磷脂酰肌醇蛋白聚糖3真核表達載體的構建及在細胞中的表達

程華方向東崔碩吳萌張昭軍李澤夏

（1.河北省科學院生物研究所，石家莊 050081；2.中國科學院北京基因組研究所，北京 100101）

磷脂酰肌醇蛋白聚糖3真核表達載體的構建及在細胞中的表達

程華1方向東2崔碩1吳萌1張昭軍2李澤夏2

（1.河北省科學院生物研究所，石家莊 050081；2.中國科學院北京基因組研究所，北京 100101）

構建載體表達人磷脂酰肌醇蛋白聚糖3（Glypican-3，GPC3）蛋白，用以獲得抗GPC3單克隆抗體。用PCR技術擴增GPC3基因，利用酶切位點將該序列插入p3XFLAG-CMV-14載體，構建pCMV-gpc3表達載體。通過脂質體將該載體轉染至HEK293細胞中，利用Western blot技術檢測最終結果。收集穩定表達的細胞，破碎，通過親和層析柱，獲得純度較高的GPC3蛋白。成功構建pCMV-gpc3真核表達載體，轉染至HEK293細胞后，經G418篩選獲得穩定表達的單克隆細胞系；Western blot分析結果表明目的蛋白高效表達。

磷脂酰肌醇蛋白聚糖3；真核表達；脂質體轉染；親和純化

磷脂酰肌醇蛋白聚糖是硫酸乙酰肝素糖蛋白中的一個家族，參與調控個體發育、細胞增殖和分化等過程［1-3］。有研究表明，Glypican-3與多種腫瘤的發生發展關系密切，特別是在肝細胞癌中特異性高表達，是一種潛在的肝癌血清學和組織學重要診斷標志物［4-12］。另外，近期的研究表明GPC3不但能夠用于肝癌的診斷，而且具有抑制肝癌細胞系生長的功能［13］，該發現為肝癌的特異性治療提供了新的思路。

本研究利用真核表達載體和脂質體轉染技術，獲得了穩定表達Glypican-3的單克隆細胞系。通過大量培養、細胞破碎和親和純化，獲得了一定數量的GPC3蛋白，為進一步研究GPC3的分子生物學特性和功能奠定了良好的基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞、菌株與質粒 含GPC3基因的質粒由德國洪堡大學病理學研究所Lage博士惠贈；克隆菌株E.coli DH5α購自北京全式金生物技術有限公司；克隆載體pMD18-T購自寶生物公司；人胚胎腎細胞HEK293購自國家實驗細胞共享平臺；表達載體p3XFLAG-CMV-14購自Sigma公司。

1.1.2 主要試劑 限制性內切酶EcoRΙ和BamHΙ、T4連接酶、Pfu DNA聚合酶均購自New England Biolabs公司；DNA分子質量標準和凝膠回收試劑盒購自QIAGEN公司；蛋白質分子量標準購自美國熱電公司；LipofectamineTM2000轉染試劑購自美國Life公司；ANTI-FLAG? M1 Agarose Affinity Gel及ANTIFLAG抗體購自Sigma公司；兔抗人GPC3蛋白和兔抗人β-actin抗體購自美國ABcom公司；辣根過氧化物酶（HRP）標記羊抗鼠IgG抗體購自北京華美公司；細胞培養板、DMEM培養基，胎牛血清，均購自美國GIBCO公司。

1.2 方法

1.2.1 目的基因的克隆 根據GPC3的基因閱讀框序列設計擴增引物，上游引物：5'-CGGAATTCCTTGGTGGTGGCGATGCT-3'（下劃線部分為EcoR Ι酶切位點）；下游引物：5'-CGGGATCCCCCGAGGTTGTGAAAGGT-3'（下劃線部分為BamH Ι酶切位點）。使用上述引物，以含GPC3基因的質粒為模板進行PCR擴增。PCR擴增條件：95℃預變性5 min；95℃變性60 s，60℃退火60 s，72℃延伸2 min，共35個循環；72℃延伸15 min。將PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.2 重組質粒pMD18-gpc3的構建及鑒定 將PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳后切膠回收，連入pMD18-T載體，產物用T4連接酶在16℃水浴中連接。將連接產物轉化至E.coli DH5α菌株，篩選陽性克隆，獲得重組表達質粒pMD18-gpc3。

1.2.3 重組質粒pCMV-gpc3的構建及鑒定 將質粒pMD18-gpc3和質粒p3XFLAG-CMV-14分別用EcoR Ι和BamH Ι雙酶切，產物經瓊脂糖凝膠電泳后切膠回收。取含有酶切位點的目的基因和經雙酶切的p3XFLAG-CMV-14用T4連接酶在16℃水浴中連接。將連接產物轉化至E.coli DH5α菌株，篩選陽性克隆，獲得重組表達質粒pCMV-gpc3。

1.2.4 HEK293細胞的培養 HEK293細胞培養于37℃、5% CO2培養箱中，培養基為含10%胎牛血清的DMEM高糖培養基。待細胞密度達到90%時，用0.05%胰蛋白酶進行消化傳代，傳代比例為1∶3。

1.2.5 重組質粒轉染 將狀態良好的HEK293細胞以5×105個/孔的密度接種于6孔板中，繼續培養，待細胞密度達到80%-90%時進行轉染。用PBS沖洗3次，加入無血清DMEM高糖培養基。按照LipofectamineTM2000轉染試劑說明書進行，轉染時設立陰性組（p3XFLAG-CMV-14）和陽性組（pCMV-gpc3質粒）。細胞轉染48 h后用含有0.5 mg/L G418、10%胎牛血清的DMEM高糖培養基加壓篩選，采用有限稀釋法原理將細胞轉至96孔板，每孔1-2個細胞。待96孔板內細胞增殖成團后，傳至細胞培養瓶繼續培養，最終得到穩定表達重組蛋白的單克隆細胞株pCMV-gpc3/293和陰性對照組pCMV-gpc3/NC。

1.2.6 Western blot檢測轉染后GPC3蛋白表達水平 待穩定表達重組蛋白的細胞株和HEK293細胞生長至密度約90%時，收集細胞，裂解細胞提取細胞總蛋白，提取方法按照試劑盒說明書進行。BCA法測定蛋白濃度后，取適量蛋白進行SDS-PAGE電泳，參照文獻［14］的方法進行。

電泳結束后以恒壓90 V，利用半干轉移設備將蛋白轉移至PVDF膜上；將轉好的膜浸入封閉液（含5%（M/V）脫脂奶粉的TBST中，室溫輕搖封閉2 h；以購買的兔抗人GPC3蛋白抗體、兔抗人β-actin和ANTI-FLAG抗體為一抗，用封閉液按1∶1 000稀釋，室溫輕搖孵育2 h；TBST洗膜4次，每次孵育10 min；以HRP標記的羊抗兔IgG為二抗，用封閉液按1∶10 000稀釋，室溫輕搖孵育1 h；TBST洗膜4次，每次孵育10 min；ECL發光顯色系統顯色。

1.2.7 重組蛋白的分離純化及驗證 大量培養篩選到的單克隆細胞，參照文獻［14］的方法對細胞進行破碎，低溫離心取上清液按照ANTI-FLAG? M1 Agarose Affinity Gel試劑盒說明書進行純化。采用超濾的方法濃縮重組蛋白，取適量蛋白進行SDSPAGE電泳，Western blot檢測重組蛋白。

2 結果

2.1 GPC3基因的擴增

用PCR方法進行擴增。擴增產物經1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，其中以無菌水為模板的陰性對照組沒有出現擴增條帶，而以含GPC3基因的質粒為模板，擴增到了一條長1 650 bp的片段，結果（圖1）與預期大小相一致。

圖1 GPC3基因PCR擴增結果

2.2 重組質粒的構建與鑒定

構建的重組質粒pMD18-gpc3和表達質粒pCMV-gpc3進行EcoR Ι和BamH Ι雙酶切，產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果（圖2）與預期大小相一致。質粒pCMV-gpc3經測序鑒定，測序結果表明插入片段與GenBank中公布的全序列中該片段完全一致，且以正確的方向插入到表達載體的克隆位點，真核表達載體質粒pCMV-gpc3構建成功。

圖2 重組質粒酶切鑒定結果

2.3 Western blot檢測GPC3蛋白表達水平

以購買商業化兔抗GPC3多抗、兔抗人β-actin多抗和ANTI-FLAG抗體為一抗，進行Western blot分析鑒定，結果見圖3。在陽性細胞株pCMV-gpc3/293的總蛋白提取液中，無論是用兔抗GPC3多抗還是兔抗FLAG多抗，結果中都可以看到在65 kD左右的位置上有帶，而陰性細胞株pCMV-gpc3/ NC總蛋白則沒有任何顯色帶出現，表明陽性細胞株pCMV-gpc3/293成功表達出GPC3蛋白。同時作為參照，陽性細胞株和陰性細胞株的β-actin蛋白表達基本一致。

圖3 GPC3蛋白表達Western blot分析

2.4 重組蛋白的表達和純化

將經過純化及濃縮的重組蛋白及細胞破碎產物進行SDS-PAGE電泳，結果見圖4。由于真核細胞表達外源蛋白的水平較低，為了獲得一定量的重組蛋白，本研究大量培養細胞，從1014個細胞中提取純化到0.1 mg重組蛋白，鑒于得率太低，研究組計劃優化培養條件，以獲得更高的得率和重組蛋白。從圖4中可以看出，經過純化及濃縮后，得到了一個分子量約為65 kD的蛋白條帶，與Western blot檢測一致（圖5）。

3 討論

目前，我國惡性腫瘤已經排在居民主要疾病死亡率的首位，成為影響人們健康的頭號殺手。統計數據表明2010年全國惡性腫瘤發病率為235.23/10萬。其中，肝癌（特別是原發性肝細胞癌）的死亡率僅次于胃癌，已經成為我國的第二大癌癥［15］。發現并確定新的肝癌早期診斷、治療靶點具有重要的科學意義和臨床價值［16，17］。最近，磷脂酰肌醇蛋白聚糖3作為一種新的肝癌腫瘤標志物被國內外研究人員提出。研究人員發現GPC3在多個腫瘤組織中特異表達，特別是在肝癌中的特異性高表達，使我們看到了其成為繼AFP后又一個肝癌腫瘤標志物的前景。

圖4 純化后GPC3蛋白SDS-PAGE電泳分析

圖5 純化后GPC3蛋白Western blot分析

Shirakawa等［18］利用免疫組化的方法對3種原發性肝癌（hepatocellular carcinoma HCC，intrahepatic cholangiocarcinoma ICC，combined hepatocellular and cholangiocarcinoma CHC）組織中的GPC3蛋白表達情況進行了分析，發現ICC病例組織中不表達GPC3蛋白，CHC病例中部分表達GPC3蛋白，而在HCC病例組織中大量表達78.3%（36/46），所以作者最終得出GPC3蛋白對于HCC具有特異性的結論。付順軍等［19］利用酶聯免疫和化學發光的方法，對健康者、肝硬化患者和肝癌確診病例血清中的GPC3和AFP含量進行了測定，發現健康者和肝硬化患者血清中的GPC3濃度無統計學差異。而肝癌患者血清中的GPC3濃度與健康者和肝硬化患者血清有顯著的差異，表明GPC3對肝癌有較高的敏感性和特異性。當GPC3以3 μg/L，AFP以20 μg/L為診斷界限時，GPC3的敏感性要高于AFP。Akutsu等［20］利用商品化的ELISA試劑盒檢測血清中的GPC3含量，發現健康者和乙肝患者的含量均低于閾值，HCC患者中有50%（32/64）的含量高于閾值，HCC的平均含量明顯高于非HCC。

為了探究GPC3與肝癌的關系，獲得具有自主知識產品的抗GPC3抗體，進而開發肝癌早期診斷方法，本研究成功構建了真核表達載體pCMV-gpc3。經過脂質體轉染，得到能夠穩定表達GPC3的細胞株。最終通過高效表達、提取和純化等過程獲得了一定量純度較好的重組GPC3蛋白。選用真核表達載體p3XFLAG-CMV-14及HEK293細胞宿主是因為GPC3是一個糖蛋白，只有在真核細胞中進行表達，才能夠最接近于其天然的狀態。目前，已經有多個研究小組利用HEK293細胞無基礎性表達GPC3的特性進行GPC3的相關研究［21，22］，同時p3XFLAG-CMV系統是一種高效的真核表達系統，該系統具有高效的強啟動子CMV啟動子，有利于目的蛋白的高效表達。并且表達的蛋白中含FLAG標簽，利用FLAG親和純化層析柱，能夠對表達產物進行純化，且純度非常高，有利于后續實驗的進行。

4 結論

本研究成功構建了真核表達載體pCMV-gpc3。經過脂質體轉染，得到能夠穩定表達GPC3的細胞株。最終通過高效表達、提取和純化等過程獲得了一定量純度較好的重組GPC3蛋白。

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（責任編輯 李楠）

Construction of Eukaryotic Expression Vector for Glypican-3 and Its Expression in Cell

CHENG Hua1FANG Xiang-dong2CUI Shuo1WU Meng1ZHANG Zhao-jun2LI Ze-xia2
（1. Institute of Biology，Hebei Academy of Sciences，Shijiazhuang 050081；2. Beijing Institute of Genomics，Chinese Academy of Sciences，Beijing 100101）

This work aims to construct the eukaryotic expression vector of glypican-3（GPC3）for acquiring anti-GPC3 monoclonal antibody. The GPC3 gene was amplified by PCR and was cloned into an expression vector p3XFLAG-CMV-14，and the expression vector pCMV-gpc3 was constructed. HEK293 cells were transfected with the vector by liposome，and the final results were detected by Western blot. The stably-expressed cells were collected and ground，and the high-purity GPC3 protein was obtained by affinity column. The eukaryotic expression vector of pCMV-gpc3 was constructed successfully. After the transfection to HEK293 cells，the monoclonal cell line of stablyexpressed was gained by G418 screening. Western blot analysis revealed that the target protein expressed markedly. A large number of GPC3 proteins were obtained via genetic engineering and purifying technology，which laid a foundation for the biological function and application of the protein as well as the preparation of monoclonal antibody.

glypican-3；eukaryotic expression；liposome transfection；affinity purification

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.05.019

2015-07-28

河北省科學院高層次人才資助項目（20150503LR62-9），河北省科學院科技計劃項目（13335）

程華，男，副研究員，研究方向：腫瘤早期診斷及相關機理；E-mail：cheng_hua@sina.com