我國西南城市地區人芽囊原蟲的流行病學特征

張順先，田利光，盧　艷，李蘭花，陳家旭，周曉農

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我國西南城市地區人芽囊原蟲的流行病學特征

張順先，田利光，盧艷，李蘭花，陳家旭，周曉農

摘要:目的了解我國城市地區人芽囊原蟲的流行病學特征和基因型分布，為人芽囊原蟲的防治提供科學參考依據。方法在云南省昆明市4家哨點醫院收集腹瀉病例糞便樣本1 121份，非腹瀉人群糞便樣本319份，使用結構化問卷收集研究對象基本信息，提取糞便基因組并采用PCR方法進行檢查，對可疑陽性PCR產物進行測序，通過序列比對進行確診，并通過進化樹構建進行基因分型。結果人芽囊原蟲在全年齡組腹瀉病例中檢出率為4.2%；在女性腹瀉人群中的檢出率高于男性腹瀉人群中的檢出率(5.5%，2.9%；P=0.027，OR=1.98,95%CI=1.07-3.67)；在不同年齡組腹瀉人群中，人芽囊原蟲的檢出率沒有差異(χ2=3.933，P=0.950)；但具有明顯季節分布特征(χ2=11.8，P<0.05)；人芽囊原蟲的檢出率在城區、農村以及城鄉結合部的腹瀉人群中沒有差異(χ2=2.427，P=0.297)。在腹瀉人群和非腹瀉人群中，人芽囊原蟲I型基因型都占絕對優勢。結論人芽囊原蟲依舊是西南城市地區感染人群的常見腸道寄生蟲之一，感染主要以I型基因型為主，其致病性和基因型分布需持續研究和探索。

關鍵詞：人芽囊原蟲；基因型；腹瀉病例；非腹瀉研究對象

人芽囊原蟲是人和動物腸道重要的寄生蟲之一，于1912年首次從人類糞便中分離出來，并曾經被認為是寄生在人體腸道的一種非致病性酵母菌[1],1967年Zierdt等研究者根據其形態學、生理學特征、生長特性及對抗原蟲藥物有效等特征將其歸為原蟲，并認為人芽囊原蟲可能與消化道疾病有關[2],之后人芽囊原蟲逐漸引起重視。人芽囊原蟲在世界范圍內廣泛分布但流行程度在不同地域間有很大差異，在發達國家能達到1.5%～20%，在發展中國家能達到30%～60%[3]。人芽囊原蟲在熱帶、亞熱帶國家及衛生條件較差的地區感染率較高,在菲律賓腹瀉人群中人芽囊原蟲的檢出率高達13%[4]。有研究表明人芽囊原蟲是一種機會性致病病原體，在免疫缺陷的腹瀉人群中感染率可高達73.4%，同時在伴有腹瀉癥狀的艾滋病人中人芽囊原蟲和其他腸道原蟲(隱孢子蟲、藍氏賈第鞭毛蟲和溶組織阿米巴)的混合感染率高達8.6%[5]。但也有研究發現人芽囊原蟲在艾滋病人和非免疫缺陷的人群中檢出率沒有差異[6]。近年來隨著旅游的急速增長和食品安全問題的突出，人芽囊原蟲對人群健康的威脅持續增加[7]。為此本研究試圖了解我國西南城市地區人芽囊原蟲的感染負擔，描述人芽囊原蟲病流行病學特征和不同基因型的致病情況，為防治人芽囊原蟲病提供科學參考。

1材料與方法

1.1調查現場選擇云南省昆明市4家醫院作為哨點醫院，分別為云南省第一人民醫院、昆明醫科大學第一附屬醫院、昆明市兒童醫院和昆明市普吉社區醫院，在這4個哨點醫院的門診選擇腹瀉病例和非腹瀉就診者作為研究對象。

1.2研究對象

1.2.1腹瀉病例定義在2014年7月1日到2015年6月30日期間，在這4個哨點醫院就診的患者中，從就診當天算在過去24 h內腹瀉次數≥3次、且糞便形態異常、就診前未使用抗生素、且在過去2周內未出現腹瀉癥狀者定義為腹瀉病例。

1.2.2非腹瀉研究對象定義在2014年7月1日到2015年6月30日期間，在這4個哨點醫院就診的患者中，按就診當天計在過去24 h內腹瀉次數<3次、且糞便形態正常、未患有其他消化道疾病或癥狀、過去2周內未發生腹瀉的研究對象定義為非腹瀉人群，且非腹瀉研究對象與相應的腹瀉病例在年齡上不超過±4歲，在就診日期上和相應的腹瀉病例不超過±15 d。

1.3樣本采集和信息收集在2014年7月1日到2015年6月30日期間，在4個哨點醫院使用無菌采樣杯采集符合條件的腹瀉病例和非腹瀉研究對象糞便樣本，糞便量需大于3 g或3 mL。糞便樣本采集后在24 h內送到云南省疾病預防控制中心并進行低溫冷凍保存，同時使用結構化問卷采集研究對象基本信息和腹瀉人群臨床表現等信息。

1.4人芽囊原蟲的檢測及基因分型取約0.2 g糞便，按照說明書使用試劑盒(天根，中國)提取糞便樣本中人芽囊原蟲基因組，得到50 μL提取物并保存于-70 ℃。根據參考文獻[8]，在上海生工合成前引物(5′-CGAATGGCTCATTATATCAGTT-3′)和后引物(5′-TCTTCGTTACCCGTTACTGC-3′)，并在使用前配成成10 μmol濃度。取DNA模板1 μL，各加入10 μmol前、后引物1 μL，TaqMixture 12.5 μL(中國，天根)，ddH2O 10.5 μL；擴增條件：預變性94 ℃、5 min；變性94 ℃、1 min，退火53 ℃、1 min，延伸72 ℃、1 min，40循環；延伸72 ℃、10 min；產物4 ℃保存。取PCR擴增產物5 μL，在1.5%瓊脂糖凝膠中120V電泳40min, 之后在凝膠成像系統中進行觀察，目標片段260 bp。將疑似陽性的PCR產物送到上海生工進行測序，使用BLAST軟件在NCBI上將測序結果與GenBank數據庫進行比對以確診陽性,并在GenBank上下載參考序列，使用Meg5.0軟件將確認陽性的序列與參考序列進行分析以確定基因亞型。

1.5數據的統計學分析使用SPSS19.0軟件(SPSS,IBM)進行數據分析，分類資料的計算采用卡方檢驗或Fisher法；定量數據根據數據特征選擇t檢驗、方差分析或秩和檢驗。P<0.05為有統計學差異的標準。

2結果

2.1研究對象基本信息見表1。

表11 121名腹瀉病例和319名非腹瀉研究對象基本特征

Tab.1Essential characteristic of 1 121 diarrhea cases and 319 non-diarrhea subjects

特征Characteristic腹瀉病例(%)Diarrheacases(%)非腹瀉研究對象(%)Non-diarrheasubjects(%)研究數量Number1121319年齡Age中位數Median0.62.3性別比(男/女)Sexratio(Male/Female)1.001.01男性Male559(49.9)165(51.7)女性Female562(50.1)154(48.3)城市Urban753(67.2)223(69.9)城鄉結合處Rural-urbanfringezone177(15.8)69(21.6)農村Rural191(17.0)27(8.5)春季(2-4月)Spring(Feb-Apr)267(23.8)66(20.7)夏季(5-7月)Summer(May-July)200(17.8)65(20.4)秋季(8-10月)Autumn(Aug-Oct)260(23.2)89(27.9)冬季(11-1月)Winter(Nov-Jan)394(35.1)99(31.0)發熱(>37.3℃)Fever(>37.3℃)137(12.2)-嘔吐Vomiting263(23.5)-脫水Dehydration64(5.7)-糞便類型Stooltype-水樣便Waterystool510(45.5)-粘液樣便Mucusstool540(48.5)-其他糞便類型Otherstool71(6.3)-腹瀉次數Diarrheafrequency6-

如表1所示：從2014年7月到2015年6月之間，該研究總共招募1 121名腹瀉病例和319名非腹瀉研究對象，男、女性別組成在腹瀉病例和非腹瀉人群中相當，腹瀉和非腹瀉人群中來自城市地區的研究對象較多(χ2=17.291，P<0.001)。嘔吐是腹瀉病例最常見的癥狀，其次是發熱和脫水。腹瀉病例中最常見的糞便類型是粘液樣便，其次是水樣便。腹瀉病例中就診前24 h內腹瀉次數中位數為6次。

2.2人芽囊原蟲在腹瀉病例中的性別、年齡、季節和城鄉分布人芽囊原蟲在女性腹瀉病例中檢出率為5.5%(31/562)，在男性腹瀉人群中為2.9%(16/559)，這表明人芽囊原蟲在女性腹瀉病例中的檢出率高于男性腹瀉病例的檢出率(χ2=4.913，P=0.027，OR=1.98，95%CI=1.07-3.67)。盡管人芽囊原蟲的檢出率在不同年齡段腹瀉病例中有所變動，在1～2歲腹瀉病例中檢出率最高(5.6%，15/269)，其次是5～65歲(4.9%，12/244)、6～12月齡(4.6%，12/263)、65歲以上人群(3.7%，1/27)和0～6月齡(2.7%，5/186)，在2～5歲腹瀉病例中檢出率最低(1.6%，2/132)，但人芽囊原蟲的檢出率在各個年齡組腹瀉病例中沒有差異(χ2=3.933，P=0.953)。人芽囊原蟲在5歲以下腹瀉病例和5歲以上腹瀉病例中檢出率沒有差異(n=34，4.0%；n=13，4.8%；P=0.571，OR=0.57，95%CI=0.43-1.59)。人芽囊原蟲在腹瀉病例中檢出率有明顯的季節分布趨勢(χ2=11.8，P<0.05)，在春季腹瀉病例中檢出率最高(7.5%，20/267)，其次是夏季(5.0%，10/200)和冬季(2.8%，11/394)，在秋季時最低(2.3%，6/260)。盡管人芽囊原蟲在城區腹瀉人群中檢出率為4.8%(36/753)，稍高于農村地區腹瀉人群中的檢出率(3.7%，7/191)和城鄉結合處腹瀉病例中的檢出率(2.3%，4/177)，但人芽囊原蟲在不同居住區的腹瀉病例中檢出率沒有差異(χ2=2.427，P=0.297)。

2.3人芽囊原蟲基因型分布在腹瀉病例中分離到的47份人芽囊原蟲，其中人芽囊原蟲I型占97.9%(46/47)，II型占2.1%(1/47)。從5歲以下腹瀉病例中分離到的34份人芽囊原蟲中，人芽囊原蟲I型占100%(34/34),無其它基因型。在5歲以上腹瀉病例中分離到的13份人芽囊原蟲中，人芽囊原蟲I型占92.3%(12/13)，II型占7.7%(1/13)。在非腹瀉人群中檢出的11份人芽囊原蟲中，人芽囊原蟲I型占100%(11/11)。

圖1　腹瀉人群和非腹瀉人群中人芽囊原蟲的亞型分布 (●: 腹瀉病例；▲: 非腹瀉人群)

3討論

人芽囊原蟲是自然界廣泛存在的人畜共患寄生蟲之一，主要通過糞-口途徑傳播,飲用水來源、衛生條件、經濟發展水平以及氣候等因素等都是影響人感染人芽囊原蟲的重要因素。該研究發現非腹瀉人群中人芽囊原蟲感染率為4.0%，這與部分發達國家非腹瀉人群中的感染率相同，同時也和我國上海地區非腹瀉人群的感染率相當(2.95%)，此與本次調查現場的選擇有關，對象來自經濟條件較好城市地區，土地幾乎全部硬化，飲水管道化和有效氯的消毒、人群衛生習慣好，這可能是該研究中人芽囊原蟲感染率低的原因之一。而在衛生條件差的地區，如我國的西南農村地區人芽囊原蟲感染率很高(32.6%)[9]，為當地主要的公共衛生問題之一。

該研究發現不同年齡段腹瀉病例中人芽囊原蟲的感染率無差異，這與其他研究結果相符[9]，顯示年齡不是影響人芽囊原蟲感染的因素，同時也暗示人芽囊原蟲在體內不能引發持續的保護性免疫，再次感染在其一生中可不斷發生，從另一個側面提示我們改善環境衛生、關注食品安全及防止食源性污染可能是降低人芽囊原蟲感染的有效途徑。

在我國人芽囊原蟲一般采用直接涂片觀察法、體外培養法及甲醛-乙醚沉淀法等，相比PCR而言，這幾種方法檢測成本低但敏感性也低，同時漏檢率較高，從而使得人芽囊原蟲疾病負擔嚴重低估；加之近年來我國人力成本不斷增加，現場流調費用持續攀升，傳統檢測方法在一定程度上受限，而PCR方法可有效減少流調工作的天數和人力資源成本，同時與基因測序的聯合運用可提高人芽囊原蟲檢出率[8]，從而更加準確的評估人芽囊原蟲感染負擔，并可進一步進行基因分型以便研究人芽囊原蟲亞型分布特征，為其防治提供科學的參考依據。

人芽囊原蟲的基因型與其致病性可能有關，有研究顯示其不同基因型致病力可能不同，其中人芽囊原蟲III型可引起腹瀉[10]。該研究發現人芽囊原蟲I型不是引起腹瀉的亞型之一，這可能與人芽囊原蟲不同亞型的致病機制不同有關，也可能由于我們調查的范圍和樣本數量的差異造成的，另有研究表明人芽囊原蟲I型 (57.7%，90/156) 是腹瀉病例和非腹瀉人群中檢出比例最高的亞型，其次是III型 (22.4%，35/156) 和II型號(12.8%，20/156)[11]；但也有研究表明人芽囊原蟲III型 (61.90%)是腹瀉人群中最主要的亞型，其次是I型 (19.05%) 和II型 (19.05%)[7]，而該研究發現人芽囊原蟲I型在腹瀉病例和非腹瀉人群中都是占絕對優勢的亞型，同時未發現人芽囊原蟲III型，這可能與人芽囊原蟲亞型的地理分布有關，也可能與不同基因型與不同宿主和寄存環境等因素有關[9]。該研究結論由于抽樣誤差等因素的影響，在外推時受到一定限制。擴大樣本量，在不同地域、不同溫帶和經緯度地區選取代表性人群進行研究人芽囊原蟲感染負擔、基因型分布及與腹瀉之間的關聯，可為人芽囊原蟲的預防和控制提供更科學的參考依據。

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DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2016.05.002

通訊作者：陳家旭:chenjiaxu1962@163.com；

作者單位：中國疾病預防控制中心寄生蟲病預防控制所，衛生部寄生蟲病原與媒介生物學重點實驗室，世界衛生組織熱帶病合作中心，國家級熱帶病國際聯合研究中心，上海 200025

中圖分類號：R382

文獻標識碼：A

文章編號：1002-2694(2016)05-424-05

Corresponding authors: Chen Jia-xu, Email: chenjiaxu1962@163.com; Zhou Xiao-nong, Email: ipdzhouxn@sh163.net

收稿日期：2015-11-20修回日期：2016-01-17

Epidemiological characteristics ofBlastocystishominisin urban region, southwestern China

ZHANG Shun-xian, TIAN Li-guang, LU Yan, LI Lan-hua, CHEN Jia-xu, ZHOU Xiao-nong

(NationalInstituteofParasiticDiseases,ChineseCenterforDiseaseControlandPrevention;KeyLaboratoryforParasitologyandVectorBiology,MOHofChina;WHOCollaboratingCenterforTropicalDiseases,NationalCenterforInternationalResearchonTropicalDiseases,Shanghai200025,China)

Abstract:We investigated the epidemiological characteristics and the genotype distribution of Blastocystis hominis in urban region of southwest China, and the study may provide scientific references for the prevention and treatment of Blastocystis hominis. A total of 1 121 diarrhea patients and 319 healthy controls were selected from four sentinel hospitals in Kunming of southwest China from June 2014 to July 2015. The stool specimens were collected to detect the Blastocystis hominis with PCR. A structured questionnaire was applied to each diarrhea case and healthy control after stool samples collection for their clinical manifestation (e.g. vomiting, fever and dehydration), demographic data (age, sex and residence) and types of the stool samples (watery, mucoid, or bloody and other forms); the phylogenetic trees were constructed using the neighbor-joining method with 1 000 bootstrap replicates; reference strains were downloaded from the GenBank. Results showed that the detection rate of Blastocystis hominis was 4.2% in diarrhea cases; the prevalence of Blastocystis hominis in female was higher than that of in male (5.5%, 2.9%, P=0.027, OR=1.98, 95%CI=1.07-3.67); no significant difference was found among diarrhea cases with different age groups infected with Blastocystis hominis (χ2=3.933, P=0.950); however, there was remarkable seasonal trend for Blastocystis hominis (χ2=11.8, P<0.05); the difference in detection rate of Blastocystis hominis among diarrhea

cases from rural-urban fringe zone, urban and rural area was not significant difference (χ2=2.427,P=0.297), theBlastocystishominissubtype I was absolute dominant strain in diarrhea cases and healthy controls. In conclusion,Blastocystishominiswas still common intestinal parasites in urban population,Blastocystishominissubtype I was the most prevalence in this region, the pathogenicity and subtype distribution ofBlastocystishominisneed to be continuously studied.

Key words:Blastocystis hominis; genotype; diarrhea cases; non-diarrhea subjects Supported by the National Science and Technology Major Project (Nos. 2008ZX10004-011 and 2012ZX10004-220) and the National Natural Science Foundation of China (No. 81473022)

國家科技重大專項(No.2008ZX10004-011；2012ZX10004-220)和國家自然基金(No.81473022)聯合資助

周曉農：ipdzhouxn@sh163.net