乙型肝炎病毒PreS1Ag、抗HBc-IgM和HBV-DNA聯合監測相關性分析

劉勇波，陳燕如

(廣東省佛山市南海經濟開發區人民醫院：1.檢驗科；2.內科　528237)

·臨床研究·

乙型肝炎病毒PreS1Ag、抗HBc-IgM和HBV-DNA聯合監測相關性分析

劉勇波1，陳燕如2

(廣東省佛山市南海經濟開發區人民醫院：1.檢驗科；2.內科528237)

目的通過聯合檢測健康體檢者和乙型肝炎患者的乙型肝炎兩對半、HBV前S1抗原(PreS1Ag)、抗HBV核心抗體IgM(HBc-IgM)、HBV核酸定量(HBV-DNA)等各項指標，探討它們之間的相關性及臨床意義。方法采用時間分辨熒光免疫分析法(TRFIA)定量檢測“乙型肝炎兩對半”，PreS1Ag與抗HBc-IgM檢測均采用ELISA檢測，HBV-DNA采用實時熒光定量PCR方法檢測。結果乙型肝炎組中PreS1Ag、抗HBc-IgM、HBV-DNA的陽性率都明顯高于對照組的陽性率，差異有統計學意義(P<0.05)。在4種不同HBV感染模式組別中，抗PreS1Ag和HBc-IgM的陽性率差異均有統計學意義(χ2=9.469，P<0.05；χ2=9.922，P<0.05)，HBV-DNA的陽性率差異無統計學意義(χ2=5.848，P>0.05)。114例乙型肝炎患者中，PreS1Ag陽性90例，陽性率為78.9%，HBV-DNA陽性101例，陽性率為88.6%，符合率為89.1%(90/101)，兩者差異無統計學意義(χ2=0.451，P>0.05)，結果呈正相關(r=0.863)。結論PreS1Ag不僅與HBV-DNA檢出率高度符合，且是比HBeAg更敏感的判斷HBV感染和復制的重要指標，同時抗HBc-IgM與HBV的活動性復制呈正相關，抗HBc-IgM也是HBV在體內復制的重要指標，因此PreS1Ag、抗HBc-IgM以及HBV-DNA 聯合乙型肝炎“兩對半”對診斷乙型肝炎具有更好的臨床意義。

乙型肝炎；乙型肝炎病毒前S1抗原；乙型肝炎病毒核酸定量；抗乙型肝炎病毒核心抗體IgM

目前診斷乙型肝炎最常用的指標是HBV血清學標志物，即乙型肝炎兩對半檢測[1],而乙型肝炎兩對半只能反映人體對HBV的免疫反應狀態，不能直接反映HBV在患者體內的復制情況[2]。HBV前S1蛋白是HBV表面蛋白成分中與乙型肝炎表面抗原(HBsAg)氨基末端相連接的多肽，是HBV入侵肝細胞的主要結構成分，在病毒入侵肝細胞過程中起主要作用[3]。國外研究表明，HBV前S1抗原(PreS1Ag)與病毒復制關系密切[4]。因此，PreS1Ag作為HBV感染的標志物越來越被臨床重視?？笻BV核心抗體IgM(HBc-IgM)出現于HBV感染早期，也是慢性肝炎復發之前，故HBc-IgM陽性是HBV急性感染和復制活躍的指征[5]。因此，抗HBc-IgM的檢測在急性乙型肝炎發病機制中起著重要的作用，并可為這些肝病的臨床治療研究提供新的參考數據。HBV核酸定量(HBV-DNA)是直接反映HBV復制狀態及傳染性的最佳指標，同時也可用于判斷乙型肝炎感染的嚴重程度和傳染性，長期以來有不少專家學者認為HBV-DNA是診斷乙型肝炎，提示病毒復制的“金標準”[6-8]。本研究中收集114例乙型肝炎患者與51例健康患者血清，同時進行PreS1Ag、抗HBc-IgM和HBV-DNA的聯合檢測，探討乙型肝炎患者各項指標的相關性及臨床意義，為臨床診治乙型肝炎患者提供重要實驗室依據。

1資料與方法

1.1一般資料2014年4月至2015年6月在南海經濟開發區醫院內科住院及門診確診為乙型肝炎患者的114例納入乙型肝炎組，其中男56例，女58例，年齡23～79歲，平均(43.7±6.1)歲；乙型肝炎患者病例的診斷均符合2000年中華醫學會西安會議修訂的《病毒性肝炎防治方案》診斷標準。另選擇該院預防保健科健康體檢者51例納入對照組，其中男26例，女25例，年齡23～67歲,平均(39.8±8.2)歲。

1.2儀器與試劑乙型肝炎兩對半診斷試劑盒購于蘇州新波生物技術有限公司，HBc-IgM檢測試劑盒和PreS1Ag檢測試劑盒購于上?？迫A生物工程有限公司，HBV-DNA檢測試劑盒購于中山大學達安基因股份有限公司。檢測儀器包括時間分辨熒光免疫分析儀(ANYTEST-2000，上海新波生物技術有限公司)、全自動酶標洗板機(Egate-2310，上海新波生物技術有限公司)、酶標變頻振蕩器(新波2510，上海新波生物技術有限公司)。

1.3檢測方法

1.3.1“乙型肝炎兩對半”定量檢測分別加入100 μL陰性、陽性對照和待檢血清到反應孔，加完后用封口膜封板。在振蕩儀慢速振蕩孵育40 min(室溫20～25 ℃)。揭下封口膜并棄掉，用洗板機洗滌4次，最后扣干。每孔加入已稀釋的銪標記物100 μL，用封口膜封板。然后置于振蕩儀慢速振蕩孵育40 min(室溫20～25 ℃)。揭下封口膜并棄掉，用洗板機洗滌6次。每孔加入增強液100 μL，慢速振蕩孵育5 min。用時間分辨熒光測定儀測定各孔的熒光讀數。

1.3.2HBV-DNA定量檢測用無菌的干燥玻璃管采靜脈血2 mL，1 500 r/min離心5 min，吸取上層血清，轉移至1.5 mL滅菌離心管。取100 μL血清加入等量DNA濃縮液，振蕩混勻5 s；12 000 r/min離心10 min；去上清，沉淀中加入20 μL DNA提取液，振蕩混勻5～10 s，瞬時離心數秒，100 ℃恒溫處理(10±1)min；12 000 r/min離心5 min。取PCR反應管若干，分別加入處理后的樣品上清液2 μL，8 000 r/min離心數秒，放入PCR擴增儀樣品槽。將各反應管放入ABI Prism 7300 PCR儀器的微孔反映槽內，在電腦上按對應順序設置陰性、陽性質控品以及未知標本，并設置樣品名稱、標記熒光基團種類和循環條件，2 h擴增結束后，在電腦的分析菜單下選擇自動分析。

1.3.3PreS1Ag和抗HBc-IgM定性檢測待測孔加入標本、陰陽性對照各50 μL，封板，置于37 ℃孵育30 min。使用洗板機洗滌5次后拍干。接著每孔加酶結合物50 μL(空白對照孔不加)，充分混勻，再次封板，37 ℃孵育30 min。再用洗板機洗滌5次后拍干。每孔加顯色劑A、B各50 μL，充分混勻后封板，37 ℃孵育15 min。每孔加終止液50 μL，混勻。立即用酶標儀讀數(波長450 nm)，讀取各孔吸光度(OD)值。

1.4統計學處理采用SPSS 17.0進行數據處理及統計學分析，計數資料以例數或百分率表示，組間比較采用χ2檢驗。所有統計檢驗均為雙側檢驗，以P<0.05 表示差異有統計學意義。

2結果

2.12組3項指標陽性率比較與對照組比較，乙型肝炎組中抗HBc-IgM、PreS1Ag及HBV-DNA的陽性率均明顯高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。

表1　2組3項指標陽性率比較[n(%)]

注：與對照組比較，*P<0.05。

2.2乙型肝炎患者不同HBV感染模式與3項指標的相關性在114例乙型肝炎患者中“大三陽”，“小三陽”，HBsAg與 HBeAg陽性、HBsAg與HBeAb陽性4種不同的感染模式組中，PreS1Ag和HBV-DNA的陽性率呈正相關。在4種不同HBV感染模式組別中，通過χ2檢驗，抗HBc-IgM和PreS1Ag的陽性率差異都具有統計學意義(χ2=9.922，P<0.05；χ2=9.469，P<0.05)，表明抗HBc-IgM和PreS1Ag在4種不同HBV感染模式組別中陽性檢出率差異明顯。4種不同HBV感染模式組別中，HBV-DNA的陽性率比較，差異無統計學意義(χ2=5.848，P>0.05)，說明HBV-DNA的陽性檢出率沒有明顯差異。

表2　乙型肝炎患者不同HBV感染模式與3

2.3乙型肝炎患者PreS1Ag與HBV-DNA相關分析PreS1Ag與HBV-DNA結果比較，差異無統計學意義(χ2=0.451，P>0.05)，兩者呈顯著正相關(r=0.863,P<0.05)。表明在114例乙型肝炎患者中PreS1Ag及HBV-DNA檢測結果有較高的符合率，PreS1Ag與HBV-DNA高度相關。

表3　乙型肝炎患者PreS1Ag與HBV-DNA

3討論

HBV是一種嗜肝細胞病毒，完整的HBV顆粒呈球形，直徑為42 nm，具有雙層衣殼蛋白，由外殼蛋白和核心成分組成。外殼蛋白即囊膜由脂質雙層與蛋白質構成，由S、前S1和前S2組成，包膜內部包裹的是二十面立體對稱的內核，內核表面含有乙肝病毒核心抗原(HBcAg)和乙肝病毒e抗原(HBeAg)，內核核心成分包括雙股DNA和DNA多聚酶[9]。相關研究表明，PreS1Ag已成為感染、復制和乙型肝炎患者診斷、治療和預后的一項重要指標[10-12]。

本文通過對114例乙型肝炎患者血清檢測結果分析發現，PreS1Ag在乙型肝炎組血清中陽性率為78.9%，提示PreS1Ag在一定程度上可作為HBV感染的又一血清標志物。本研究結果顯示，乙型肝炎組中抗HBc-IgM、PreS1Ag及HBV-DNA的陽性率都明顯高于對照組的陽性率。檢測中出現少數HBsAg陰性而PreS1Ag陽性的情況，經過分析主要原因可能是HBsAg濃度過高引起的鉤狀效應、HBV處于潛伏期或者HBsAg分泌量不足，同時也可因為編碼HBsAg的HBV中S區發生基因變異。本研究中還出現HBsAg陽性而PreS1Ag陰性的現象，因為PreS1Ag是HBsAg的組成成分之一，可作為HBV感染的標志，但HBsAg不僅存在于完整的病毒顆粒表面，還存在于小球顆粒及管型顆粒，而PreS1Ag只能在完整病毒顆粒表面有效表達，因此可出現HBsAg陽性而PreS1Ag陰性的現象[13]。PreS1Ag陽性率為78.9%，HBV-DNA陽性率為88.6%，兩者符合率為89.1%(90/101),兩者差異無統計學意義(χ2=0.451，P>0.05),提示呈正相關(r=0.863)，因此PreS1Ag與 HBV-DNA 是檢測率高度符合的重要病毒復制指標，與鄒偉等[14]的研究結果一致。

在乙型肝炎兩對半中，HBeAg是HBV核心內部成分，是HBV處于復制狀態的標志，但HBeAg陰性并不意味著HBV復制的完全終止或病毒血癥的消失，可能是HBV基因組的前C區發生變異而導致HBeAg表達障礙，這時PreS1Ag檢測陽性比HbeAg更能反映HBV復制情況，因此，PreS1Ag作為HBV病毒感染、復制的指標比HbeAg更敏感，有獨立檢測的價值，對乙型肝炎兩對半檢測起重要的補充作用。表2顯示，HBV-DNA和PreS1Ag在4種不同HBV感染模式組別的陽性率都較高，并且HBV-DNA和PreS1Ag的陽性率在HBeAg陽性組明顯高于HBeAg陰性組，提示PreS1Ag、HBV-DNA和 HBeAg三者關系密切，在HBV復制時表達最多，可作為HBV存在及病毒復制和有傳染性的指標[15]。

HBV感染機體后，體液免疫反應首先產生以抗HBc-IgM為主的免疫球蛋白，隨后IgM抗體滴度下降，而IgG效價迅速上升。因此，抗HBc-IgM可以作為HBV感染早期診斷的指標，以往認為抗HBc-IgM可作為HBV近期感染的血清學標記，但后來發現在慢性乙型肝炎中也有較多陽性者。因此，抗HBc-IgM陽性是HBV在體內復制的重要指標，提示患者近期有HBV感染或慢性乙型肝炎患者的HBV有活動性復制，患者有很強的傳染性。本研究結果顯示，在4種不同HBV感染模式組別中，抗HBc-IgM的陽性率差異有統計學意義(χ2=9.922，P<0.05)，表明抗HBc-IgM在4種不同HBV感染模式組別中陽性檢出率具有明顯差異。本研究中，抗HBc-IgM在“大三陽”和“小三陽”中的陽性率分別為39.2%和29.2%。表明抗HBc-IgM與HBV的活動性復制呈正相關。

外周血清中HBV-DNA的檢測反映完整HBV顆粒的釋放，是檢測病毒復制最直接可靠的指標。本研究中，HBV-DNA在“大三陽”組的檢出率為90.2%，但同時也存在HBV-DNA陰性的患者，其原因可能為藥物抑制HBV-DNA復制，但仍存在低水平病毒復制的可能，只是濃度低于檢測下限(<500)，也可能標本內含有抑制擴增反應的物質，如含有Taq DNA聚合酶抑制物。在4種不同HBV感染模式組別中HBV-DNA的陽性率比較，差異無統計學意義(χ2=5.848，P>0.05)，說明HBV-DNA的陽性檢出率沒有明顯差異。熒光定量PCR對實驗室要求條件較高，一般基層醫療單位還很難開展。相關研究報道，PreS1Ag與HBV-DNA有較好的一致性，但又存在一定的交叉陽性和交叉陰性[16]。因此，PreS1Ag不能等同或替代HBV-DNA的檢測，在臨床診斷中應充分依據兩種指標的獨立性和互補性來診治患者。

綜上所述，PreS1Ag是比HBeAg更敏感的判斷HBV感染和復制的重要指標，能夠彌補由于HBeAg陰性情況下給臨床診斷和治療帶來的“誤導”，抗HBc-IgM與HBV的活動性復制呈正相關，可以作為乙型肝炎檢查的常規項目，因此抗HBc-IgM、PreS1Ag及HBV-DNA 聯合乙型肝炎“兩對半”對診斷乙型肝炎具有更好的意義。

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2016-01-28修回日期：2016-03-18)

10.3969/j.issn.1673-4130.2016.12.055

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1673-4130(2016)12-1722-03