應用PCR-LDR法比較2個地區慢性乙型肝炎病毒核苷類藥物耐藥突變和基因型

丁彬彬,段正軍

(1.上海市虹口區精神衛生中心檢驗科　200083；2.蘭州大學第二醫院肝病研究所，蘭州 730030)

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·論著·

應用PCR-LDR法比較2個地區慢性乙型肝炎病毒核苷類藥物耐藥突變和基因型

丁彬彬1,段正軍2

(1.上海市虹口區精神衛生中心檢驗科200083；2.蘭州大學第二醫院肝病研究所，蘭州 730030)

摘要:目的探討上海和蘭州2個地區的慢性乙型肝炎病毒核苷類藥物耐藥突變和基因型的比較及關系。方法取上海和蘭州地區慢性乙型肝炎患者194例和325例的血清，利用聚合酶鏈反應(PCR)-連接酶反應檢測技術(LDR)法對常見的7種耐藥突變位點和B型、C型兩種型別進行檢測。使用SPSS17.0統計軟件對數據進行分析。結果(1)2個地區均以C型為主，上海、蘭州分別為79.3%、81.4%。(2)上海地區突變比率(48.9%)高于蘭州地區(35.3%)，差異有統計學意義(P<0.05)。2個地區耐藥突變均以拉米夫定突變為主，占75.7%(153/202，上海68/92，蘭州85/110)，2個地區導致拉米夫定耐藥突變位點上差異有統計學意義(P<0.05)；而2個地區的阿德福韋耐藥位點均以rtA181T/V為主，地區間差異無統計學意義(P>0.05)。(3)是否耐藥突變與基因型無相關性，C基因中上海地區的突變比率(49.0%)高于蘭州地區(35.4%)，差異有統計學意義(P<0.05)。(4)4種耐藥比率在與基因型無相關性。結論上海、蘭州2個地區在基因型分布上相似，上海地區發生耐藥比率更高，2個地區均顯示發生耐藥與否以及耐藥類型與基因無關。

關鍵詞:PCR-連接酶檢測反應；乙型肝炎病毒；耐藥突變；基因型

據統計，全球每年大約有3.5億人感染慢性乙型肝炎，超過100萬人死于肝硬化和肝癌[1]。乙型肝炎病毒(HBV)持續感染與肝炎、肝硬化、肝癌的發生密切相關[1-2]。HBV根據基因組全序列的差異性是否大于8%分為A～H 8種基因型[3]。在中國，較為常見的是B型和C型，其中B型和C型,按照中國南北地域分布存在差，北方以C型為主，南方以B型為主，而A型和D型則較少發現[4-5]。一些研究表明不同基因型對抗病毒治療的藥物應答不同，B型要比C型對干擾素的應答好；另外，C型通常與HBV重度感染、肝硬化、肝癌更加高度相關[6-7]。目前，用于乙型肝炎治療常用的核苷類似物藥類存在耐藥突變，主要的突變位點有7個，分別為rtL180M、rtA181T/V、rtT184G、rtS202I、rtM204I/V、rtN236T、M205V[8]。準確地對HBV進行分型和耐藥位點突變檢測非常重要，對乙型肝炎患者的用藥、預后有很強的指導意義。聚合酶鏈反應(PCR)-連接酶反應檢測技術(LDR)是目前研究較多，靈敏度高、特異性強，且性價比高的檢測方法，可以用于臨床檢測基因分型和多耐藥位點檢測[8-10]。

對于HBV的分型和耐藥的研究以一個地區較多，而對2個地區比較的研究較少，尤其是對中國東西2個城市比較。本文對地理位置分別在東部和西北部的上海和蘭州進行了分型和耐藥的比較研究。

1資料與方法

1.1一般資料本次研究所用的血清標本收集于上海市虹口區精神衛生中心和蘭州大學第二醫院，共計519例，其中上海市虹口區精神衛生中心194例(2013年1月至2015年10月)，男119例，女75例，年齡26～67歲，平均43.72歲；蘭州大學第二醫院325例(2013年8月至2015年5月)，男213例，女112例，年齡24～72歲，平均45.23歲；上述患者血清標本采集均符合2005年《慢性乙型肝炎防治指南》中的有關標準。

1.2儀器與試劑儀器使用美國伯樂公司MJ-90 PCR 儀，ABI公司ABI7500實時熒光定量PCR儀和美國ABI公司ABI3130 DNA測序儀。乙型肝炎DNA提取試劑為上海星耀醫學科技發展公司(簡稱上海星耀)乙型肝炎DNA磁珠提取試劑盒，乙型肝炎DNA定量檢測使用HBV核酸擴增熒光定量試劑盒，耐藥位點擴增、LDR反應和測序使用上海星耀生產的HBV多耐藥基因位點分型試劑盒。

1.3方法

1.3.1血清乙型肝炎DNA提取按照上海星耀生產的DNA提取試劑盒進行。

1.3.2PCR擴增、電泳檢測、LDR反應和毛細管電泳均按照上海星耀生產的HBV多耐藥基因位點分型試劑盒的說明書進行。

1.4統計學處理電泳結束后結果判定通過GeneMapper4.0軟件進行分析，數據統計使用SPSS 17.0進行，以P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1特異性檢測、檢測下限和重復性隨機挑選經LDR法檢測突變位點為rtL180M、rtA181T/V、rtT184G、rtS202I、rtM204I、rtM204V、rtN236T、M205V以及野生型各3例進行測序檢測，LDR法檢測結果和測序結果均一致。

按照試劑盒說明書的最低檢測下限103copies/mL，挑選含不同突變位點的rtL180M、rtA181T/V、rtT184G、rtS202I、rtM204I、rtM204V、rtN236T、M205V和野生型標本1～3例，進行乙型肝炎DNA不同病毒載量檢測，根據定量結果將這些標本稀釋至103～104copies/mL，每個標本重復檢測3次，均能檢測出相應突變。

本實驗共測試519例標本，19例標本未檢測出，其中上海地區13例，蘭州地區6例。對19例標本進行DNA定量檢測結果低于試劑盒檢測下限，符合試劑盒性能。

2.2HBV基因型結果本次PCR-LDR法對標本進行了B型和C型檢測，其他型別未進行檢測。2個地區的B、C分型的結果統計見表1。500例測試標本中C型為主，共403例(80.6%)，B型74例(14.8%)、非B非C18例(3.6%)，B/C混合型5例(1%)，同樣上海地區(79.3%，149/188)和蘭州地區(81.4%，254/312)的均以C型為主。2個地區間的B、C、非B非C型、B/C混合型所占比率差異無統計學意義(P=0.329)，排除非B非C型和B/C混合型不考慮，2個地區的B、C型分布之間差異無統計學意義(P=0.215)。

表1　2個地區HBV基因型及耐藥統計情況[n(%)]

注：耐藥突變統計按照發生拉米夫定、恩替卡韋、替比夫定、阿德福韋耐藥突變計算，若有相關位點突變但未導致耐藥突變未列為耐藥突變。

2.32個地區HBV耐藥突變結果本次500例標本中共有208例標本發生rtL180M、rtLA181T/V、rtT184G、rtS202I、rtM204、rtM204V、 rtM204I/V、 rtN236T、rtM250V當中的某個位點或多個位點突變，共檢測出32種突變位點組合，其中6例標本未發生耐藥突變。耐藥突變比率為41.6%，其中上海地區為48.9%(92/188)，蘭州地區35.3%(110/312)，2個地區突變比率差異有統計學意義(P=0.002 5)。202例耐藥突變標本中拉米夫定突變153例，占總耐藥突變比率的75.7%(上海68例，蘭州85例)；各種耐藥突變比率差異有統計學意義(P<0.05)。2個地區拉米夫定突變不同：上海地區rtM204I、rtM204V突變為主，其他形式突變少數；而蘭州地區以rtM204V為主；對2個地區rtM204I、rtM204V進行統計學分析，差異有統計學意義(P=0.007 5)。對阿德福韋耐藥的耐藥位點進行類似分析發現，2個地區均以rtA181T/V為主，地區間差異無統計學意義(P=0.994 0)。恩替卡韋的突變例數較少未進行位點統計學分析。所有突變標本中，發生2種或2種以上耐藥突變共109例，占總耐藥突變比率的54.0%，其中上海46.7%(43/92)，蘭州60.0%(66/110)，2個地區多耐藥情況差異無統計學意義(P=0.059 7)，發生3種藥物耐藥突變7例(上海3例，蘭州4例)，無4種藥物共同耐藥突變，其中2種耐藥以拉米夫定和替比夫定同時耐藥為主，占84.4%(92/109，上海33/43，蘭州59/66)。

2.4HBV基因型與耐藥突變關系對2個地區的BC分型及耐藥突變的分布統計見表1。由于B/C混合型和非B非C型在總數中所占比例較小，結果分析剔除了這些標本。對所有耐藥突變按照B型和C型的進行分類如下：B型39.2%(29/74)，C型40.4%(163/403)，B、C型耐藥突變比率差異無統計學意義(P=0.839)。對2個地區B、C型的突變比例分開進行統計得到類似結果，差異無統計學意義(P>0.05)，其中上海地區(P=0.956)、蘭州地區(P=0.642)。對B或C型突變在上海和蘭州地區的所占比率分別進行地區間比較：兩個地區間B型耐藥突變情況(上海48.5%，蘭州31.7%)差異無統計學意義(P=0.14)，2個地區間C型耐藥突變(上海49.0%，蘭州35.3%)差異有統計學意義(P=0.007 4)。

2.5耐藥突變與HBV基因型比較對發生耐藥突變的標本按4種藥物類型與基因型進行分類見表2，所有B和C型中4種耐藥突比率差異無統計學意義(P<0.68)，對上海地區和蘭州地區單獨進行分析差異無統計學意義(P>0.05)。對耐藥突變位點的基因分析，發現rtL180M絕大分發生在C型中(34,1B33C)，2個地區間差異無統計學意義(P>0.05)。其他幾個位點基因型的分析見表3。關于耐藥位點的與基因分型關系，發現了一些位點差異有統計學意義(P<0.05)，如 rtL180M、rtT184G、rtM250V；但同時也有位點差異無統計學意義(P>0.05)，如rtLA181T/V、rtS202I、rtM204I、rtM204V、rtN236T。

表2　2個地區的耐藥類型與基因型統計比較[n(%)]

表3　2個地區的突變位點與基因型統計比較(n)

3討論

3.1PCR-LDR法性能分析PCR-LDR法是利用PCR法首先對目的DNA片段進行擴增，然后對擴增產物進行LDR反應即連接酶反應。LDR的原理是利用具有極強的突變識別能力的連接酶，當上下游探針跟目標產物雜交時，探針和目標完全互補才能進行連接酶反應，如果上下游引物發生錯配則連接反應不能進行；對于PCR-LDR法的性能相關研究已有數據顯示：該方法在檢測乙型肝炎的耐藥型和基因型具有PCR高靈敏度、高特異性和測序法的高精準度特點，且相對測序法性價比更高[8-10]。本文沒有過多對這些性能進行大數據驗證，就章節2.1中涉及的驗證均與先前研究符合[8-10]，表明該檢測方法的可靠性。

3.22個地區乙型肝炎型別的關系由于中國地區主要乙型肝炎型別為B型和C型，本試劑盒只對B型和C型進行檢測。經統計發現，上海地區和蘭州地區的基因型均以C型為主，本研究中2個地區的各基因分布情況差異無統計學意義(P>0.05)，蘭州地區略高于上海地區，這些結果符合先前研究，北方地區以C型為主[3-5]，上海地區的C型比先前的研究要略高[11]，這可能與標本基數不夠大和上海地區流動人口比較多有關系。值得一提的是，本文研究中檢測出的非B非C型主要集中在蘭州地區，可能與該地區的少數民族的比率高于上海地區有關系，對于HBV的基因分型的研究也顯示中國地區的A型和D型主要存在于少數民族[5]。

3.3耐藥位點突變分析本文耐藥位點突變的判讀基于先前的已有研究[8]。本研究發現，在所有208例發生位點突變患者中，有6例沒有產生耐藥，這可能在服用核苷類似物之前發生先天性的突變，但具體突變機理需要進一步研究。對2個地區耐藥突變情況進行比較，2個地區的發生耐藥突變的比率差異有統計學意義(P<0.05)，這可能與2個地區的經濟水平有關，上海地區的患者可能接受治療概率比蘭州地區高，由于沒有患者的詳細診療資料，具體原因需要進一步探究。研究發現2個地區均以拉米夫定突變為主，這與拉米夫定突變的單位點突變相關， rtM204I/V或rtL180M某一位點發生突變便產生耐藥。恩替卡韋的耐藥突變率最低，這與其耐藥為多位點突變有關系，其中恩替卡韋的6例突變5例存在于上海地區，也側面說明上海地區患者可能接受治療的比率更高，且更改過治療方案。2個地區的多耐藥情況，均以拉米夫定和替比夫定為主，這與替比夫定與拉米夫定的其中一個耐藥位點相同相關。

3.4是否耐藥突變與基因型關系分析對于2個地區的BC分型和是否耐藥突變分析，未發現是否耐藥突變在2種基因的存在偏好性。本研究顯示與先前部分的研究結果相似，突變與否與基因型無關[12-14]，本研究也與部分研究結果有所出入，這些研究認為C型較B型更容易發生耐藥突變[14-15]。對2個地區的B型和C型的耐藥與否進行比較發現，C型中上海地區發生耐藥比率明顯高于蘭州地區，差異有統計學意義(P<0.05)，就此結果未找到相關文獻，是偶然性還是其他因素，有待進一步研究。

3.5耐藥突變位點及耐藥藥物種類與HBV基因型分析通過統計發現，結果同3.4，耐藥的藥物種類與HBV基因型無相關性，從統計學上看未發現某種藥物耐藥突變傾向于某種基因型，這與先前研究基本一致[12-13]。值得一提是，6例發生恩替卡韋突變標本均為C型，這一現象可以作為進一步研究對象。對于耐藥突變位點與基因型的關系本研究發現部分位點與基因型有關，如rtL180M、rtT184G、rtM250V更偏好C型，但由于實驗基數不大的原因，這一結論需要進一步研究證實。

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作者簡介：丁彬彬，女，主管檢驗師，主要從事臨床免疫與生化研究。

DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2016.13.026

文獻標識碼：A

文章編號：1673-4130(2016)13-1814-04

(收稿日期：2016-01-29修回日期：2016-04-10)

Comparative research on nucleoside drug resistance mutation and genotypes of chronic hepatitis B virus in two areas by PCR-LDR method

DINGBinbin1,DUANZhengjun2

(1.DepartmentofClinicalLaboratory,HongkouDistrictMentalHealthCenter,Shanghai200083,China;2.ResearchInstituteofLiverDisease,SecondHospitalofLanzhouUniversity,Lanzhou,Gansu730030,China)

Abstract:ObjectiveTo perform a comparative research on nucleoside drug resistance mutation and genotypes of chronic hepatits B virus in Shanghai and Lanzhou.MethodsThe serum samples(Shanghai,194 cases) and (Lanzhou,325 cases) were collected.The common 7 drug resistant mutation loci,genotype B and C were detected by using the PCR-LDR method.The obtained data were analyzed by using the SPSS17.0 statistical software.Results(1) Genotype C was the main genotype in two areas (Shanghai 79.3%,Lanzhou 81.4%).(2) The mutation rate in Shanghai was higher than that in Lanzhou with statistical difference (48.9% vs.35.3%,P<0.01).Lamivudine resistance mutation was predominant in all the mutations of two areas，accounting for 75.7% (153/202;Shanghai 68/92,Lanzhou 85/110);the difference in lamivudine resisrtance mutation loci had statistical difference between the two areas;while the adefovir resistance loci was dominated by rtA181T/V,the area difference had no statistical significance(P>0.05).(3) The drug resistance mutation had no correlation with genotype.The C genotype mutation rate in Shanghai was higher than that in Lanzhou,the difference was statistically significant(49.0% vs.35.4%,P<0.05 ).(4) 4 kinds of drug resistance rate had no correlation with genotype.ConclusionThe genotype distributions are similar in two areas;Shanghai has a higher drug resistance rate than Lanzhou;the drug resistance occurrence has no relation with drug resistance type and genotype.

Key words:PCR-LDR;HBV;drug resistance;genotype