田鼠巴貝蟲感染FTA-環介導等溫擴增檢測技術的建立

吳　芬，蔡玉春，秦志強，艾　琳，盧　艷，陳紹紅，吳秀萍，陳家旭

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田鼠巴貝蟲感染FTA-環介導等溫擴增檢測技術的建立

吳芬，蔡玉春，秦志強，艾琳，盧艷，陳紹紅，吳秀萍，陳家旭

中國疾病預防控制中心寄生蟲病預防控制所，衛生部寄生蟲病原與媒介生物學重點實驗室，世界衛生組織瘧疾、血吸蟲病和絲蟲病合作中心，上海200025

摘要：目的建立敏感、特異、高效的檢測田鼠巴貝蟲 FTA-環介導等溫擴增技術(LAMP)。方法根據GenBank公布的田鼠巴貝蟲基因序列，就細胞色素B基因保守序列設計了多套LAMP引物，利用LAMP RealTime Turbidimeter LA-320 儀篩選最佳引物、反應條件，建立LAMP檢測方法，從保存有血液樣本的FTA卡片中提取田鼠巴貝蟲 DNA進行LAMP，觀察檢測效果。結果設計的4組引物做LAMP試驗，其中以引物1，最佳反應溫度為64 ℃，恒溫下作用，敏感性高，可在1 h內完成，其檢出限量為0.687 fg/μL，而PCR的最低檢測量為0.687 pg/μL,與間日瘧原蟲、惡性瘧原蟲、卵形瘧原蟲、三日瘧原蟲、諾氏瘧原蟲、岡地弓形蟲、利什曼原蟲、岡比亞錐蟲均無交叉反應。以建立的FTA-LAMP法檢測20份PCR檢測陽性的田鼠巴貝蟲感染者血樣，其陽性符合率100%。結論成功建立了檢測田鼠巴貝蟲特異性細胞色素B基因的FTA-LAMP方法，該法特異性強、靈敏度高、簡便、快速、適于現場應用。

關鍵詞：田鼠巴貝蟲；環介導等溫擴增技術；FTA卡；細胞色素B基因

Supported by the Special Fund for Health Research in the Public Interest (No.201202019)

田鼠巴貝蟲(Babesiamicroti)又稱微小巴貝蟲，是一種類似于瘧原蟲的人獸共患血液寄生蟲，主要經蜱叮咬及輸血傳播[1]。如果在身體虛弱、免疫力低下的情況感染巴貝蟲，將出現嚴重后果，甚至死亡。高危地區巴貝蟲病防控與監測工作中存在快速評價、正確診斷、輸血及血制品的安全等3大實際問題，急需敏感性與特異性較高的巴貝蟲篩查技術。

當前診斷巴貝蟲病方法包括：病原檢測技術(血涂片染色法、動物接種法等)、免疫學檢測(ELISA、IFA等)及分子生物學技術(普通PCR、實時定量PCR等)。但并不理想。近年來一種全新的核酸擴增技術——環介導等溫擴增技術(Loop mediated isothermal amplification，LAMP)越來越受到研究人員的關注。

Salem等[2]報道，他們在利用細胞色素B基因(cytochrome B，cytB)作為靶基因建立PCR檢測方法檢測牛巴貝蟲和雙芽巴貝蟲時發現，該方法要比利用18SrRNA作為靶基因建立的方法靈敏20%。

現場血液樣本的采集、運輸、保存，常受到一些條件的限制，尤其是當采集樣本數較多時，亟需探索易于運輸、保存，又利于病原體核酸提取的樣本采集方法或措施。FTA (Flinders Technology Associates)卡(FTA卡)[3]是由特制的濾紙經強力變性劑、螯合劑浸泡，細胞與FTA卡接觸后被裂解，其核酸與纖維基質結合，維持樣品中核酸的完整性，保護核酸免于降解，起到保存作用。這一技術在病毒和一些寄生蟲等研究中得到了廣泛應用[4-8],但在田鼠巴貝蟲檢測方面尚未見報道。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1蟲株田鼠巴貝蟲peabody mjr株，購自美國模式培養物集庫存(American type culture collection，ATCC)，貨號:PRA-99; BALB/c小鼠(中科院上海實驗動物中心)

1.1.2儀器設備PCR儀(美國 ThermoPX2); 凝膠分析成像系統(Bio-RAD公司Quantity on 4.6.6); 低溫離心機(美國Thermo公司); 直徑2 mm打孔機(Whatman公司); 渦旋振蕩器(北京創博生物科技有限公司); 顯微鏡(日本奧林巴斯公司); EDTA抗凝管(浙江拱東醫療科技有限公司); LAMP Real Time Turbidimeter LA-302儀(日本榮源株式會社)。1.1.3主要試劑PCR試劑(上海生工公司); DNA提取試劑盒(QIAamp DNA Blood Mini Kit)；PCR產物純化回收試劑盒(上海超研生物科技有限公司); 100 bp DNA Ladder(天根生化科技有限公司); LAMP引物(上海生工公司合成); 鈣黃綠素(日本榮源株式會社); 0.9%生理鹽水(上海長富制藥公司);吉姆薩染液原液(上海怡成生物科技公司); 甲醇(上海振興化工一廠); E.Z.N.A. Viral Kit(Omega-Bio-tek); FTA紙片(Whatman公司)。

1.2方法

1.2.1引物設計以田鼠巴貝蟲細胞色素B基因作為目的基因(GenBank: FO082868.1)，采用引物設計軟件Primer Explorer 4.0設計4套引物，分別包括外引物F3和B3、內引物FIP和BIP、環引物LF和LB(表1)，由生工生物工程公司合成。

表1針對田鼠巴貝蟲cytB基因序列設計的LAMP反應引物

Tab.1LAMP reaction primers designed for B.microti cytB gene sequence

引物組別Group引物Primer序列組成(5'→3')Sequence11F3/10CATGTTTATGTACGCTCATCT1B3CCTAAGGTACTACTATTTACAGAGT1FIPGCCAATAGCGTAGGATAACATTAGTTAAGGGACTATGGTATTCATGC1BIPTGTATTACCATATGGCCAAATGAGCAGTTAGTCCTTTGTTCCAGT1LFCCTGTATACCACGATAAAGGGAGA1LBGGAGCTACGGTAATCATTAACTTGT22F3/1AGATATCTGCATAGTAATGGAGTA2B3AGAACAAGTTAATGATTACCGTA2FIPAGGGAGATATGTGCATGAATACCATGTCTGTTCTTCATGTTTATGTACG2BIPCTAATGTTATCCTACGCTATTGGCTCCAGTAGCTCATTTGGCC33F3/23TCATCTAATTAAGGGACTATGGTAT3B3CCTAAGGTACTACTATTTACAGAGT3FIPGCCAATAGCGTAGGATAACATTAGTGCACATATCTCCCTTTATCGT3BIPTATGGCCAAATGAGCTACTGGGAGTAACTCAGTTAGTCCTTTGT44F3/4CATGTTTATGTACGCTCATCT4B3CTAAGGTACTACTATTTACAGAGT4FIPGCCAATAGCGTAGGATAACATTAGTGGGACTATGGTATTCATGC4BIPTTACCATATGGCCAAATGAGCTAGTTAGTCCTTTGTTCCAGT4LFCCTGTATACCACGATAAAGGGAGA4LBGGAGCTACGGTAATCATTAACTTGT

1.2.2動物模型及DNA模板制備

1.2.2.1田鼠巴貝蟲動物模型取紅細胞染蟲率為60%的田鼠巴貝蟲感染 BALB/c小鼠血，置EDTA抗凝管中，再在無菌條件下按1∶2比例加入0.9%生理鹽水稀釋使蟲密度為20%，接種正常BALB/c小鼠，每只腹腔注射0.1 mL。接種后每日涂血片觀察紅細胞染蟲率。至感染后第7天，紅細胞染蟲率達到高峰時，眼眶取血，-20 ℃，保存備用。

1.2.2.2田鼠巴貝蟲DNA提取用DNA提取試劑盒提取全蟲DNA，按說明書進行操作。

1.2.2.3Cyt b基因模板PCR測定Cyt b基因PCR反應體系為25 μL:10×PCR Buffer 2.5 μL，Taq DNA酶(5 U/μL)0.15 μL，dNTPs(2.5 mmol/μL)2 μL，上游引物(10pmol/μL)1 μL，下游引物(10 pmol/μL)1 μL，Template 1 μL，ddH2O 18.35 μL 。PCR擴增：94 ℃變性5 min進入循環，94 ℃ 45 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 70 s，35個循環后72 ℃保溫10 min。同時設置空白陰性對照。得到的產物用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測后回收、純化，測序鑒定最后測定濃度為以后反應作為模板。

1.2.3LAMP反應條件確定

1.2.3.1反應溫度LAMP反應體系根據E.Z.N.A. Viral Kit試劑盒說明書進行，反應分別在61 ℃、62 ℃、63 ℃、64 ℃、65 ℃下進行，以確定最佳反應溫度。

1.2.3.2LAMP擴增產物測定LAMP Real Time Turbidimeter LA-302儀檢測擴增曲線，反應時加入1 μL熒光染料觀察顏色變化，或取5 μL田鼠巴貝蟲 LAMP反應產物，加1 μL 6×loading buffer，于2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，觀察是否有梯狀條帶產生。

1.2.4LAMP效果測試

1.2.4.1特異性試驗以田鼠巴貝蟲細胞色素B基因進行LAMP反應，觀察濁度儀實時擴增曲線，產物采用瓊脂糖凝膠電泳和加入鈣黃綠素觀察結果。另有10份間日瘧原蟲、10份惡性瘧原蟲、2份卵形瘧原蟲、3份三日瘧原蟲、1份諾氏瘧原蟲、5份岡地弓形蟲、5份利什曼原蟲、1份岡比亞錐蟲、10份田鼠巴貝蟲DNA樣。分別進行PCR和LAMP實驗，產物采用瓊脂糖凝膠電泳和濁度儀實時擴增曲線觀察結果。

1.2.4.2靈敏度試驗檢測基因的重組質粒PET28a-CytB濃度，10倍稀釋法稀釋并以此為模板進行LAMP實驗，觀察濁度儀實時擴增曲線或瓊脂糖凝膠電泳結果，并計算其檢測限。

1.2.4.3重復性實驗每個反應同樣條件下重復3次，以保證方法的穩定性。

1.2.5FTA-LAMP試驗1.2.5.1FTA卡采集感染鼠血液樣本同1.2.2.1所述方法，建立田鼠巴貝蟲感染小鼠模型，于感染前及感染后21 d連續采集實驗鼠尾靜脈血，涂血片觀察染蟲率，并點于FTA卡片上，室溫保存備用。

1.2.5.2FTA卡DNA模板提取取出點有田鼠巴貝蟲感染鼠血樣的FTA卡，按FTA卡操作說明步驟操作。用打孔器取直徑為2 mm的濾紙片，置于1.5 mL EP管中，加入FTA 純化試劑 200 μL置于室溫下5 min,棄掉液體重復3遍，將裝有濾紙片的EP管置于56 ℃干燥30 min后，進行PCR和LAMP檢測。

1.2.5.3PCR與LAMP對比檢測將處理樣本移入到PCR管中，加入10×PCR Buffer 2.5 μL，Taq DNA酶(5 U/μL)0.15 μL，dNTPs(2.5 mmol/μL)2 μL，上游引物(10 pmol/μL)1 μL，下游引物(10 pmol/μL)1 μL，ddH2O 18.35 μL。反應條件：94 ℃變性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，反應25個循環，最后72 ℃延伸5 min。LAMP反應體系根據E.Z.N.A. Viral Kit試劑盒說明書進行，64 ℃，60 min。

1.2.6LAMP應用實驗對臨床采集的20份PCR檢測陽性的田鼠巴貝蟲感染病例血液采用初步建立的LAMP法進行檢測。

2結果

2.1田鼠巴貝蟲LAMP反應溫度及引物的確定LAMP反應結束后，用LAMP Real Time Turbidimeter LA-302儀檢測擴增曲線，陽性可以觀察到擴增曲線，陰性則觀察不到(圖1)。2%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，陽性可以觀察到梯狀條帶，陰性對照則無條帶出現(圖2)。反應時加入1 μL熒光染料觀察顏色變化，可觀察到陽性反應管顏色變為綠色，陰性對照則為橙色。64℃的溫度LAMP反應速度最快，29 min開始擴增，54 min達到最高峰，以64 ℃為最佳溫度(圖3)，4套引物中，引物1于22 min時開始反應，47 min達到了高峰值，遠較其它三組引物反應的時間都短，因此以引物1為最好(圖4)。

圖1　LAMP檢測濁度儀擴增曲線圖Fig.1　LAMP detection of the amplification curve of the turbidity

M.DNA Marker II；1.陰性樣品LAMP擴增結果；2.陽性樣品LAMP擴增結果

M：DNA Marker; 1： LAMP product of negative samples;2：LAMP product of positive samples

圖2LAMP檢測產物瓊脂糖凝膠電泳圖

Fig.2LAMP productdetected by agarose gel electrophoresis

圖3　不同溫度條件下LAMP檢測擴增曲線圖Fig.3　The amplification curve of LAMP under different temperature conditions

圖4　不同引物LAMP檢測擴增曲線圖Fig.4　The amplification curve of LAMP with different primers

2.2特異性試驗結果以引物1在64 ℃的溫度下做LAMP反應對間日瘧原蟲、惡性瘧原蟲、卵形瘧原蟲、三日瘧原蟲、諾氏瘧原蟲、岡地弓形蟲、利什曼原蟲和岡比亞錐蟲等感染者血樣進行檢測，另用PCR方法與其作對照檢測，瓊脂糖凝膠電泳和濁度儀實時擴增曲線觀察結果。驗證田鼠巴貝蟲LAMP檢測方法的特異性。結果表明，僅以田鼠巴貝蟲的基因組DNA為模板的反應管呈陽性，其他寄生蟲均為陰性(表2、圖5)。

A

B

M：DNA Marker；1：正常鼠對照組；2：正常人對照組；3：間日瘧病人；4：惡性瘧病人；5：卵形瘧病人；6：三日瘧病人；7：諾氏瘧病人；8：岡地弓形蟲病人；9：利什曼病人；10：岡比亞錐蟲病人；11：田鼠巴貝蟲感染者；12：田鼠巴貝蟲感染鼠

M：DNA Marker; 1：Mouse DNA; 2：Human DNA; 3：Vivax malaria patientsDNA; 4： Falciparum malaria patients DNA; 5：. Plasmodium falciparumpatients DNA; 6： Malaria quartana patients DNA; 7： Plasmodium falciparum malariapatients DNA; 8： Toxoplasma gondii patientsDNA; 9： Leishmania patientsDNA; 10： Castellanella gambiense patientsDNA; 11： B.microti patients DNA; 12： B.microti in mouse DNA

圖5PCR/LAMP特異性產物瓊脂糖凝膠電泳圖

Fig.5PCR/LAMPproductsdetected by agarose gel electrophoresis

2.3靈敏度實驗結果

通過以10倍稀釋法稀釋的細胞色素B基因為模板進行LAMP擴增和PCR擴增，采用瓊脂糖凝膠電泳和濁度儀實時擴增曲線觀察結果。結果表明，所建立的田鼠巴貝蟲LAMP檢測方法的檢測限達到了0.687 fg/μL(圖6)，PCR方法的檢測限是0.687 pg/μL(圖7)。

表2田鼠巴貝蟲FTA-LAMP交叉反應試驗結果

Tab.2FTA-LAMP cross reaction test results of B.babesia

基因組類別Genomes樣本數SamplesPCR陽性PCRpositivesLAMP陽性LAMPpositives正常鼠基因組/MouseDNA1000正常人基因組/HumanDNA1000間日瘧病人/VivaxmalariapatientsDNA1000惡性瘧病人/FalciparummalariapatientsDNA1000卵形瘧病人/PlasmodiumfalciparumpatientsDNA200三日瘧病人/MalariaquartanapatientsDN/A300諾氏瘧病人/PlasmodiumfalciparummalariapatientsDNA100弓形蟲病人/ToxoplasmagondiipatientsDNA500利什曼原蟲病人/LeishmaniapatientsDNA500岡比亞錐蟲病人/CastellanellagambiensepatientsDNA100田鼠巴貝蟲感染者/B.microtipatientsDNA101010田鼠巴貝蟲感染鼠/B.microtiinmouseDNA101010

A

BM: DNA Marker；1-9為不同稀釋度的目標DNA：1:6.87 ng/μL；2:0.687 ng/μL；3: 68.7 pg/μL；4: 6.87 pg/μL；5: 0.687 pg/μL；6: 68.7 fg/μL；7: 6.87 fg/μL；8: 0.687 fg/μL；9: 0.0687 fg/μL。

M: DNA Marker; 1-9 for different concentrations of DNA 1: 6.87 ng/μL; 2: 0.687 ng/μL; 3: 68.7 pg/μL; 4: 6.87 pg/μL圖6不同濃度田鼠巴貝蟲LAMP產物濁度曲線及瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.6LAMPproductsdetected byturbidity meter or agarose gel electrophoresiL; 5: 0.687 pg/μL; 6: 68.7fg/μL; 7: 6.87 fg/L; 8: 0.687 fg/μL; 9: 0.0687 fg/μL.M:DNA Marker；1～9為不同稀釋度的目標DNA：1:6.87 ng/μL；2:0.687 ng/μL；3:68.7 pg/μL；4:6.87 pg/μL；5:0.687 pg/μL；6:68.7 fg/μL；7:6.87 fg/μL；8:0.687 fg/μL；9:0.0687 fg/μL。

M:DNA Marker; 1- 9 for different concentrations of DNA 1: 6.87 ng/μL; 2: 0.687 ng/μL; 3: 68.7 pg/μL; 4: 6.87 pg/μL; 5: 0.687 pg/μL; 6: 68.7 fg/μL; 7: 6.87 fg/μL; 8: 0.687 fg/μL; 9: 0.0687 fg/μL

圖7不同濃度田鼠巴貝蟲PCR瓊脂糖凝膠電泳圖

Fig.7PCR productsdetected by agarose gel electrophoresis

2.4LAMP應用實驗對臨床采集20份疑似田鼠巴貝蟲感染的病例血液DNA，已驗證其PCR為陽性，用LAMP檢測方法結果圖。

M:DNA Marker；-，陰性樣本；+，陽性樣本；1～20:20份田鼠巴貝蟲感染的病例血液DNA。M: DNAMarker; -, negative samples; +, positive samples; 1～20,20 B.microti patients DNA圖8　LAMP產物瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.8　LAMP productsdetected by agarose gel electrophoresis

2.5FTA-LAMP連續采集21 d感染小鼠的血液，顯微鏡下觀察血涂片感染率，如下圖9所示，用FTA卡保存血樣，用PCR和LAMP檢測結果圖10,11所示。

圖9　田鼠巴貝蟲感染小鼠21 d鏡檢感染率Fig.9　The infection rate of 21 days in mice with B.microti

M:DNA Marker；0，陰性樣本；1～21:分別是FTA卡保存田鼠巴貝蟲感染小鼠21 d血液DNA。M:DNA Marker; 0, negative samples; 1～21: FTA card stored mice blood DNA infected with B.microti 21consecutive days 圖10　田鼠巴貝蟲感染小鼠21 d血液FTA-PCR結果Fig.10　The FTA-PCR products of 21 days in mice with B.microti

M:DNA Marker；0，陰性樣本；1～21:分別是FTA卡保存田鼠巴貝蟲感染小鼠21 d血液DNA。M:DNA Marker; 0, negative samples; 1～21: FTA card stored mice blood DNA infected with B.microti 21 consecutive days 圖11　田鼠巴貝蟲感染小鼠21 d血液FTA-LAMP結果Fig.11　The FTA-LAMP products of 21 days in mice with B.microti

3討論

環介導等溫擴增技術(LAMP)是由日本學者 Notomi等[2]首先提出來的一種全新高效的核酸擴增技術，其特點是針對靶基因的6個獨立在鏈置換 DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)的作用下，不需要模板的熱變性，在水浴恒溫(60～65 ℃)，反應30～60 min內將自有幾個拷貝的靶核酸即可擴增到109水平[9]。LAMP技術在核酸合成過程中，從脫氧核酸三磷酸基質(dNTPs) 中析出的焦磷酸根離子與反應溶液中的鎂離子結合，產生大量白色焦磷酸鎂沉淀。因此，可以把渾濁度作為反應的重要指標。操作人員只需用肉眼觀察白色渾濁沉淀，就能鑒定擴增與否，而不需要長時間的溫度循環，繁瑣的電泳以及借助儀器觀察LAMP整個檢測反應只需1.5 h～2.5 h[1,10]，在 LAMP反應終產物中添加染料，直接可用肉眼鑒別明顯的顏色差異[11-15]。LAMP敏感性高、特異性強、操作簡便、等溫高效[16-18]?？梢詫⒒虻臄U增和產物的檢測同步完成，而且不需要昂貴的儀器設備，也沒有復雜的操作步驟，擴增結果可以用肉眼直接觀察，非常適用于普通實驗室和基層單位推廣，因此建立田鼠巴貝蟲 LAMP診斷技術將會有很大的應用前景。

本研究以田鼠巴貝蟲基因組中特異性序列細胞色素B為目的基因，根據LAMP反應原理及引物設計原則，經過優化反應溫度后篩選出合適的引物。結果表明，61 ℃，32 min開始擴增，58 min達到高峰；62 ℃ 32 min開始擴增，56 min達到高峰; 63 ℃ 34 min開始擴增，58 min達到高峰；64 ℃ 29 min開始擴增，54 min達到最高峰；65 ℃ 36 min開始擴增，62 min達到高峰。相比較而言64 ℃的溫度LAMP反應速度最快，64 ℃為最佳溫度。引物1于22 min時開始反應，47 min達到了高峰值；引物2于37 min時開始反應；引物3于47 min時開始反應；引物4于35 min時開始反應。引物1遠較其它三組引物反應的時間都短，后3組引物在80 min時實驗結束時還未達到高峰，反應時間過長可能會增加假陽性率，所以選擇引物1做為實驗引物。田鼠巴貝蟲 LAMP檢測方法的靈敏度非常高，在田鼠巴貝蟲 DNA含量只有0.687 fg/μL時，也能夠檢測出，而PCR的最低檢測量為0.687 pg/μL。由于LAMP的高靈敏度，其也相對易產生假陽性結果，本實驗通過，加樣與檢測分實驗區，不開蓋檢測，來降低其假陽性率。特異性實驗結果表明，在所檢測的11種基因組中未有假陽性假陰性，特異性達到100%。但由于所能獲得的相關寄生蟲種類有限，所以其特異性還有待更多的寄生蟲基因組樣本進一步驗證。另外，FTA卡提取DNA的PCR/LAMP結果與鏡檢觀察染蟲率結果符合，FTA卡保存的血液可以長期保存，攜帶方便。實驗證明，試劑盒直接提取血液內DNA樣，長期保存后，DNA易降解，使得實驗無法重復，可能與試劑盒提取DNA中含有一些雜質有關。但FTA卡在干燥的環境中，保存血樣相對較穩定，樣本DNA也可以長期保存，方便現場大量樣本采集、攜帶、貯存。所以FTA-LAMP方法快速靈敏、操作簡單、設備要求低，可用于田鼠巴貝蟲感染的現場快速檢測。

參考文獻：

[1] Lobo CA, Rodriguez M, Cursino-Santos JR.Babesia and red cell invasion[J]. Curr Opin Hematol, 2012, 19(3): 170-175.DOI: 10.1097/MOH.0b013e328352245a

[2] Salem GH, Liu XJ, Johnsrude JD, et al. Development and evaluation of an extra chromosomal DNA-based PCR test for diagnosing bovine babesiosis[J]. Mol Cell Probes, 1999, 13(2): 107-113.DOI:10.1006/mcpr.1998.0223

[3] Fu SL, Liu JW, Ren TH, et al. Research on application of FTA filters in preparation of DNA template[J]. Chinese Journal of Health Laboratory Technology, 2008, 18(6): 1124-1125.(in Chinese)

付素蘭, 劉景武, 任天紅, 等. FTA 卡在模板 DNA 制備中的應用研究[J]. 中國衛生檢驗雜志, 2008, 18(6): 1124-1125.

[4] Nuchprayoon S, Saksirisampant W, Jaijakul S, et al. Flinders technology associates (FTA) filter paper-based DNA extraction with polymerase chain reaction (PCR) for detection of Pneumocystis jirovecii from respiratory specimens of immunocompromised patients[J]. J Clin Lab Anal, 2007, 21(6): 382-386. DOI: 10.1002/jcla.20200

[5] Moscoso H, Thayer SG, Hofacre CL, et al. Inactivation, storage, and PCR detection of mycoplasma on FTA filter paper[J]. Avian Dis, 2004, 48(4): 841-850. DOI: 10.1637/7215-060104

[6] Inoue R, Tsukahara T, Sunaba C, et al.Simple and rapid detection of the porcine reproductive and respiratory syndrome virus from pig whole blood using filter paper[J]. J Virol Methods, 2007, 141(1): 102-106. DOI:10.1016/j.jviromet.2006.11.030

[7] Abdelwhab EM, Lschow D, Harder TC, et al. The use of FTA filter papers for diagnosis of avian influenza virus[J]. J Virol Methods, 2011, 174(1): 120-122. DOI:10.1016/j.jviromet.2011.03.017

[8] Moscoso H, Raybon EO, Thayer SG, et al. Molecular detection and serotyping of infectious bronchitis virus from FTA filter paper[J]. Avian Dis, 2005, 49(1): 24-29. DOI: 10.1637/7220

[9] Nagamine K, Watanabe K, Ohtsuka K, et al. Loop-mediated isothermal amplification reaction using a nondenatured template[J]. Clin Chem, 2001, 47(9): 1742-1743.

[10] Notomi T, Okayama H, Masubuchi H, et al. Loop-mediated isothermal amplification of DNA[J]. Nuleic Acids Res, 2000, 28(12): e63-e63. DOI: 10.1093/nar/28.12.e63

[11] Iwamoto T, Sonobe T, Hayashi K. Loop-mediated isothermal amplification for direct detection of Mycobacterium tuberculosis complex, M. avium, and M. intracellulare in sputum samples[J]. J Clin Microbiol, 2003, 41(6): 2616-2622. DOI:10.1128/JCM.41.6.2616-2622.2003

[12] Parida M, Horioke K, Ishida H, et al. Rapid detection and differentiation of dengue virus serotypes by a real-time reverse transcription-loop-mediated isothermal amplification assay[J]. J Clin Microbiol, 2005, 43(6): 2895-2903.DOI: 10.1128/JCM.43.6.2895-2903.2005

[13] Hill J, Beriwal S, Chandra I, et al. Loop-mediated isothermal amplification assay for rapid detection of common strains of Escherichia coli[J]. J Clin Microbiol, 2008, 46(8): 2800-2804.DOI: 10.1128/JCM.00152-08

[14] Curtis KA, Rudolph DL, Owen SM. Rapid detection of HIV-1 by reverse-transcription, loop-mediated isothermal amplification (RT-LAMP)[J]. J Virol Methods, 2008, 151(2): 264-270. DOI:10.1016/j.jviromet.2008.04.011

[15] Lu CB, Luo L, Yang MJ, et al. Colorimetric Detection of HPV6 and HPV16 by Loop Mediated Isothermal Amplification[J].Chinese Journal Of Virology, 2011, 27(1): 64-70. (in Chinese)

蘆春斌, 羅樂, 楊夢婕, 等. 基于顏色判定的環介導等溫擴增技術檢測 HPV6 和 HPV16[J]. 病毒學報, 2011, 27(1): 64-70.

[16] Toriniwa H, Komiya T. Rapid detection and quantification of Japanese encephalitis virus by real-time reverse transcription loop-mediated isothermal amplification[J]. Microbiol Immunol, 2006, 50(5): 379-387. DOI: 10.1111/j.1348-0421.2006.tb03804.x

[17] Yu CX, Yin XR, Wang J, et al. Creation and use of a LAMP kit to rapidly detect snails infected with Schistosoma japonicum[J].Journal of Pathogen Biology, 2011, 6(2): 121-124.(in Chinese)

余傳信, 殷旭仁, 王介, 等. 快速檢測日本血吸蟲感染性釘螺 LAMP 試劑盒的建立及應用興[J]. 中國病原生物學雜志, 2011, 6(2): 121-124.

[18] Wang C, Yu CX, JI MJ, et al. Use of loop-mediated is othermal amplification ( LAMP)to detect whole blood samples infected withSchistosoma japonicum[J].Journal of Pathogen Biology,2010, 5(10): 749-753.(in Chinese)

王岑, 余傳信, 季旻珺, 等. 環介導同溫擴增檢測全血日本血吸蟲 DNA 的研究[J]. 中國病原生物學雜志, 2010, 5(10): 749-753.

DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2016.05.004

通信作者：陳家旭，Email: chenjiaxu1962@163.com

中圖分類號：R382

文獻標識碼：A

文章編號：1002-2694(2016)05-435-07

收稿日期：2015-12-16修回日期：2016-02-26

Development of loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assay combined with FTA card for detectingBabesiamicroti

WU Fen, CAI Yu-chun, QIN Zhi-qiang, AI Lin, LU Yan,CHEN Shao-hong, WU Xiu-ping, CHEN Jia-xu

(NationalInstituteofParasiticDiseases,ChineseCenterforDiseaseControlandPrevention,KeyLaboratoryofParasiteandVectorBiology,MinistryofHealth,WHOCollaboratingCenterforMalaria,SchistosomiasisandFilariasis,Shanghai200025,China)

Abstract:The aim was to establish sensitive, specific and high-performance method of loop-mediated isothermal amplification (LAMP) combined with Flinders Technology Associates (FTA) card for detection of Babesia microti. According to the published sequences of B. microti in GenBank, many pairs of primers were designed targeting the conserved region of Cytochrome B gene of B. microti. The amplification was monitored by LAMP Real Time Turbidimeter LA-320. Through optimizing the LAMP primers and reaction conditions, a rapid and specific detection of B. microti was established. Meanwhile, the amplified products were colored by Calcein that could be detected with naked eyes, and also detected by agarose gel electrophoresis. The method of LAMP showed a highly efficient amplification for B. microti target gene which performed at 64 ℃ for 1h by the LAMP Real Time Turbidimeter LA-320. The detection limit was 0.687 fg/μL higher than PCR, no cross reaction with Plasmodium vivax, P. falciparum, P. ovale, P. malariae, P. knowlesi, Toxoplasma gondii, Leishmania donovani, and Trypanosoma gambiense. Blood samples of twenty individuals of positive for B. microti detection with PCR were detected by the established LAMP assay, and the coincidence rate was 100%. FTA-LAMP method for testing the specific cytochrome B gene of Babesia microti is successfully established, with high sensitivity, specificity andsimplicity，and is suitable for field detection.

Key words:Babesia microti; loop-mediated isothermal amplification (LAMP); FTA card; cytochrome B gene Corresponding author: Chen Jia-xu，Email:chenjiaxu1962@163.com

公益性衛生行業科研專項經費資助項目(No.201202019)和上海市衛生計生委青年基金項目(No.20154Y0155)聯合資助