2011年和2013年武漢市病毒性胃腸炎病原監測與分析

龐蓓蓓，周　璇，Nobumichi Kobayashi，彭勁松，王遠虹

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2011年和2013年武漢市病毒性胃腸炎病原監測與分析

龐蓓蓓1，周璇1，Nobumichi Kobayashi2，彭勁松1，王遠虹1

1.武漢市疾病預防控制中心，武漢430015；2.日本札幌醫科大學衛生系

摘要：目的監測和分析2011年和2013年武漢市嬰幼兒和成人病毒性胃腸炎病原。方法用聚丙烯酰胺凝膠電泳及RT-PCR對胃腸炎患者腹瀉大便樣本進行輪狀病毒、諾如病毒、星狀病毒以及札幌樣病毒檢測，部分樣本測序并比對同源性。用PCR檢測腺病毒。結果輪狀病毒、諾如病毒、星狀病毒、札幌樣病毒檢出率分別為21.6%(296/1 368)、35.7%(488/1 368)、10.2%(140/1 368)和7.7%(105/1 368)；腸道腺病毒在兒童患者中的檢出率為8.2%(70/853)。諾如病毒和輪狀病毒易感人群為13～24月齡和7～24月齡兒童，及40～59歲成人。輪狀病毒檢出高峰在秋冬季。星狀病毒、札幌樣病毒和腺病毒多發于2歲以下的嬰幼兒，無明顯季節分布。196人份A組輪狀病毒基因型以G9P[8]為主(40.8%)，其次為G1P[8](26.5%)，G3P[8](16.3%)和G2P[4](11.7 %)。經測序比對諾如病毒基因型分別為GⅡ.4型(7/12)，GⅡ.3型(5/12)；星狀病毒為1型(8/13)，8型(4/13)和5型(1/13)；札幌樣病毒為GI.1型(2/6)，GI 2型(2/6)和GⅡ.1型(2/6)。結論2011年和2013年武漢市嬰幼兒和成人胃腸炎主要病原是諾如病毒，其次是輪狀病毒。

關鍵詞：胃腸炎病毒；監測；基因型；輪狀病毒；諾如病毒

胃腸炎病毒是世界范圍內引起嬰幼兒以及成人急性胃腸炎的主要病原，其中輪狀病毒(RV)是引起發展中國家嬰幼兒死亡的主要病原之一；發達國家的死亡率雖然較低，但其較高的發病率仍然導致可觀的經濟損失。杯狀病毒是病毒性胃腸炎的第二類常見致病因子，其次是星狀病毒(AstV)和腸道腺病毒(EAdV)。人杯狀病毒可分為2個屬，諾如病毒(NoV)和札幌樣病毒(SaV)。其中諾如病毒是引起非細菌性急性胃腸炎暴發最主要的病原。

為了解武漢市嬰幼兒以及成人胃腸炎病毒的流行情況，本研究對武漢市2011年和2013年兩個完整年度的病毒性胃腸炎病原進行了監測和分析。雖然全國其他地區對病毒性胃腸炎的研究較多，但監測人群主要是嬰幼兒患者。本研究首次對武漢市兒童和成人開展了5種主要胃腸炎病毒的監測，首次分析了武漢市札幌樣病毒和腸道腺病毒的流行情況，為預防控制病毒性胃腸炎提供了更全面的數據。

1材料與方法

1.1樣本2011年1月-12月和2013年1月-12月從武漢市兒童醫院，湖北省人民醫院，武漢市第六醫院和武漢市商業職工醫院采集胃腸炎患者大便樣本。

1.2方法

1.2.1試劑和儀器賽百盛RNA核酸提取試劑盒和樹脂型TM基因組DNA提取試劑盒提取樣本中的RNA和DNA用于檢測NoV、AstV、SaV和EAdV。大連寶生物公司Takara One step PCR kit試劑盒用于逆轉錄-聚合酶鏈式反應(RT-PCR)擴增，PTC-100TM PCR儀進行PCR擴增反應。QIAGEN QIAxcel Advances毛細管電泳儀檢測擴增樣本并讀取結果。

表1RT-PCR、PCR檢測及測序引物

Tab.1Primers used for RT-PCR, PCR and sequencing in this study

病毒virus基因名稱Targetgene基因組Genogroup引物Primer序列(5'-3')Sequence(5'-3')核苷酸定位Nucleotideposition檢測方法Detectionmethod參考文獻RefsNorovirusCapsidGIG1SKFCTGCCCGAATTYGTAAATGA5342cRT-PCR[4]CapsidGIG1SKRCCAACCCARCCATTRTACA5671cRT-PCR[4]CapsidGIIG2SKFCNTGGGAGGGCGATCGCAA5046RT-PCR[4]CapsidGIIG2SKRCCRCCNGCATRHCCRTTRTACAT5389RT-PCR&sequencing[4]CapsidGIIG2BTGGAGGGCGATCGCAATCT5048RT-PCR&sequencing[5]RoravirusGene9RVG9GGTCACATCATACAATTCT1062-1044RT-PCR[6]Gene9aAT8GTCACACCATTTGTAAATTCG178-198RT-PCR[6]Gene9aBT1CAAGTACTCAAATCAATGATGG314-335RT-PCR[6]Gene9aCT2CAATGATATTAACACATTTTCTGTG411-435RT-PCR[6]Gene9aDT4CGTTTCTGGTGAGGAGTTG480-498RT-PCR[6]Gene9aET3CGTTTGAAGAAGTTGCAACAG689-709RT-PCR[6]Gene9aFT9CTAGATGTAACTACAACTAC757-776RT-PCR[6]Gene9con3TGGCTTCGCCATTTLATAGACA11-32RT-PCR[7][8]Gene41T-1TCTACTTGGATAACGTGC339-356RT-PCR[7][8]Gene42T-1CTATTGTTAGAGGTTAGAGTC474-494RT-PCR[7][8]Gene43T-1TGTTGATTAGTTGGATTCAA259-278RT-PCR[7][8]Gene44T-1TGAGACATGCAATTGGAC385-402RT-PCR[7][8]Gene45T-1ATCATAGTTAGTAGTCGG575-594RT-PCR[7][8]AstrovirusProtease(ORF1a)GA.GBMON340CGTCATTATTTGTTGTCATACTRT-PCR&sequencing[9]Protease(ORF1a)GA.GBMON348ACATGTGCTGCTGTTACTATGRT-PCR&sequencing[9]SapovirusCapsidSav124FGAYCASGCTCTCGCYACCTAC5078-5098RT-PCR[10][11]CapsidSav1FTTGGCCCTCGCCACCTAC700-717RT-PCR[10][11]CapsidSav5FTTTGAACAAGCTGTGGCATGCTAC5112-5135RT-PCR[10][11]CapsidSav1245RCCCTCCATYTCAAACACTA5136-5181RT-PCR[10][11]AdenovirusFAdenoC(60)ATTTCACCTACTCTGGCTCCPCR[12]FAdenoD(56)CCTGAGTTATTATGCTGGAAPCR[12]

1.2.2核酸提取參照試劑說明書和文獻進行[1]。

1.2.3RV篩查及G、P分型PAGE篩查RV[2]。半巢式RT-PCR進行G(VP7基因)、P(VP4基因)分型[3]。通過PCR不能確定基因型的樣本經測序確定。用于RV基因分型和測序的引物[4-6]見表1。

1.2.4NoV，AstV和SaV的RT-PCR及EAdV的PCR檢測用于檢測和測序的引物[7-12]見表1。

1.2.5基因測序和分析PCR擴增產物送上海生物工程技術服務有限公司測序。測序結果通過BLAST(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.)在線比對。諾如病毒基因型再通過在線基因分型軟件(http://www.rivm.nl/mpf/norovirus/typingtool)[13]確認。

2結果

2.1流行病學特征兩年共檢測1 368例樣本，其中成人樣本515例，兒童樣本853例。NoV檢出率為35.7%(488/1 368)，RV為21.6%(296/1 368)，AstV為10.2%(140/1 368)，SaV為7.7%(105/1 368)。嬰幼兒患者男女比例為1.6∶1，成人患者男女比為1∶1.2。兒童中EAdV檢出率為8.2%(70/853)。

兒童樣本中，NoV檢出率為35.9%(306/853)，在13～24月齡的嬰幼兒中檢出率最高(表2)，除了9月份和12月份外其它10個月份的檢出率均較高； 其次為RV，檢出率為26.8%(229/853)，RV檢出年齡多集中在7月～24月齡，流行季節為秋冬季(10月～次年1月)。兒童樣本AstV、SaV和EAdV的檢出率分別為13.1%(109/853)，8.9%(76/853)和8.2%(70/853)，高發于2歲以下嬰幼兒。AstV全年均有檢出，10月～12月以及次年的1月相對較高。SaV 1月～2月檢出率較高，6月、8月和9月未檢出。腺病毒主要在2歲以下的嬰幼兒中檢出，70例陽性樣本中有67例從該年齡段檢出，全年均有病例分布，以4月，5月和8月發病為主。

成人樣本中，NoV檢出率為35.3%(182/515)，RV為13.0%(67/515)，AstV為6.0%(31/515)，SaV為5.6%(29/515)，以40～59歲為高發人群。AstV和SaV在成人中各年齡段均有檢出。RV高發季節為秋冬季(10月～12月)，NoV、AstV和SaV無明顯季節性分布，其中SaV 5月、6月、9月、10月未檢出。

2.2RV基因組和基因型共檢出A組和C組輪狀病毒分別為196例和3例。196例A組輪狀病毒中2011年和2013年度檢出的分別占109例和87例。對A組RV進行G，P分型。

表2武漢市胃腸炎病毒感染年齡分布

Tab.2The age distribution of gastroenteritis viruses in Wuhan

年齡組檢測數諾如病毒輪狀病毒星狀病毒札幌樣病毒AgegroupsTestamountNoVRVAstVSaV≤6m23885(35.7)37(15.6)35(14.71)15(6.3)7m-12m440150(34.1)147(33.4)48(10.9)36(8.2)13m-24m8841(46.6)29(33.0)18(20.5)17(19.3)25m-5y5016(32.0) 8(16.0) 3(6.0) 6(12.0)6y-14y3714(37.8) 8(21.6) 5(13.5) 2(5.4)15y-19y237(30.4) 3(13.0) 3(13.0) 2(8.7)20y-29y10131(30.7)10(9.9) 3(3.0) 6(5.9)30y-39y6323(36.5) 7(11.1) 3(4.8) 3(4.8)40y-49y9136(39.6)12(13.2) 6(6.6) 1(1.1)50y-59y10334(33.0)22(21.4) 7(6.8) 7(6.8)60y-69y7126(36.6) 6(8.5) 7(9.8) 5(7.0)≥70y6325(39.7) 7(11.1) 2(3.2) 5(7.9)Total1368488(35.7)296(21.6)140(10.2)105(7.7)

注：括號內的數據為陽性率(%)

Note:Inside the parentheses is rate of positive cases

表32011年和2013年武漢市成人與兒童RNA胃腸炎病毒感染季節分布

Tab.3Seasonality of RNA gastroenteritis viruses in adults and children in 2011 and 2013 respecitively in Wuhan

月Month檢測數(Testamount)諾如(NoV)輪狀(RV)星狀(AstV)札幌樣(SaV)成人(adults)兒童(children)成人(adults)兒童(children)成人(adults)兒童(children)成人(adults)兒童(children)成人(adults)兒童(children)Jan.356020(57.1)26(43.3)4(11.4)26(43.3)7(20.0)11(18.3)18(51.4)29(48.3)Feb.387117(44.7)28(39.4)8(21.0)21(29.6)4(10.5)9(12.7)3(7.9)22(31.0)Mar.43738(18.6)30(41.1)4(9.3)14(19.2)4(9.3)8(11.0)1(2.3)3(4.1)Apr.546613(24.1)21(31.82)5(9.3)15(22.7)1(1.9)11(16.7)2(3.7)4(6.1)May237912(52.2)31(39.2)2(8.7)13(16.5)1(4.4)12(15.2)0(0)2(2.5)Jun.46706(13.0)21(30.0)2(4.3)8(11.4)1(2.2)9(12.9)0(0)0(0)Jul.5311426(49.06)44(38.60)0(0)20(17.5)2(3.8)9(7.9)1(1.9)2(1.8)Aug.583219(32.8)15(46.9)0(0)2(6.3)5(8.6)6(18.8)1(1.7)0(0)Sep.29759(31.03)13(17.3)2(6.9)12(16.0)1(3.4)6(8.0)0(0)0(0)Oct.467111(23.9)29(40.8)13(28.3)35(49.3)4(8.7)6(8.5)0(0)2(2.8)Nov.436818(41.9)27(39.7)14(32.6)32(47.1)0(0)9(13.2)1(2.3)2(2.9)Dec.477423(48.9)21(28.4)13(27.7)31(41.9)1(2.1)13(17.6)2(4.3)10(13.5)total515853182(35.3)306(35.9)67(13.0)229(26.8)31(6.0)109(12.8)29(5.6)76(8.8)

注：括號內的數據為陽性率(%)

Note:Inside the parentheses is rate of positive cases

圖1　2011年和2013年武漢市A組輪狀病毒G,P基因分型Fig.1　Genotypes of group A rotavirus in 2011 and 2013 in Wuhan

2.3NoV，AstV、SaV測序結果NoV主要的基因型別為GII.4為(7/12)，其次GII3(5/12)。GII.4型與韓國日本的流行株同源性為99%，GII.3型與貴州省流行株同源性為98%～99%。AstV主要基因型別為1型(8/13)，與北京地區流行株同源性為96%～99%，其次為8型(4/13)和5型(1/13)。6例SaV樣本中GI.1，GI.2和GII.1型均為2例。SaV GII 1與越南流行株同源性為100%。

3討論

NoV為武漢市病毒性胃腸炎散發的主要致病病原，NoV檢出率以及優勢流行株與廈門[14]相似。諾如病毒檢出率高于輪狀病毒的流行趨勢與巴西相似[15]，較武漢市之前有所升高[8]，提示流行風險加大并有暴發的可能。而2014-2015年武漢市的幾起諾如病毒聚集流行也印證這種趨勢。與武漢市2007-2010的監測數據相比，GII.3型檢出率有所上升[8]。NoV的流行在武漢市呈現上升趨勢，應引起足夠重視，強對GⅡ.4型和GII.3型NoV的監測和防控，開展有針對性的預防措施，加強相關的衛生宣傳，以防止其暴發大規模疫情。

2011年RV主要基因型為G1P[8]型2013年為G9P[8]，與寧夏[16]和武漢地區之前的流行趨勢[6]不同。這兩年武漢地區G3P[8]的檢出率僅為11.9%和21.8%，較以前出現了明顯下降[6]，與浙江和福建的報道一致[17-18]，說明武漢市RV流行主要基因型出現了轉換，需要密切關注流行趨勢的變化。RV發病較集中在冬季10月-12月，故應根據流行特點實施相應的預防措施，更有效的減少其危害。目前本地區輪狀病毒的優勢基因型較以往也有所變化，理論上有必要相應調整疫苗成分，優化防控效果。

AstV和SaV陽性率較低，AstV基因型1型與北京地區流行株同源性較高，這與本地以往研究相同[19]。由于樣本量及檢出率較低，SaV分布規律不明顯，主要型別與越南流行株同源性較高。

兒童中EAdV總檢出率較低，全年各個月份都有分布，但相對集中于4-9月，與寧夏流行趨勢類似[16]。發病年齡集中在2歲以內，因此應該加強2歲以內嬰幼兒的預防并重視由其引起的腹瀉的治療。國內的相關研究報導較少，因此國內的相關流行病學研究仍需加強，以便更好地掌握其流行趨勢，為防控腺病毒所致的胃腸炎提供決策依據。

雖然目前AstV、SaV和EAdV的檢出率相對較低，其暴發的危害性不如RV和NoV，但是更加深入了解這兩類病毒的流行及變異趨勢，才能為有效控制和應對可能的流行做好準備。

目前胃腸炎病毒主要的感染人群仍然是2歲以下的嬰幼兒，并多發于冬季。應針對性加強高發月份幼兒園、游樂場等幼兒集中場所的消毒和監督管理工作，并對高危人群在適當的季節結合其流行病學特點進行針對性強的免疫。

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DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2016.05.008

通訊作者：王遠虹，Email:wyhhyc@163.com

中圖分類號：R373.2

文獻標識碼：A

文章編號：1002-2694(2016)05-457-05

收稿日期：2015-08-01修回日期：2016-03-17

Surveillance and analysis of the pathogens of viral gastroenteritis in 2011 and 2013，Wuhan，China

PANG Bei-bei1, ZHOU Xuan1, Nobumichi Kobayashi2, PENG Jin-song1, WANG Yuan-hong*

(1WuhanCentersforDiseasePreventionandControl,Hubei430015,China；2DepartmentofHygiene,SapporoMedicalUniversitySchoolofMedicine,Sapporo,Japan)

Abstract：To survey and analyze the pathogens of viral gastroenteritis among infants and adults in 2011 and 2013 in Wuhan, the stool samples were detected for the rotavirus, norovirus, astrovirus and sapovirus by polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE), RT-PCR and PCR. The nucleotide sequences of partial positive samples were determined and their identities were analyzed by BLAST and/or genotyping tool online. The detection rates of rotavirus, norovirus, astrovirus, sapovirus were 21.6%(296/1 368), 35.7%(488/1 368),10.2%(140/1 368) and 7.7% (105/1 368),respectively. The detection rate of adenovirus in children was 8.2% (70/853).The detection rates of norovirus and rotavirus were higher in 13-24 months and 7-24 months age groups, respectively, and 40-59 years old age group. The detection rate of rotavirus was higher in autumn and winter. Astrovirus, sapovirus and adenovirus were more frequently detected in children under 2 years old. Seasonality was not observed in astrovirus, sapovirus or adenovirus. The genotypes of 196 group A rotavirus were determined. Of these, the most frequent were G9P[8](40.82%), followeing by G1P[8](26.53%), G3P[8](16.33%)and G2P[4](11.73%). The genotypes of norovirus were GII 4(7/12) and GII 3(5/12), and that of astrovirus were type 1(8/13)，type 8(4/13) and type 5(1/13). The genotypes of sapovirus were GI.1(2/6), GI.2 (2/6) and GII.1 (2/6). The main pathogens of viral gastroenteritis were norovirus and rotavirus in 2011 and 2013, in Wuhan.

Key words:gastroenteritis virus; surveillance; genotype; rotavirus; norovirus Supported by National Natural Science of Foundation of China (No.81071352), the Scientific Research Foundation of Health and Family Planning Commission of Wuhan (Nos. WG09C08, WG12C03)Corresponding author: Wang Yuan-hong, Email: wyhhyc@163.com

國家自然科學基金(No. 81071352)、武漢市衛計委科研課題(No.WG09C08)和(No. WG12C03)聯合資助