聚已內酯表面磷酸膽堿仿生改性的血液相容性研究*

何　瀏，馬宇皓，黃　磊，張松柏，陳元維，羅祥林,2

(1.四川大學 高分子科學與工程學院，成都 610065；2.四川大學 高分子材料工程國家重點實驗室，成都 610065)

?

聚已內酯表面磷酸膽堿仿生改性的血液相容性研究*

何瀏1，馬宇皓1，黃磊1，張松柏1，陳元維1，羅祥林1,2

(1.四川大學 高分子科學與工程學院，成都 610065；2.四川大學 高分子材料工程國家重點實驗室，成都 610065)

摘要：通過表面原子轉移自由基聚合法(SI-ATRP)得到具有不同接枝密度的聚2-甲基丙烯酰氧乙基磷酰膽堿改性的聚己內酯薄片(PCL-g-PMPC)。用衰減全反射紅外、掃描電鏡及接觸角直接或間接地證明表面接枝反應成功；并通過蛋白吸附、血小板粘附及凝血時間對其血液相容性進行了評價。結果表明，利用SI-ATRP法在PCL表面接枝一層具有仿細胞外層膜結構的PMPC能不同程度地提高PCL薄片的血液相容性。

關鍵詞：聚己內酯；表面原子轉移自由基聚合；磷酰膽堿；血液相容性

0引言

血液相容性表面在植入生物材料和組織工程支架等方面受到廣泛的關注[1]。材料表面是最開始接觸血液、組織器官的部分[2]，因此，提高材料表面的血液相容性是生物材料學領域的重要課題[3]。聚己內酯(PCL)有良好的熱塑性、生物相容性及緩慢的降解速率，已經應用于生物醫學工程的各個方面[4-6]。然而，PCL的一些性質如疏水性較強、缺乏可進一步修飾的基團，限制了它的廣泛應用。表面改性是改善材料性能的有效方法之一[7]，例如，將PEG接枝到多孔PCL膜表面可以提高防污性能[8]。磷酰膽堿基團(PC)是細胞膜基本單元卵磷脂的親水端基，材料表面接枝含有PC的分子是獲得與細胞膜表面化學組成、形貌相似的途徑之一[9]。近年來的研究表明，用PC基團及其共聚物修飾的表面可顯著提高材料的血液相容性[10-11]。本文通過表面原子轉移自由基聚合法(SI-ATRP)在PCL膜表面接枝含有仿生結構PC的2-甲基丙烯酰氧乙基磷酰膽堿(MPC)，用衰減全反射紅外、掃描電鏡和水接觸角對表面基團、表面形貌及親疏水性進行了表征；并通過蛋白吸附、血小板粘附、凝血時間對膜的血液相容性進行了評價。

1實驗

1.1主要試劑與儀器

聚己內酯(PCL, Mw=80 000)，易生有限公司；ε-己內酯，美國Sigma；2-溴-異丁酰溴，Sigma；雙季戊四醇，Aldrich；2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸膽堿(MPC)；甲醇(AR)，成都科龍試劑有限公司；1,4-二氧六環(AR)，成都科龍試劑有限公司；MicroBCA試劑盒，賽默飛世爾科技有限公司。

衰減全反射紅外光譜：ATR-FT-IR，Nicolet公司，型號Magna560；視頻光學接觸測量儀：DSA100，德國KRUSS；掃描電子顯微鏡：FEI/荷蘭，型號InspectF；自動化凝血分析儀：CA-50，日本Sysmex公司。

1.2PCL膜片制備及ATRP引發劑的固定

采用熱壓成型的方法制備10cm×10cm的PCL膜片。將PCL片裁剪為1cm×1cm大小，用乙醇和水的混合溶劑(1/1，體積比)超聲清洗3遍，真空干燥備用。星型PCL(4sPCL20和4sPCL75)與大分子引發劑4sPCL20-Br的合成參照文獻[12]所述的方法進行。以1,4-二氧六環為溶劑配置濃度為50mg/mL的聚合物溶液(控制4sPCL20/4sPCL75的質量比為10%,30%和50%)，取30μL滴加在PCL片上，待溶劑自然揮發干后用于表面引發反應。

1.3SI-ATRP法引發MPC

在特制的反應器中，稱取MPC單體1.2g(4.06μmol)，CuSO4·5H2O和D-異抗壞血酸鈉各0.051g(0.203μmol)、0.0487g(0.244μmol)，抽真空、通氮氣循環3次后在氮氣的保護下加入水和甲醇的混合溶劑(1/4, 體積比)15mL和55μL的Me6TREN配體，通氮氣鼓泡30min后，放入涂覆有不同含量引發劑的PCL片，最后加入D-異抗壞血酸鈉水溶液1mL，控制反應在25 ℃下反應24h。反應結束后用甲醇和水的混合溶液多次清洗膜片，真空干燥。將最終反應得到的薄片記為PCL；PCL1-g-PMPC[4sPCL20/4sPCL75=1∶9(質量比)]；PCL2-g-PMPC[4sPCL20/4sPCL75=3∶7]；PCL3-g-PMPC[4sPCL20/4sPCL75=1∶1]。整個反應中控制投料摩爾比為n[MPC]∶n[CuSO4·5H2O]∶n[D-異抗壞血酸鈉]∶n[Me6TREN]=20∶1∶1.2∶1，單體濃度為0.07mg/mL。

1.4改性前后膜表面蛋白吸附

將反應得到的薄片放入24孔板中，用0.1mol/L的磷酸鹽緩沖液(PBS,pH值=7.4)浸泡平衡過夜，吸去PBS；之后每孔加入1mL濃度為 1mg/mL的牛血清白蛋白(BSA)的磷酸緩沖液，37 ℃恒溫水浴培養2h，之后用濃度為0.1%(質量分數)的SDS溶液將緊密結合在PCL片上的蛋白洗下，精確移取相同體積的SDS蛋白溶液于96孔板中，加入適量體積的BCA工作液，37 ℃顯色2h后用酶標儀測定其562nm處的吸光度，根據標準曲線求出膜上的蛋白吸附量。每個樣品測4個平行樣取平均值。

1.5改性前后PCL膜片的血液相容性

1.5.1血小板粘附

用裝有檸檬酸鈉的真空采血管收集新鮮的兔血(檸檬酸鈉與血的比例為1∶9)，于1 500r/min的速度下離心15min，取上層清液即為富血小板血漿(PRP)。取25μLPRP滴加到經過PBS平衡浸漬的PCL薄片上，37 ℃培養2h，吸棄PRP，用PBS溶液清洗薄片3次，2.5%(質量分數)的戊二醛溶液4 ℃固定過夜。吸出固定液，PBS漂洗3次，經30%，50%，70%，80%，90%，95%和100%的乙醇水溶液梯度脫水，自然風干，噴金后掃描電鏡觀察血小板粘附情況。

1.5.2凝血時間(APTT和TT)

用裝有檸檬酸鈉的真空采血管收集新鮮的人血(檸檬酸鈉與血的比例為1∶9)，于4 000r/min下離心15min，取上清液即為貧血小板血漿(PPP)。將0.5cm×0.5cm的樣品放于含有PBS的48孔板中平衡過夜，吸棄PBS，每孔加入100μL新鮮的PPP，37 ℃培養30min后，取50μL的PPP于測試杯中，隨后加入50μL的APTT試劑，37 ℃孵育3min后加入50μL濃度為0.025mol/L的CaCl2溶液，測試APTT。對于TT測試，加入100μL的PP試劑于50μL的經過與材料共孵育的PPP中，測試TT值。

2結果與討論

2.1改性前后膜衰減全反射紅外光譜分析

利用衰減全反射紅外光譜儀(ATR-FT-IR)對改性前后的PCL膜表面進行分析，結果如圖1所示。

醫院發展因面臨形勢、政策、自身所處階段和員工的需求而出現變化。秦環龍表示，首先，根據申康中心“轉方式、調結構、轉機制”的要求，他提出五個轉型，但這個五個轉型是有前提、有基礎的，就是學科的基本實力、醫院軟硬件的程度、內部運行管理水平等條件成熟，轉型方可開始?！叭绻A很差，就轉型不過去；如果拖延，就耽誤時機。就是要恰到好處、恰逢其時才能順利轉型發展?！逼浯?，“申康績效考核就像是一個指揮棒，讓院長有抓手，進而推動醫院的建設和發展，績效考核的主要內涵，落地的就是我們五個轉型的內容?！痹俅?，醫院自身由原來的粗獷型發展逐步轉向內涵建設發展需求。

圖1　PCL膜改性前后的ATR-FT-IR光譜圖Fig1ATR-FT-IRspectraofpristinePCL,PCL1-g-PMPC,PCL2-g-PMPCandPCL3-g-PMPCmembrane

2.2掃描電子顯微鏡表征膜形貌

圖2為PCL膜改性前后的SEM圖。

圖2　PCL膜改性前后的SEM圖

Fig2SEMimagesofthesurfaceofthepristinePCLandMPCpolymer-graftedmembranesafterSI-ATRP,PCL1-g-PMPC,PCL2-g-PMPC,PCL3-g-PMPC

用掃描電子顯微鏡(SEM)觀察改性前后膜表面形貌，可以看到，未改性的PCL膜與接枝了PMPC的膜形貌差異較大。圖2(a)顯示，未改性的PCL膜片表面有球晶結構，這是因為PCL玻璃化轉變溫度低并具有一定的結晶能力[15]造成的。表面接枝PMPC后形貌發生了變化(圖2(b)-(d))，PCL1-g-PMPC膜表面不再有球晶結構; 隨著表面引發劑含量的增加，PCL2-g-PMPC和PCL3-g-PMPC表面變得粗糙不平。表面形貌的變化，間接證明了表面接枝反應成功。

2.3改性前后膜的親水性

靜態水接觸角及動態水接觸角是反映材料表面與水接觸時的可潤濕性的重要指標，水接觸角受到膜表面親/疏水性、粗糙度、孔隙率、孔徑大小及分布等因素的影響[7]。從圖3(a)中可以看出，靜態接觸角、前進角和后退角經PMPC改性后都比改性前降低(20～30°)，表明改性后表面親水性增加[16]；同時滯后角明顯增加，說明改性后表面粗糙度增加，這與SEM觀察到的結果一致。從接觸角隨時間變化(圖3(b))可以看出，改性膜的接觸角隨時間呈現直線下降趨勢，而純PCL膜接觸角降低到一定程度后出現平臺，表明PMPC鏈段隨著時間的推移會遷移到表面，間接證明PMPC成功接枝到了PCL膜表面。

圖3PCL膜改性前后的動態接觸角及接觸角隨時間的變化

Fig3DynamicwatercontactanglesandcontactanglesvaryingwithtimeofpristineandPMPC-graftedPCLmembranes

2.4改性前后膜的蛋白吸附

研究表明，含PC基團的表面能強烈吸附血液中的磷脂分子，形成類似生物體表面的磷脂層，從而減弱蛋白質與材料表面的相互作用[17]。在本研究中，以BSA為模型蛋白考察膜表面蛋白的吸附情況。從圖4中可以看出，表面接枝PMPC后能降低蛋白吸附；同時，涂覆有不同含量引發劑的薄片在接枝后表現出不同程度的抗蛋白吸附能力，其中PCL2-g-PMPC的抗蛋白吸附能力最佳，為0.065μg/cm2。MPC接枝后蛋白吸附能力降低可能是由于SI-ATRP法能獲得高接枝率的PMPC[18]，表面密集堆積的PC基團吸引水分子而在表面形成了強烈的水合層，該水合層能減弱蛋白與表面的相互作用，最終使得膜呈現出低的蛋白吸附性能[19]。然而3種涂覆比例引發得到的膜呈現出不同的蛋白吸附量可能是由膜表面形貌的不同所導致的，因為蛋白吸附不僅受表面化學組成的影響，還與表面形貌、拓撲結構等有關[20]。

圖4　BSA蛋白在膜表面吸附

Fig4BSAproteinabsorptionsbythemodifiedmembranes

2.5改性前后膜的血液相容性

2.5.1血小板粘附

對比考察改性前后的PCL膜片粘附血小板的情況(圖5)可以看出，未經PMPC改性的PCL表面有大量的血小板粘附，且被嚴重激活；而經過PMPC改性的PCL1-g-PMPC雖然血小板粘附較多，但激活程度很輕；PCL2-g-PMPC表面血小板吸附量最少，且血小板基本上未被激活；PCL3-g-PMPC膜表面吸附大量的血小板，且被嚴重激活。上述結果表明，MPC改性可提高PCL的抗血小板粘附性能，然而需要有合適的MPC接枝密度，密度過大或過小均不利。表面涂覆引發劑含量為30%而引發得到的PCL2-g-PMPC膜片抗血小板粘附效果最好，這與蛋白吸附的結果相吻合。

2.5.2凝血時間測試

活化部分凝血活酶時間(APTT)及凝血酶時間(TT)一直被廣泛應用于監測血液成分的變化和篩選抗凝血藥物，近來也用于評價生物材料在體內的抗凝血性能。圖6給出了PCL表面改性前后凝血時間的變化。從圖中可以看出，表面經PMPC改性后，APTT和TT有不同程度的增加。也就是說，PMPC改性延緩了內源性凝血系統的激活過程，進一步提高了PCL膜片的抗凝血性。

圖5　改性前后膜片表面血小板粘附掃描電鏡圖

圖6PCL表面改性前后活化部分凝血活酶時間(APTTs)及凝血酶時間(TTs)

Fig6Activatedpartialthromboplastintimes(APTTs)andthrombintimes(TTs)forthepristinePCLandmodifiedmembranes

3結論

利用SI-ATRP法獲得了具有不同接枝密度的仿生改性的PCL-g-PMPC。ATR-FT-IR、掃描電鏡及水接觸角證明PMPC成功接枝到PCL表面。BSA蛋白吸附、血小板粘附及APTT測試結果表明PMPC的引入能在一定程度上提高PCL膜的血液相容性，其中表面涂覆引發劑比例為30%的改性膜(PCL2-g-PMPC)的抗凝血性能最好。

參考文獻:

[1]RatnerBD.Thecatastropherevisited:bloodcompatibilityinthe21stcentury[J].Biomaterials, 2007,28(34):5144-5147.

[2]JiangH,WangXB,LiCY,etal.Improvementofhemocompatibilityofpolycaprolactonefilmsurfaceswithzwitterionicpolymerbrushes[J].Langmuir, 2011,27(18):11575-11581.

[3]YvetteBJ,AldenhoffRBTL.Photo-immobilizationofdipyridamole(persantin)atthesurfaceofpolyurethanebiomaterials:reductionofinvitrothrombogenicity[J].Biomaterials, 1997,18(2):167-172.

[4]WoodruffMA,HutmacherDW.Thereturnofaforgottenpolymer-polycaprolactoneinthe21stcentury[J].ProgressinPolymerScience, 2010,35(10):1217-1256.

[5]DashTK,KonkimallaVB.Poly-ε-caprolactonebasedformulationsfordrugdeliveryandtissueengineering:areview[J].JournalofControlledRelease, 2012,158(1):15-33.

[6]LuoMiao,FengTingting,CaiMengtan,etal.Synthesisandmicellizationofpoly(ε-caprolactone)-b-poly(ethyleneglycol)-b-poly(2-hdroxyethylmethacrylate)triblockpolymers[J].JournalofFunctionalMaterials,2014,45(5):5027-5036.

羅淼, 馮婷婷, 蔡孟錟, 等. 兩親性聚己內酯-b-聚乙二醇-b-聚甲基丙烯酸(2-羥乙酯)三嵌段共聚物的合成及成膠束化研究[J]. 功能材料, 2014,45(5):5027-5036.

[7]RanaD,MatsuuraT.Surfacemodificationsforantifoulingmembranes[J].ChemicalReviews, 2010,110(4):2448-2471.

[8]ChiYenHHZF.Surfacemodificationofnanoporouspoly(ε-caprolactone)membranewithpoly(ethyleneglycol)topreventbiofouling:partⅠ.Effectsofplasmapowerandtreatmenttime[J].InternationalJournalofPolymericMaterials, 2010,59(11):923-942.

[9]YuHongfei.Researchofphosphorylchline(PC)bionicmodifiedmedicaldacronmaterialsandanticoagulantproperty[D].Chengdu:SouthwestJiaotongUniversity,2011.

俞洪飛. 醫用滌綸材料表面磷酸膽堿仿生改性及其抗凝血性能研究[D]. 成都: 西南交大, 2011.

[10]SchlenoffJB.Zwitteration:coatingsurfaceswithzwitterionicfunctionalitytoreducenonspecificadsorption[J].Langmuir, 2014,30(32):9625-9636.

[11]IshiharaYIAK.Cellmembrane-inspiredphospholipidpolymersfordevelopingmedicaldeviceswithexcellentbiointerfaces[J].ScienceandTechnologyofAdvancedMaterials, 2012,13:64101.

[12]ZhaiS,MaY,ChenY,etal.SynthesisofanamphiphilicblockcopolymercontainingzwitterionicsulfobetaineasanovelpH-sensitivedrugcarrier[J].PolymerChemistry, 2014,5(4):1285.

[13]TuS,ChenY,QiuY,etal.Enhancementofcellularuptakeandantitumorefficienciesofmicelleswithphosphorylcholine[J].MacromolecularBioscience, 2011,11(10):1416-1425.

[14]SaekiD,TanimotoT,MatsuyamaH.Anti-biofoulingofpolyamidereverseosmosismembranesusingphosphorylcholinepolymergraftedbysurface-initiatedatomtransferradicalpolymerization[J].Desalination, 2014,350:21-27.

[15]TingtingChenTCQJ.Designandfabricationoffunctionalpolycaprolactone[J].E-Polymers, 2015,15(1):3-13.

[16]GongMing,GuoPeipei,DaiWei,etal.Surfacemodificationofchitosanbyelectrostaticadsorptionwithpolyanionbearingphosphorylchlinegroups[J].JournalofFunctionalMaterials,2014,45(23)：:2028-23042

銘宮, 郭培培, 代 威, 等. 殼聚糖靜電吸附羧基磷酰膽堿聚合物的研究[J]. 功能材料, 2014,45(23):23028-23042.

[17]KazuhikoIshiharaHOYE.Hemocompatibilityofhumanwholebloodonpolymerswithaphospholipidpolargroupanditsmechanism[J].JournalofBiomedicalMaterialsResearch, 1992,26:1543-1552.

[18]AmirKhabibullinEMKM.Surface-initiatedatomtransferradicalpolymerization[M].Switzerland:SpringerInternationalPublishing, 2015.

[19]MaQ,ZhangH,ZhaoJ,etal.FabricationofcelloutermembranemimeticpolymerbrushonpolysulfonesurfaceviaRAFTtechnique[J].AppliedSurfaceScience, 2012,258(24):9711-9717.

[20]LiuL,LiW,LiuQ.Recentdevelopmentofantifoulingpolymers:structure,evaluation,andbiomedicalapplicationsinnano/micro-structures[J].WileyInterdiscipRevNanomedNanobiotechnol, 2014,6(6):599-614.

Hemocompatibilitystudiesofpolycaproactonesurfacegraftedwithbiomimetic(2-methacryloyloxyethylphosphorylcholine)

HELiu1,MAYuhao1,HUANGLei1,ZHANGSongbai1,CHENYuanwei1,LUOXianglin1,2

(1.CollegeofPolymerScienceandEngineering,SichuanUniversity,Chengdu610065,China;2.StateKeyLaboratoryofPolymerMaterialsandEngineering,SichuanUniversity,Chengdu610065,China)

Abstract:Biomimeticpoly(2-methacryloyloxyethylphosphorylcholine) (poly(MPC))brusheswithvariousdensityweregraftedtoPCLmembranesbysurface-initiatedatomtransferradicalpolymerization(SI-ATRP).Attenuatedtotalreflection-Fouriertransforminfrared(ATR-FT-IR),scanningelectronmicroscopyandwatercontactanglewereusedtocharacterizethemodifiedmembranes.ComparedwiththepristinePCLmembrane,thePMPC-graftedPCLmembranesshowedlowerproteinadsorptionandsuppressedplateletadhesioninsomedegree.Atthesametime,theactivatedpartialthromboplastintime(APTT)forthemodifiedmembraneswasslightlyincreased.TheseresultsindicatedthatthesurfacebiomimeticmodificationbygraftingPMPCbrushesrenderedthePCLmembraneswithgoodbloodcompatibility.

Keywords:poly(ε-caprolactone);surface-initiatedatomtransferradicalpolymerization;phosphorylcholine;hemocompatibility

文章編號：1001-9731(2016)06-06098-05

* 基金項目：國家自然科學基金資助項目(51473099， 51273125)

作者簡介：何瀏(1989-)，女，四川眉山人，在讀碩士，師承羅祥林教授、陳元維副教授，從事生物醫用高分子研究。

中圖分類號：R318.08

文獻標識碼：A

DOI:10.3969/j.issn.1001-9731.2016.06.017

收到初稿日期：2015-07-31 收到修改稿日期：2016-03-02 通訊作者：羅祥林，E-mail:luoxl_scu@126.com