慢性乙型肝炎患者病毒基因組與乙型肝炎病毒e抗原、肝功能關系分析

劉振杰，曹永堅，岑子華，徐　寧△

(1.廣東省中醫院芳村醫院檢驗科，廣州 510370；2.中山大學醫學院2008級醫學檢驗，廣州 510080)

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·論著·

慢性乙型肝炎患者病毒基因組與乙型肝炎病毒e抗原、肝功能關系分析

劉振杰1，曹永堅1，岑子華2，徐寧1△

(1.廣東省中醫院芳村醫院檢驗科，廣州 510370；2.中山大學醫學院2008級醫學檢驗，廣州 510080)

摘要:目的探討乙型肝炎病毒基因組 (HBV-DNA)、乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg)、肝功能的相關關系，為臨床治療提供參考。方法回顧分析401例患者的HBV-DNA、HBeAg、丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉移酶(AST)水平，對HBV-DNA與HBeAg進行相關性分析。根據患者的HBV-DNA、HBeAg水平進行分組，比較各組的ALT、AST水平差異。結果(1)HBV-DNA與HBeAg的陽性率存在相關性，相關系數r=0.671(P<0.01)；(2)HBV-DNA載量達105 copies/mL時，血清ALT、AST較HBV-DNA陰性組及低載量組顯著升高，差異有統計學意義(P<0.05)；(3)在HBV-DNA載量相當時，HBeAg陽性組與陰性組ALT、AST活性差異無統計學意義(P>0.05)。結論(1)HBeAg與HBV-DNA具有相關性；(2) HBV-DNA載量較高的患者容易出現肝功能異常；(3)HBeAg的存在情況與肝功能無顯著相關性。

關鍵詞:乙型肝炎病毒基因組；乙型肝炎病毒e抗原；丙氨酸氨基轉移酶；天冬氨酸氨基轉移酶

乙型肝炎是一種常見傳染病，據估計全球3.5億人感染乙型肝炎病毒(HBV)，HBV與肝硬化、原發性肝癌密切相關，每年有一百萬人死于有關疾病[1]。目前，認為乙型肝炎對肝的損害是由于HBV引起細胞免疫針對受感染肝細胞的清除，病情的轉歸涉及HBV的體內復制情況和機體的免疫狀況。HBV基因組(HBV-DNA)載量、HBV血清標志物和血清轉氨酶是監測HBV感染情況的常用指標。了解三者之間的相關關系及臨床應用的代表性有其意義。本文旨在研究三者在慢性乙型肝炎患者中的聯系，為臨床提供指導意義。

1資料與方法

1.1一般資料401例血清標本收集自2013年2月1日至2013年3月15日在廣東省中醫院系統(包含大德路總院、芳村分院、二沙島分院、大學城分院)同時作HBV-DNA、乙型肝炎兩對半定量、丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉移酶(AST)檢測的門診及住院患者，排除溶血、黃疸、脂血標本。診斷標準參照《慢性乙型肝炎防治指南(2010版)》[2]。其中男273例，女128例，年齡12～77歲，平均(37±12)歲。

1.2儀器與試劑血清ALT、AST由兩套檢測系統測定：羅氏Modular全自動生化分析位儀購自德國羅氏公司，采用羅氏配套試劑、校準品、伯樂質控品；羅氏Cobas 8000全自動生化分析儀，采用配套試劑、校準品、伯樂質控品。兩套系統均通過室間質評；ABI 7300自動基因擴增檢測儀購自美國ABI公司，HBV-DNA熒光定量試劑盒由廣州中山大學達安基因股份有限公司生產；羅氏e 601化學發光分析儀購自德國羅氏公司，采用羅氏配套試劑、校準品、伯樂質控品。

1.3方法

1.3.1ALT活性測定以速率法測定。ALT催化L-丙氨酸和2-酮戊二酸產生丙酮酸，丙酮酸在還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)存在下生成L-乳酸和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)，NADH的反應速率與ALT的活性成正比，在340 nm波長處可檢測到吸亮度的降低。測試系統以測定值大于50 IU/L為陽性。

1.3.2AST活性測定以速率法測定。AST催化L-精氨酸與天門冬氨酸產生L-谷氨酸與草酰乙酸，草酰乙酸在蘋果酸脫氫酶存在下與NADH反應生成L-乳酸和NAD，反應速率和AST的活性成正比，在340 nm波長處檢測到吸亮度的降低。AST測試系統以測定值大于40 IU/L為陽性。

1.3.3血清HBVe抗原(HBeAg)定量測定用電化學發光法測定。測試原理利用雙抗體夾心法，先將待測血清、生物素化抗HBeAg單克隆抗體、釕標記抗乙型肝炎e(HBe)混合，形成夾心復合物，再加入鏈霉素親和素微粒，通過生物素-親和素結合使微粒結合在復合物上，在測量池中用磁鐵吸附復合物，同時洗去未形成復合物，加電壓發光并由光電倍增管檢測，通過計算器運算結果，以cut-off值大于或等于1判為陽性。

1.3.4乙型肝炎DNA定量測定用熒光定量聚合酶鏈反應(PCR)測定。嚴格按照試劑盒說明書進行操作，主要技術步驟為血清中HBV-DNA提取，PCR反應條件為93 ℃ 2 s→93 ℃ 45 s→55 ℃ 60 s進行10次循環，再以93 ℃ 30 s→55 ℃ 45 s進行30次循環。以HBV-DNA≥500 copies/mL作陽性判斷臨界值。以HBV-DNA載量分為3個水平：DNA陰性組 (HBV-DNA<500 copies/mL)、DNA低載量組(500 copies/mL≤HBV-DNA<105copies/mL)、DNA高載量組(HBV-DNA≥105copies/mL)；同時以HBeAg定性結果分為HBeAg陽性組(S/CO≥1)和HBeAg陰性組(S/CO<1)，共6組。

1.3.5數據查詢登錄怡捷實驗室數據處理系統，以1.1中標準查詢并記錄患者的ALT、AST、HBeAg定量及HBV-DNA定量檢測結果。

2結果

2.1HBeAg陽性率與HBV-DNA陽性率的關系HBeAg陽性200例，其中HBV-DNA陽性121例，HBV-DNA陰性79例；HBeAg陰性201例，其中HBV-DNA陽性69例，HBV-DNA陰性132例。兩者比較差異有統計學意義(χ2=27.54，P<0.01)，兩者的陽性率相關。

2.2HBeAg定量與HBV-DNA定量的相關關系為進一步研究兩者間的相互關系，以HBV-DNA定量和HBeAg定量作統計量，計算兩者Pearsons相關系數。結果顯示兩者之間相關系數r=0.671(P<0.01)。

2.3ALT、AST與HBeAg、HBV-DNA載量關系分析經t檢驗后，無論HBeAg陽性或陰性，HBV-DNA低載量與HBV-DNA陰性組相比，ALT、AST差異均無統計學意義(P>0.05)；HBV-DNA高載量與HBV-DNA陰性組、HBV-DNA低載量組相比，ALT、AST差異均有統計學意義(P<0.05)。在HBeAg定性結果不同但同等病毒載量下，各組相比，ALT、AST差異均無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1　不同載量HBV-DNA及HBeAg組ALT、AST的水平

續表1　不同載量HBV-DNA及HBeAg組ALT、AST的水平

3討論

目前，HBV-DNA檢測是最特異的針對HBV在體內復制情況的指標，但由于其成本較高，對儀器設備要求苛刻的關系，部分醫療機構難以推廣。血清轉氨酶和乙型肝炎血清標志物均是與乙型肝炎密切相關的指示物，方法學上更簡單，應用較廣，但兩者代替HBV-DNA的監察作用的合理性則存在疑問。本文對HBeAg與HBV-DNA的相互關系作出分析，發現HBV-DNA檢測結果為陽性的患者，其HBeAg檢測陽性率高于HBV-DNA檢測結果為陰性的患者，兩者間差異有統計學意義(P<0.01)，說明HBV-DNA與HBeAg的發生率具有相關性。在進一步的相關性檢驗中，以兩者的絕對數量為坐標軸作散點圖，統計后得出兩者的Pearsons相關系數r=0.671(P<0.01)，說明兩者在數量上呈正相關。有報道指出，高病毒負荷的患者易轉慢性化[3-4]，而Milich等[5]的研究指出，HBeAg的存在能干擾CD8-CTL的細胞毒作用，誘導機體對HBV的免疫耐受，兩者指出HBV-DNA和HBeAg對乙型肝炎慢性化都具有預警作用，而此結果顯示以HBeAg作為HBV-DNA復制的指標的確有一定根據，在缺乏其他資料支持下，HBeAg具有提示的作用?？v然如此，建立HBeAg與HBV-DNA的關系仍有不少問題目前難以克服，從相關性分析中可得知兩者數量不構成平行關系。本研究中發現，79例HBeAg陽性患者HBV-DNA水平為陰性，可能與慢性乙型肝炎的自然病史有關，在免疫清除期后期或低活動期前期機體免疫系統被激活，開始清除病毒顆粒，結果是病毒載量的減少。同時，血清轉換在該時期尚未完成，患者仍然表達HBeAg[6]。利用HBeAg的另一盲點是無法評估HBeAg陰性乙型肝炎患者。由于HBV轉錄酶缺乏修飾功能，翻譯中易發生突變。HBeAg可有數種途徑，主要的有：(1)前C區的1 896位的G-A變異，使終止子抗胸腺球蛋白出現，病毒不能表達HBeAg，但并不影響DNA的復制[7]；(2)HBeAg表達水平降低，核心啟動子區存在T1462A和T1464A突變，使HBeAg表達水平大幅下降。以上突變只影響HBeAg的表達，并不影響HBV的復制，無法以HBeAg來說明HBV的復制情況[8]。有報道指出，HBeAg的陰性化有利于HBV逃過免疫機制[9]。一項流行調查指這類患者占總體患者21%～40%[7]。

另外，臨床常用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)大規模篩查可疑人群，而并非本文所用的電化學發光法。有報道指出，以電化學發光對HBeAg的最低檢測限可達比ELISA高10倍以上[10]，可預期以ELISA作大規模篩查，其漏檢情況更為普遍，失去提示作用，值得留意。

有關肝功能與乙型肝炎血清標志物及HBV-DNA之間的關系，不少數據曾對此作出分析，但結論分歧。本文中亦以HBV-DNA的絕對數量及HBeAg的定性檢測結果分組，以便觀察各基因組水平及同等基因組水平下肝損害的情況。結果顯示不論基因組載量的高低，在相同HBV-DNA水平下，HBeAg陽性組與HBeAg陰性組的血清ALT、AST均差異無統計學意義(P>0.05)，說明HBeAg不影響血清ALT、AST水平，沒有反映肝細胞的實質損害作用。究其原因，據文獻[11-12]的報道，人體對HBV的免疫作用主要為細胞免疫，主要作用細胞是CD4Th細胞和CD8-CTL細胞，雖然HBeAg能成為CTL的靶抗原，但其不是結構蛋白，因此其作用主要是免疫耐受調節因子，不直接導致肝細胞損傷[13-15]。因此，HBeAg并非血清轉氨酶異常升高的主因。文中同時研究HBV-DNA載量對肝功能的影響，結果說明在HBeAg定性檢測結果一致的情況下，不論在HBeAg陽性組與HBeAg陰性組里，都存在同樣現象：在HBV-DNA為陰性或水平較低(<105copies/mL)時，HBV-DNA與肝損害致ALT、AST在血中存在的關系不明顯(P>0.05)；當HBV-DNA達到一定水平(>105copies/mL)時，基因組復制水平與肝功能之間有關(P<0.05)，HBV-DNA載量較高時，肝損害亦會加重，這與文獻[16-18]報道一致。

綜上所述，HBV-DNA、HBeAg和血清轉氨酶三者分別從病毒的復制水平、免疫應答和肝細胞損害反映機體感染HBV后的狀況。隨著HBeAg陰性乙型肝炎的發現和乙型肝炎患者肝細胞損害的機制的了解，對三者之間是否存在緊密聯系提出了質疑。本研究結果顯示，用血清轉氨酶和HBeAg代替HBV-DNA作為檢測HBV的活動指標并不是完全沒有依據，但臨床應用中具有很大的局限性，并不能如實反映HBV的復制情況及傳染性，因此同時作3種檢查有其必要性。

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作者簡介：劉振杰，男，主管技師，主要從事臨床免疫學研究?！魍ㄓ嵶髡?，E-mail:xu_ning21@163.com。

DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2016.13.015

文獻標識碼：A

文章編號：1673-4130(2016)13-1784-03

(收稿日期：2016-02-18修回日期：2016-04-30)

Analysis on relation between viral genome with hepatitis B virus e antigen and liver function in chronic hepatitis B patients

LIUZhenjie1,CAOYongjian1,CENZihua2,XUNing1△

(1.DepartmentofClinicalLaboratory,FangcunHospital,GuangdongProvincialHospitalofTraditionalChineseMedicine,Guangzhou,Guangdong510370,China;2.Grade2008,DepartmentofMedicalLaboratory,SunYatsenUniversity,Guangzhou,Guangdong510080,China)

Abstract:ObjectiveTo study the relationship among hepatitis B viral genome (HBV-DNA),hepatitis Be antigen(HBeAg) and liver function in chronic hepatitis B patients,and to provide the reference for clinical treatment.MethodsThe quantitative levels of HBV-DNA,HBeAg,alanine aminotransferase (ALT) and aspartate aminotransferase(AST) in 401 patients were analyzed and the correlation analysis between HBV-DNA and HBeAg was performed.The grouping was performed according to the HBV-DNA and HBeAg quantitative levels and the differences of ALT and AST levels were compared among the groups.Results(1) The correlation existed between HBV-DNA and HBeAg positive rate,r=0.671(P<0.01);(2)when HBV-DNA load reaching 105 copies/mL,serum ALT and AST levels showed significantly increased compared with the HBV-DNA negative group and low load group,the difference was statistically significant(P<0.05);(3)when HBV-DNA load was equivalent,the difference of ALT and AST activity had no statistically significant difference between the HBeAg-positive and HBeAg-negative groups.Conclusion(1)HBeAg has a correlation with HBV-DNA;(2)the patients with higher HBV-DNA load are easy to develop the liver function abnormality;(3)the HbeAg existence situation has no obvious relation with the liver function.

Key words:hepatitis B viral genome;HBV e antigens;alanine aminotransferase;aspartate aminotransferase