一定差異［2］。目前研究表明，Par蛋白和G蛋白信號通路調控細胞的不對稱分裂、紡錘體的不對稱性和微管的動態變化［2-4］。在卵母細胞減數分裂過程中，幾乎所有的胞質都被分配到次級卵母細胞中，只有少量胞質進入極體。通常情況下，排出第一極體（Pb1）是完成第一次減數分裂（MI）的標志，隨后卵母細胞將停滯在第二次減數分裂中期（MII）。MII期卵母細胞的激活與受精相關。如果沒有受精，老化的卵母細胞會在胞內模擬受精的過程，增加胞內鈣離子濃度，從MII期恢復。在一些哺乳動物中，如小鼠、倉鼠、大鼠，這種“部分激活”的卵母細胞無法進一步發育，只能停滯于一個新的中期樣階段（MIII）［5］。綿羊卵母細胞在孤雌激活后，停滯于MII期的卵母細胞進入第二次減數分裂并排出第二極體（Pb2），隨后這些卵母細胞的染色體也要經歷一個與前兩個中期相似的排列方式，因此將這一階段也稱為MIII。細胞骨架的動態變化在染色體的凝集、同源染色體和姐妹染色體單體的分離、核物質向皮質區的運輸、Pb1和Pb2的排出、細胞器的運輸和重新定位都具有重要的作用。關于低等脊椎動物微管和微絲動態變化的研究已經非常廣泛，如非洲爪蟾［6-9］和果蠅［7，10］。研究結果表明，紡錘體是一種呈動態變化的細胞器，它的形成和形態變化主要依賴于微管和微絲的活動及染色體和微管相關的動力蛋白的作用［8，11，12］。有關于哺乳動物減數分裂的研究多集中于嚙齒類，特別是小鼠［13-17］，在豬［18-21］、馬［22，23］和牛［24，25］等家畜動物上的研究非常有限。這些研究揭示嚙齒類動物在卵母細胞成熟和受精時細胞骨架的功能是非典型的［21，26］。牛卵母細胞微管組織和構成的機制與小鼠不同，但與蛙等低等脊椎動物更為相似［27，28］。

本研究系統分析綿羊卵母細胞減數分裂過程中紡錘體形成和形態變化，并對染色體的排列和分離及其動態變化進行細致的觀察，同時研究MII期染色體和極體與微管和微絲之間的聯系。此外對紡錘體形成、染色體分離、極體排出和卵母細胞不對稱分裂的機制也進行了探討。

1 材料與方法

1.1 材料

除特別提到化學試劑，其余均購自Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 綿羊卵母細胞的體外成熟 綿羊卵巢取自當地屠宰場，置于生理鹽水中帶回實驗室。生理鹽水清洗3遍后，在含采卵液（M199 + 2.2 g/L NaHCO3+ 10 mmol/L Hepes + 5 IU/mL肝素+ 1%FBS）的培養皿中，用手術刀片割取卵巢表面2-8 mm卵泡內的卵丘-卵母細胞復合體（COCs）。選取胞質均勻、卵丘細胞完整的卵母細胞在四孔板中進行成熟培養，成熟培養液為M199 + 10% OES + 0.01 g/mL E2+ 0.01 IU/mL FSH + 1 IU/mL LH + 2 mmol/L丙酮酸鈉。按50枚/0.5 mL成熟培養液培養卵母細胞，培養條件為38.5℃、100%濕度和5% CO2的氣相。

1.2.2 微管和微絲的免疫熒光染色 經0.1%透明質酸酶去除卵丘細胞的卵母細胞用PBS（-）+0.3% BSA洗3遍，PBS（-）+ 4%多聚甲醛+0.2% TritonX-100室溫固定通透1 h，然后使用PBS（-）+3% BSA室溫封閉1-2 h。微管免疫熒光染色：封閉后的卵母細胞在驢抗小鼠α-Tubulin單克隆抗體（用PBS（-）+0.3% BSA 1∶500稀釋）中4℃孵育過夜。PBS（-）+0.3% BSA中洗3遍，在FITC標記的山羊抗鼠二抗（Upstate）中室溫孵育1 h，二抗稀釋比例為1∶500。PBS（-）+0.3% BSA洗3次，用10 μg/mL的PI對細胞核進行染色，封片后，激光共聚焦觀察。微絲染色：卵母細胞固定通透后，放入用PBS（-）+0.3% BSA以1∶300稀釋的FITC-鬼筆環肽中，37℃孵育1 h，PBS（-）+0.3% BSA洗3次，經PI染核后封片觀察。研究中每組實驗至少重復3次，每次重復設備都設置相同的參數，圖片分析采用OLYMPAS圖像分析軟件進行。

核相的區分。GV：染色質呈絲狀散亂分布。MI：染色體排列在赤道板上。AI：同源染色體彼此開始分離，紡錘體拉長。TI：同源染色體已經分離，染色質凝縮在一起。MII：染色體再一次排列在赤道板上，并形成Pb1，微管不與第二次減數分裂中期染色體相連。AII：同源染色體開始再次分離，紡錘體被拉長。TII：兩部分染色體分離，并且具有明顯的Pb1。MIII：染色體再次排列在赤道板上形成紡錘體，并且具有Pb1和Pb2。

1.2.3 實驗設計

1.2.3.1 綿羊卵母細胞體外成熟不同時間Pb1的排出率 將體外成熟14、16、17、18、20、24和26 h的綿羊卵母細胞，在0.1%透明質酸酶中渦旋震蕩去除卵丘細胞，統計綿羊卵母細胞成熟不同時間Pb1的 排出率。

1.2.3.2 綿羊卵母細胞體外成熟不同時間紡錘體和染色體的動態變化 1.2.3.1的結果表明，在成熟14 h時就有卵母細胞排出Pb1。因此，為了精確的確定核的狀態和分析紡錘體和染色體在減數分裂中的動態變化，將體外成熟后0、2、4、6、8、10、12、14、16、17、18、20、24和26 h的卵母細胞分別固定，經微管和微絲及染色體的免疫熒光染色，觀察紡錘體和染色體的形態。其中未排出Pb1的卵母細胞也分別進行固定。核相通過紡錘體和染色體的形態進行評估。

1.2.3.3 綿羊卵母細胞孤雌激活后不同時間紡錘體和染色體的動態變化 1.2.3.2的結果揭示了紡錘體和染色體在綿羊卵母細胞第一次減數分裂中所具有的一些獨特的變化，本實驗主要是研究紡錘體和染色體在綿羊卵母細胞第二次減數分裂中的動態變化規律。成熟25 h后，挑選具有Pb1的卵母細胞用5 μmol/L離子霉素處理5 min，洗3次，10 μg/mL CHX（CR1aa溶解）處理4 h，再洗3次后于CR1aa發育液中培養。經微管和微絲及染色體的免疫熒光染色，觀察激活后0.5、1、3、4、6和8 h紡錘體和染色體的動態變化。

2 結果

2.1 綿羊卵母細胞體外成熟過程中的減數分裂進程

本研究共檢測了231枚綿羊卵母細胞，其中排出Pb1的卵母細胞有186枚（表1），成熟率為80.5%。成熟培養0-4 h，多數的卵母細胞都處于GV期（圖1-A）。體外培養4 h開始生發泡破裂（GVBD），8 h時幾乎所有的卵母細胞都已發生GVBD。綿羊卵母細胞排出Pb1是不對稱分裂的，開始觀察到Pb1是體外成熟14 h，隨著成熟時間的延長，Pb1的排出率逐漸升高，到26 h達到77.0%。其中體外成 熟14、16、17、18、20、24和26 h，Pb1的 排出率分別為8.9%、13.3%、20.2%、29.0%、45.2%、75.3%和77.0%。通過分析成熟不同時間排出第一極體的綿羊卵母細胞的核相發現，在成熟14 h，約90%的卵母細胞處于AI期（圖1-E）；到16 h時，約70%的卵母細胞處于AI期，其余的卵母細胞則到達TI期（圖1-G），但沒有卵母細胞進入MII期（圖1-L）；體外培養17 h，只有3.8%的卵母細胞進入MII期；24 h后，80%左右的卵母細胞到達MII期（圖1-L）。沒有排出Pb1的卵母細胞幾乎都停滯在MI期（圖1-H）。

表1 排出第一極體的綿羊卵母細胞成熟不同時間所處核相

2.2 綿羊卵母細胞體外成熟不同時期染色體和微管的動態變化

將體外成熟0、2、4、6、8、10、12、14、16、17、18、20、24和26 h的卵母細胞分別進行免疫熒光染色觀察其微管的動態變化。結果顯示，在0-4 h的GV期卵母細胞核內，染色質呈絲狀，并未觀察到微管的特異性著色（圖1-A）。當卵母細胞到達PreMI期，染色質部分凝縮，此時在染色質周圍能夠清晰看到特異性著色的微管（圖1-B）。 在MI期，染色體整齊的排列在赤道板上，與微管形成桶形的紡錘體結構（圖1-C）。AI期早期時，同源染色體開始從中期板向兩極移動（圖1-D）。到達AI期后，同源染色體分離形成兩部分，而此時微管位于分開的兩部分染色體中間（圖1-E）。A I-TI期時，紡錘體變成細長的三角錐形，此時與錐體底面連接的那一部分染色體將會被排出（圖1-F、G）；在這一時期，有的卵母細胞還存在三極紡錘體結構（圖1-I、J）。TI末期幾乎所有微管都連接在之后要形成Pb1的染色體上，隨染色體被一起排到卵母細胞外。典型的MII期染色體排列在赤道板上，形成MII期紡錘體，此時的染色體明顯小于MI期，Pb1被排出（圖1-H、K、L）。圖1-F-H可以清晰的顯示出微管跟隨將要形成Pb1的染色體進行動態遷移的過程，微管與染色體一起被分配到Pb1中，并最終被排出。

圖1 綿羊卵母細胞體外成熟不同時期染色體和微管動態變化（100×）

2.3 綿羊卵母細胞體外成熟不同時期微絲的動態變化

GV期到AI期，微絲主要分布于卵膜下的皮質區（圖2-A、B、C），此時并未觀察到其與染色體之間的聯系。到達AI期后，除了在卵膜下有微絲分布外，在分開的同源染色體周圍可以清晰地看到微絲的聚集（圖2-D）。AI-TI期時，位于分開的同源染色體周圍的大部分微絲向之后要形成極體染色體的一方遷移（圖2-E）。到MII時，極體染色體連同大部分的微絲被排出卵母細胞外。Pb1形成后，可以觀察到形成第一次減數分裂紡錘體的大部分微管和微絲位于極體中。觀察還發現，有些TI-MII期的卵母細胞，同源染色體之間并無微管與微絲的著色，但在將來要被排出形成Pb1的染色體周圍卻有大量的微管和微絲存在。隨后微管和微絲重新聚集在同源染色體周圍，并形成MII期紡錘體。

圖2 綿羊卵母細胞體外成熟不同時期染色體和微絲的動態變化（100×）

2.4 綿羊卵母細胞孤雌激活后不同時間紡錘體和染色體的動態變化

綿羊卵母細胞MII期到MIII期紡錘體的動態變化與MI期至MII期高度相似。卵母細胞經25 h體外成熟后進入MII期（圖3-A），之后被孤雌激活。分析MII期卵母細胞孤雌激活后進程（表2）可知，激活后0.5 h，68.0%的卵母細胞還是位于MII期，只有28.0%的卵母細胞到達AII期（圖3-B、C），AII期的卵母細胞染色體開始從赤道板向兩極分離，分開的兩部分染色體中間有大量的微管相連。激活后1 h，絕大部分卵母細胞（73.9%）位于AII期，只有4.3%卵母細胞到達TII期（圖3-D-G）。激活后2 h，55.6%的卵母細胞還是位于AII期，22.2%的卵母細胞到達TII期，開始有少量的卵母細胞（5.6%）到達MIII期（圖3-H、I）。當卵母細胞到達早TII期，紡錘體變成細長的三角錐形（圖3-D、E），此時與紡錘體底面連接的那部分染色體之后會被排出卵母細胞，成為Pb2染色體。隨著卵母細胞到達晚TII期，形成中期染色體質的一方并沒有微管相連，幾乎所有的微管都跟隨要形成Pb2的染色體排出卵母細胞（圖3-F、G），激活后3 h，56.0%的卵母細胞到達TII期，20.0%的卵母細胞到達MIII期，有4.0%的卵母細胞形成原核。激活后4 h，半數的卵母細胞（58.6%）到達MIII期，17.2%的卵母細胞形成原核。MIII期的染色體并不像MI和MII期的染色體都整齊的排列在赤道板上，而是有部分染色體仍在赤道板之外（圖3-H、I）。此時的紡錘體比MII期紡錘體小，而且Pb2也小于Pb1（圖3-H、I）。激活后8 h，絕大部分的卵母細胞（89.7%）都已形成原核。

表2 MII期卵母細胞孤雌激活后進程

3 討論

已有研究表明，微管和微絲在紡錘體的形成、染色體的排列及分離、極體的排出和胞質分裂過程中起著重要作用［15，17，22-24，29］，但其相關的機制還不是十分明確。有關綿羊卵母細胞體外成熟過程中紡錘體的形成、極體的排放等現象尚未見到系統的觀察報道，本研究以綿羊卵母細胞為模型，觀察和描述了減數分裂及孤雌激活過程中構成紡錘體主要成分微管和微絲的動態變化及其在綿羊卵母細胞減數分裂MI-MIII期可能的命運。研究結果表明，紡錘體從MI和MII期的桶形變成早AI和AII期的圓柱形，然后變成TI和TII期細長的三角錐形。與小鼠典型的桶形染色體相比［13-15，17，30］，綿羊MI的紡錘體直徑明顯要大，而且具有更大的平的兩極，此時組成紡錘體的微管只覆蓋于整齊排列的染色體表面，并不發出長的微管束到兩級。在MI和MII紡錘體中，染色體整齊的排列在赤道板上。MIII紡錘體比MII期小，染色體并不嚴格地排列在赤道板上，有些染色體甚至在紡錘體之外，而且排列的方向似乎也是隨機的。研究顯示紡錘體的形狀和大小也受環境因素影響，體外成熟的小鼠卵母細胞通常具有更大的紡錘體和更平的兩極［17］。同時本研究還發現，構成紡錘體的大部分微管和微絲都隨著將要形成Pb1和Pb2的染色體移動，并隨著這些染色體被排出卵母細胞外。中期的染色體是單個分明的，容易觀察。在后期的較晚階段，直到卵母細胞到達下一個中期之前，染色體去凝縮，呈現團狀的染色質狀態。排出Pb1和Pb2以后，不清晰的中期染色體又開始變得清晰可見，可以分辨出單個的染色體，此時極體的染色質仍然凝縮成團，并且其周圍聚集大量微管，此結果不同于小鼠和豬的研究結果［19-21］，但與牛的研究結果一致［25］。綿羊卵母細胞到達早AI期時，要進入Pb1的染色質隨著卵膜凸起被排出。體外成熟12 h便可觀察到卵膜上的這種凸起，并且組裝成類似Pb1的結構。在17 h前的AI和TI期，多數的卵母細胞都具有這種結構。幾乎所有具有Pb1凸起的卵母細胞，在20 h時都能到達MII期。胞質分裂完成后，Pb1從卵母細胞分離，成為一個獨立的小細胞，主要含有微管、微絲和少量胞質。事實表明是否具有Pb1并不是卵母細胞到達MII期所必須的。

圖3 綿羊卵母細胞MII-MIII期紡錘體和染色體的動態變化（100×）

微絲對于小鼠和豬的卵母細胞核遷移和極體的排放非常重要［21，30-32］。微絲的出現與分布也隨著減數分裂呈動態變化，而且隨著極體的排出，絕大多數微絲也被排出。這一現象與我們之前在牛卵母細胞中的觀察結果一致［25］。處于GV、GVBD、PreMI和MI期的綿羊卵母細胞，微絲分布在卵膜下的皮質區，直到早AI期才出現在染色質區。微絲從AI到TI期變得非常明顯。隨著紡錘體微管的不斷變化，微絲向兩團染色中將來形成Pb1的一方移動。隨著Pb1的排出，幾乎所有的微絲都隨著極體染色質排出。在第二次減數分裂中，Pb2的排出也存在相似的現象。但在豬卵母細胞成熟的過程中，微絲聚集在MI期紡錘體所在的區域，這可能是物種差異所致［21］。

根據在新桿狀線蟲上的報道，微管和微絲在不對稱性分裂的建立和維持上具有重要作用［33，34］。因此，我們認為紡錘體微管和微絲主要參與卵母細胞的不對稱分裂。在這種不對稱分裂中，紡錘體及其相關成分令染色體均衡分布，并將其他分子不對稱地分布到卵母細胞和極體中。次級卵母細胞的體積在第二次減數分裂完成后似乎沒有明顯的改變，其中含有早期胚胎發育所需的全部蛋白質和分子，極體則主要含有微管和微絲及少量的胞質。

哺乳動物卵母細胞，除小鼠外皆無中心體。小鼠多數的微管組織中心（MTOC）或胞質中心粒和具有微管成核活性的中心粒外周物質都在胞質中。小鼠減數分裂紡錘體極的形成與MTOC有關［15，16，35，36］。然而家畜動物因為缺乏中心粒，其微管的組裝并不是由MTOC組織的［25］，因此推測，其紡錘體的形成和染色體的分離可能與MTOC無關。綿羊的卵母細胞紡錘體與牛類似，都是典型的無星紡錘體，染色體可能在紡錘體的組裝中起非常關鍵的作用。微管以隨機的方式圍繞染色體，其可能在染色體動力因子或聯合微管相關動力因子的作用下，被分類捆扎成一種反平行且雙極的排列方式［8，37］。我們的研究結果表明，染色體的形態從中期可見的單個的形態變為后期和末期雜亂無序的狀態，之后在下一個中期時段又重新變得清晰可見。同時，紡錘體微管也從桶形變成圓柱形，再到錐形。位于分開的同源染色體和姐妹染色單體之間的大部分微管和圍繞其周圍的大部分微絲都跟隨極體染色體體進行遷移，并最終分配到極體中。紡錘體形成和染色體分離似乎是依賴染色體完成的。

4 結論

本研究系統的分析了正常培養條件下綿羊卵母細胞減數分裂從中期I至中期III的動態變化過程。結果顯示：（1）紡錘體的形態由中期的桶形，變成早后期的圓柱形及后期和末期細長而扁平的三角錐形，連接在錐體底面的染色質將來進入極體并最終被排出。（2）染色體形態從中期單個可見的狀態，變為后期和末期凝縮的染色質狀態，隨后在下一個中期再次呈現出單個而清晰可見的形態。（3）第一次減數分裂中期（MI）紡錘體比第二次減數分裂中期（MII）和第三次減數分裂中期（MIII）大，MII期紡錘體形態比MI期更接近桶形。（4）幾乎所有組成紡錘體的微管和微絲都被分配到極體中。

［1］Wolfe S. Molecular and cellular biology［M］. Belmont, California：Wadsworth Publishing Company, 1993：1050-1062.

［2］Kaltschmidt JA, Brand AH. Asymmetric cell division：microtubule dynamics and spindle asymmetry［J］. J Cell Sci, 2002, 115：2257-2264.

［3］Horvitz HR, Herskowitz I. Mechanisms of asymmetric cell division：two Bs or not two Bs, that is the question［J］. Cell, 1992, 68：237-255.

［4］Lu B, Jan L, Jan YN. Control of cell divisions in the nervous system：symmetry and asymmetry［J］. Annu Rev Neurosci, 2000, 23：531-556.

［5］Tripathi A, Kumar KV, Chaube SK. Meiotic cell cycle arrest in mammalian oocytes［J］. J Cell Physiol, 2010, 223：592-600.

［6］Ohsumi K, Sawada W, Kishimoto T. Meiosis-specific cell cycle regulation in maturing Xenopus oocytes［J］. J Cell Sci, 1994, 107：3005-3013.

［7］Endow SA. Microtubule motors in spindle and chromosome motility［J］. Eur J Biochem, 1999, 262：12-18.

［8］Wittmann T, Hyman A, Desai A. The spindle：a dynamic assembly of microtubules and motors［J］. Nat Cell Biol, 2001, 3：E28-34.

［9］Peter M, Labbe JC, Doree M, et al. A new role for Mos in Xenopus oocyte maturation：targeting Myt1 independently of MAPK［J］. Development, 2002, 129：2129-2139.

［10］Tavosanis G, Ll amazares S, Goulielmos G, et al. Essential role for gamma-tubulin in the acentriolar female meiotic spindle of Droso phila［J］. Embo J, 1997, 16：1809-1819.

［11］Barton NR, Goldstein LS. Going mobile：microtubule motors and chromosome segregation［J］. Pro c Natl Acad Sci USA, 1996, 93：1735-1742.

［12］Brunet S, Vernos I. Chromosome motors on the move. From motion to spindle checkpoint activity［J］. EMBO Rep, 2001, 2：669-673.

［13］Maro B, Howlett SK, Webb M. Non-spindle microtubule organizing centers in metaphase II-arrested mouse oo cytes［J］. J Cell Biol, 1985, 101：1665-1672.

［14］Schatten G, Simerly C, Schatten H. Microtubule configurations during ferti lization, mitosis, and early development in the mouse and the requirement for egg microtubule-mediated motility during mammalian fertilization［J］. Proc Natl Acad Sci USA, 1985, 82：4152-4156.

［15］Brunet S, Maria AS, Guillaud P, et al. Kinetochore f ibers are not involved in the formation of the first meiotic spindle in mouse oocytes, but control the exit from the first meiotic M phase［J］. J Cell Biol, 1999, 146：1-12.

［16］Combelles CM, Albertini DF. Microtubule patterning during meiotic maturation in mouse oocytes is determined by cel l cycle-specific sorting and redistribution of gamma-tubulin［J］. Dev Biol, 2001, 239：281-294.

［17］Sanfins A, Lee GY, Plancha CE, et al. Distinctions in meiotic spindle struc ture and assembly during in vitro and in vivo maturation of mouse oocytes［J］. Biol Reprod, 2003, 69：2059-2067.

［18］Kim NH, Funahashi H, P rather RS, et al. Microtubule and microfilament dynamics in porcine oocytes during meioticmaturation［J］. Mol Reprod Dev, 1996, 43：248-255.

［19］Lee J, Miyano T, Moor RM. Spindle formation and dynamics of gamma-tubulin and nuclear mitotic apparatus protein distribution during meiosis in pig and mouse oocytes［J］. Biol Reprod, 2000, 62：1184-1192.

［20］Wang WH, Abeydeera LR, Prather RS, et al. Polymerization of nonfilamentous actin into microfilaments is an important process for porcine oocyte maturation and early embryo development［J］. Biol Reprod, 2 000, 62：1177-1183.

［21］Sun QY, Lai L, Park KW, et al. Dynamic events are differently mediated by microfilaments, microtubules, and mitogen-activated protein kinase during porcine oocyte maturation and fertilization in vitro［J］. Biol Reprod, 2001, 64：879-889.

［22］Tremoleda JL, Schoevers EJ, Stout TA, et al. Organisation of the cytoskeleton during in vitro maturation of horse oocytes［J］. Mol Reprod Dev, 2001, 60：260-269.

［23］Tremoleda J L, Stout TA, Lagutina I, et al. Effects of in vitro production on horse embryo morphology, cytoskeletal characteristics, and blastocyst capsule formation［J］. Biol Reprod, 2003, 69：1895-1906.

［24］Kim NH, Cho SK, Choi SH, et al. The distribution and requirements of microtubules and microfilaments in bovine oocytes during in vitro maturation［J］. Zygote, 2000, 8：25-32.

［25］Li GP, Liu Y, Bunch TD, et al. Asymmetric division of spindle microtubules and microfilaments during bovine meiosis from metaphase I to metaphase III［J］. Mol Reprod Dev, 2005, 71：220-226.

［26］Simerly C, Navara C, Wu G, et al. Cytoskeletal organization and dynamics in mammalian oocytes during maturation and fertilization［M］// Grudzinskas J, Yovich J, editors. Gametes-The oocyte. Cambridge：Cambridge University Pres s, 1995：54-94.

［27］Long CR, Pinto-Correia C, Duby RT, et al. Chromatin and microtubule morphology during the first cell cycle in bovine zygotes［J］. Mol Reprod Dev, 1993, 36：23-32.

［28］Navara CS, First NL, Schatten G. Microtubule organizat ion in the cow during fertilization, polyspermy, parthenogenesis, and nuclear transfer：the role of the sperm aster［J］. Dev Biol, 1994, 162：29-40.

［29］Saunders KM, Parks JE. Effects of cryopreservation procedures on the cytology and fertilization rate of in vitro-matured bovine oocytes［J］. Biol Reprod, 1999, 61：178-187.

［30］Zhu ZY, Chen DY, Li JS, et al. Rotation of m eiotic spindle is controlled by microfilaments in mouse oocytes［J］. Biol Reprod, 2003, 68：943-946.

［31］Longo FJ, Chen DY. Development of cortical polarity in mouse eggs：involve ment of the meiotic apparatus［J］. Dev Biol, 1985, 107：382-394.

［32］Ryabova LV, Betina MI, Vassetzky SG. Influence of cytochalasin B on oocyte maturation in Xenopus laevis［J］. Cell Differ, 198 6, 19：89-96.

［33］Grill SW, Gonczy P, Stelzer EH, et al. Polarity controls forces governing asymmetric spindle positioning in the Caenorhabditis elegans embryo［J］. Nature, 2001, 409：630-633.

［34］Grill SW, Howard J, Schaffer E, et al. The distr ibution of active force generators controls mitotic spindle position［J］. Science, 2003, 301：518-521.

［35］Albertini DF. Cytoplasmic reorganization during the resumpti on of meiosis in cultured preovulatory rat oocytes［J］. Dev Biol, 1987, 120：121-131.

［36］Messinger SM, Albertini DF. Centrosome and microtubule dynamics during meiotic progression in the mouse oocyte［J］. J Cell Sci, 1991, 100：289-298.

［37］Scholey JM, Brust-Mascher I, Mogilner A. Cell division［J］. Nature, 2003, 422：746-752.

（責任編輯 馬鑫）

Dynamic Changes of Sheep Oocyte Meiosis from Metaphase I to Metaphase III Matured in vitro

LI Xin-xin BAI Chun-ling WEI Zhu-ying LI Guang-peng
（The Key Laboratory of National Education Ministry for Mammalian Reproductive Biology and Biotechnology，Inner Mongolia University，Hohhot 010021）

Meiosis is a division mode in diploid organism to produce haploid gametes，which is the special mechanism of ensuring the chromosome’s number of a species after fertilization to be constant. The key step in the meiotic division is to separate the homologous chromosome and sister chromatids correctly，the dynamic changes of the cytoskeleton，in particular microtubules（MTs）and microfilaments（MFs），play critical roles in this process. In this study，the dynamic changes of chromosomes and spindle MTs and MFs during the maturing and parthenogenetic activation of sheep oocyte cells were studied by immunohistochemistry method. The results showed that：1）The morphology of spindle changed from barrel-shaped at metaphase stage to cylinder-shaped at early anaphase，and then to long，thin coneshaped at late anaphase and telophase. Chromatin connected with the floor of the cone became the polar bodies and expelled. 2）Chromosome morphology changed from visible individual at metaphase to condensed chromatin during anaphase and telophase stages，and then backed to visible individual chromosomes at the next metaphase. 3）The size of MI spindle was larger than that of the MII spindle and MIII. MII spindle，however，was more barrel-shaped than the MI spindle. 4）Almost all of the MTs and MFs composing the spindles were partitioned into the polar bodies.

meiosis；microtubule；microfilament；spindle；oocyte；sheep

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.05.030

2015-07-22

國家重點基礎研究發展計劃（2012CB722306），內蒙古科技項目（20130902，20110401）

李欣欣，女，博士，研究方向：哺乳動物生殖生物學；E-mail：xinxin_816@126.com

白春玲，女，博士，研究方向：哺乳動物生殖生物學；E-mail：chunling1980_0@163.com