單增李斯特菌三重實時熒光PCR檢測的建立及其毒力基因在分離菌株中分布

劉二龍，袁慕云，呂英姿，陳　穎，王　娉，許龍巖，李嘉琪，鄭高彬，杜雅萍，林學勤

?

單增李斯特菌三重實時熒光PCR檢測的建立及其毒力基因在分離菌株中分布

劉二龍1，袁慕云2，呂英姿1，陳穎3，王娉3，許龍巖2，李嘉琪1，鄭高彬1，杜雅萍1，林學勤1

1.黃埔出入境檢驗檢疫局，廣州510730；2. 廣東出入境檢驗檢疫局，廣州510623；3.中國檢驗檢疫科學研究院，北京100025

摘要:目的建立同時檢測單增李斯特菌(Listeria monocytogenes，Lm)溶血素基因hlyA、內化素基因inlA和磷脂酶C基因plcB的TaqMan-MGB三重實時熒光PCR檢測方法，并對101株單增李斯特菌的hlyA、inlA和plcB基因進行了檢測，分析3個毒力基因在多位點序列分型(Multilocus sequence typing，MLST)聚類群組中的分布情況。方法根據單增李斯特菌毒力基因hlyA、inlA和plcB的保守序列設計引物和小溝結合物(minor groove binder,MGB)探針建立三重熒光PCR方法，對其特異性、靈敏度和可重復性進行了測試，并對分離的101株單增李斯特菌進行三重PCR檢測。結果建立的三重實時熒光PCR方法特異于單增李斯特菌的檢測，重復性良好，組內Ct值變異系數均小于1.5%,靈敏度可達100 CFU/mL。對101株單增李斯特菌的hlyA、inlA和plcB的檢出率分別為98%、75%和98%。在可被MLST分型的89株菌株中，groupI的30株菌株有20株均缺失inlA基因；groupII的57株菌株中有56株三個基因均檢出;groupIII的菌株hlyA、inlA和plcB三個基因均未檢出。結論本文建立的三重實時熒光PCR方法能準確、快速、穩定的檢測單增李斯特菌，101株單增李斯特菌的hlyA、inlA、plcB三個毒力基因的檢出情況與單增李斯特菌的MLST分型聚類有較一致的關系，對分析單增李斯特菌毒力的強弱有重要參考意義。

關鍵詞:單增李斯特菌；TaqMan-MGB三重實時熒光PCR;毒力基因分布; 多位點序列分型

單增李斯特菌(Listeriamonocytogenes,Lm)是一種革蘭氏陽性胞內寄生菌，主要引起成人敗血癥和新生兒腦膜炎等疾病，報道顯示，美國每年大約有2 500例單增李斯特菌病患者，占總住院人數的4%,但死亡人數占食源性致病病例的28%[1-3]。

傳統的單增李斯特菌分離鑒定方法無法滿足單增李斯特菌高通量快速檢測的需求。本文根據單增李斯特菌的溶血素基因hlyA、內化素基因inlA和脂酶基因plcB的保守序列設計特異性引物探針，建立了基于小溝結合物(minor groove binder,MGB)探針的三重實時熒光PCR方法，探針的5′端采用不同的熒光報告基團(FAM、VIC和NED)標記，3′端增加的MGB基團，使探針結合靶序列的嚴謹度和檢測的分辨率均得到提高[4]。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株來源本研究共選用單增李斯特菌菌株101株，其中100株菌株為廣東出入境檢驗檢疫局技術中心和中國檢驗檢疫科學研究院分離保存，所有菌株重新經API listeria確認為單增李斯特菌。另1株為單增李斯特菌標準菌株(ATCC19115)。其他供試菌株為：英諾克李斯特菌(ATCC 33090)、伊氏李斯特菌(ATCC19119)、表皮葡萄球菌(CMCC 26069)、金黃色葡萄球菌(ATCC 6538)、鼠傷寒沙門氏菌(CMCC(B)50115)、非01霍亂弧菌(Vb0)、副溶血性弧菌(ATCC 17802)、弗氏檸檬酸桿菌(ATCC43864)均購自陸橋生物技術公司。

1.1.2主要試劑Premix Ex TaqTM(TaKaRa)DNA marker(TaKaRa)。(大連寶生物工程有限公司)，腦心浸液肉湯(Brain Heart Infusion broth, BHI)(北京陸橋技術股份有限公司),堿性蛋白胨水(北京陸橋技術股份有限公司)。

1.1.3主要儀器ABI7500熒光PCR儀(ABI)；12GC全自動核酸純化系統(precision system science)；CT15RE高速冷凍離心機(HITACHI)；ND2000C微量分光光度計(Thermo Scientific)；生化培養箱(德國Binder)。

1.2方法

1.2.1菌株模板制備取37 ℃過夜培養菌液1 mL置2 mL離心管離心去培養基后，用1 mL去離子水漂洗，12 000 r/min離心2 min去上清，重復2次。最后加200 μL去離子水在核酸提取儀上提取DNA備用。

1.2.2引物和探針設計根據GenBank公布的單增李斯特菌hlyA，inlA,plcB基因的保守序列，采用ABI primer express 3.0軟件設計引物及MGB探針，具體序列見表1，委托英濰捷基公司合成。使用前將引物和探針稀釋成20 μmol/L,-20 ℃保存備用。

1.2.3三重實時熒光PCR方法的建立及優化以單增李斯特菌標準菌株ATCC19115為陽性模板，優化后反應體系(30 μL)如下：Premix Ex TaqTM(2×)15 μL、hlyA、inlA、plcB引物探針(20 μmol/L)分別為0.5 μL、ROX0.3 μL、去離子水8.2 μL、DNA模板為2 μL。反應條件：Stage 1：預變性95 ℃ 30 s；Stage 2：95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，40個循環，并于FAM、VIC，NED 3個通道收集熒光信號；擴增反應在ABI7500熒光定量PCR儀上進行。結果判斷：待測基因出現擴增曲線，且Ct值<36,則判斷為陽性；如果36

表1單增李斯特菌毒力因子hlyA、inlA、plcB引物和探針序列Tab.1Primers and probe sequences of virulence factors for Listeria monocytogenes

引物名稱引物序列(5'→3')擴增長度bphlyA-FCCTCGGAGACT-TACGAGATATTTTG72hlyA-RGCAATGGGAACTCCTGGTGTThlyA-PFAM-AAGGTGCTACTTTTA-ACC-MGBinlA-FTAACAGACACGGTCTCGCAAA66inlA-RTCCCTAATCTATCCGCCTGAAGinlA-PVIC-AGATCTAGACCAAGTTA-CAAC-MGBplcB-ACCAGCAGCTCCGCATGA69plcB-RTCCGCGGACCAACTAAGTTTAplcB-PNED-ATCGACAGCAAATTA-MGB

1.2.4三重實時熒光PCR的特異性試驗按1.2.1提取單增李斯特菌、英諾克李斯特菌、伊氏李斯特菌、表皮葡萄球菌、金黃色葡萄球菌、鼠傷寒沙門氏菌、非01霍亂弧菌、副溶血性弧菌、弗氏檸檬酸桿菌基因組DNA，用1.2.3建立的三重實時熒光PCR體系進行特異性試驗。

1.2.5三重實時熒光PCR的靈敏度試驗及標準曲線制作將初始濃度為3×108CFU/mL的單增李斯特菌標準菌株培養液稀釋成1×108CFU/mL，然后進行10倍梯度稀釋成1×107CFU/mL～1×101CFU/mL，每個稀釋度取1 mL按1.2.1提取DNA，按1.2.3建立的三重實時熒光PCR體系進行擴增，并繪制標準曲線。

1.2.6三重實時熒光PCR可重復性試驗選取10倍倍比稀釋1×107CFU/mL～1×101CFU/mL的單增李斯特菌菌液1 mL按1.2.1提取基因組DNA對本文建立的三重熒光PCR方法的可重復性進行測試，每個稀釋度3個重復，通過對各次試驗結果所得Ct值的變異系數進行分析來評價三重實時熒光PCR反應體系的穩定性。

1.2.7單增李斯特菌分離株毒力基因三重實時熒光PCR檢測及毒力基因分布對101株單增李斯特菌采用本文建立的三重實時熒光PCR方法進行毒力基因的檢測。并結合本課題組單增李斯特菌分離株MLST分類的結果(另文發表)，分析毒力基因在MLST聚類分群中的分布情況。

2結果

2.1三重實時熒光PCR的特異性試驗結果按1.2.4進行三重實時熒光PCR特異性試驗結果顯示，單增李斯特菌標準菌株可以同時檢測到hlyA、inlA和plcB3個基因，其它菌株3個基因均無明顯擴增曲線。表明本方法與其他陰性菌無交叉反應, 本文所建立的探針實時熒光PCR檢測方法特異性良好，見圖1。

2.2三重實時熒光PCR的靈敏度試驗及標準曲線制作按1.2.5的靈敏度測試結果顯示，hlyA、inlA和plcB基因三重實時熒光檢測體系的最低檢測濃度達1×102CFU/mL，見圖2。采用1×107CFU/mL～1×102CFU/mL 6個稀釋度分別繪制hlyA、inlA和plcB標準曲線，標準曲線的相關系數R2分別為0.99、0.98和0.99，擴增效率分別為106%、112%和110%，見圖3，表明檢測體系的3個基因擴增效率和線性相關系數良好，可以滿足三重實時熒光PCR檢測的要求。

1：單增李斯特菌；2-9：英諾克李斯特菌、伊氏李斯特菌、表皮葡萄球菌、金黃色葡萄球菌、鼠傷寒沙門氏菌、非01霍亂弧菌、副溶血性弧菌、弗氏檸檬酸桿菌1：Listeria monocytogenes；2-9：Listeria innocua,Listeria ivanovii,Staphylococcus epidermidis,Staphyl-ococcus aureus,salmonella typhimurium,Vibrio cholerae,Vibrio Parahemolyticus,Citrobacter freundii圖1　單增李斯特菌的多重實時熒光PCR的特異性測試Fig.1　Specificity test of multiplex real-time PCR for Listeria monocytogenes

1-7分別為：1×107CFU/mL,1×106 CFU/mL，1×105 CFU/mL，1×104 CFU/mL，1×103 CFU/mL，1×102 CFU/mL，1×101 CFU/mL圖2　多重實時熒光PCR靈敏度測試Fig.2　Sensitivity test of multiplex real-time PCR for Listeria monocytogenes

圖中示標準曲線方程，相關系數R2值和擴增效率E值。Standard curves，the correlation coefficient(R2)values and the amplification efficiency(E) values were shown in the figure.圖3　單增李斯特菌三重實時熒光PCR標準曲線 Fig.3　Standard curves of triplex real-time PCR assay for detection of Listeria monocytogenes

2.3三重實時熒光PCR可重復性試驗選取1×107CFU/mL～1×102CFU/mL的單增李斯特菌菌液提取模板進行三重實時熒光PCR檢測，每個稀釋度做3個平行，結果表明3種毒力基因的Ct值變異系數均在2%以下見表2，說明本文建立的三重實時熒光PCR檢測方法重復性好，穩定可靠。

表2三重實時熒光PCR檢測單增李斯特菌的可重復性測試Table 2Reproducibility of multiplex real-time PCR for Listeria monocytogenes

菌液濃度(CFU/mL)重復3次Ct值平均Ct值CV(%)123hlyAInlAplcBhlyAInlAplcBhlyAInlAplcBhlyAInlAplcBhlyAInlAplcB1×10721.1021.0421.2521.3821.4121.4321.3221.5621.4221.2721.3421.370.691.250.471×10624.1924.5624.6224.7724.9824.8024.7025.1324.7824.5521.3421.371.291.190.401×10528.0128.6728.1528.2028.9228.2128.2528.9628.2428.1524.8924.730.450.540.161×10431.5032.4431.4132.0232.8831.631.9632.4931.7031.8328.8528.200.890.740.471×10335.3135.6435.0435.3936.0935.1235.4736.0235.0135.3932.6031.570.230.670.161×10238.4038.6138.5638.9139.3038.2938.5738.9337.8738.6338.9538.240.670.890.91

表3101株單增李斯特菌毒力基因三重實時熒光PCR毒力基因檢測結果及分布Tab.3The distribution of 3 virulence gene in 101 Listeria monocytogenes strains

ST型Sequencetypes菌株數NumberofstrainshlyA基因陽性菌株數PositivenumberofhlyAinlA基因陽性菌株數PositivenumberofinlAplcB基因陽性菌株數PositivenumberofplcBSTsUPGMA聚類群組STsalignedbyUPGMA1,3,4,5,59,73,87,201,218,330,456,517,New1,New2,New8,New9,New11,New14,New16,New17,New22,New23,New2530301030groupI7,8,9,14,19,34,98,101,121,122,155,307,343,New3,New4,New5,New7,New10,New13,New15,New18,New19,New20,New21,New24,New2657575657groupIINew6,New122000groupIIIUnidentifiedsequenctypes12121012unknown

*new1-new26為新發現的STs，尚待提交MLST網站后分配相應的編號。

2.4單增李斯特菌毒力基因三重實時熒光PCR檢測及毒力基因分布應用本文建立的三重實時熒光PCR方法對101株單增李斯特菌進行了檢測，101株單增李斯特菌毒力基因分布情況及與MLST的聚類群的關系如表3所示。hlyA、inlA和plcB基因的檢出率分別為98%、75%和98%。其中89株按MLST進行了分型，另12株因未獲得MLST要求的7個管家基因序列的完整片段而無法進行MLST分型。

3討論

單增李斯特菌被世界衛生組織列為重點監測的食源性病原菌之一[5]。中國目前雖然未曾暴發人感染單增李斯特菌病，但多位研究者從各地多種食品中均分離出單增李斯特菌[6-7]，其風險性不容忽視。

單增李斯特菌毒力基因主要集中在兩個毒力島LIPI-1和LIP-2(又稱為內化素小島)，其中hlyA、plcB屬于LIP-1，inlA屬于LIP-2[8-9]。hlyA基因是單增李斯特菌最重要的毒力基因，編碼的李斯特菌溶血素O(listeriolysin，LLO)是單增李斯特菌最重要的一種毒力因子，為細菌入侵宿主細胞及幫助細菌逃脫吞噬泡所必需[10]。有研究顯示，缺失hlyA序列的單增李斯特菌無法入侵宿主細胞，對宿主無毒性[11-12]。InlA基因編碼內化素，它與細菌的侵襲相關，位于菌體表面, 與特異性受體鈣黏蛋白(E-cadherin)結合,介導細菌侵襲入細胞并內化至吞噬小體,是建立感染的前提。有研究結果顯示，InlA/InlB基因雙缺失后，單增李斯特菌菌株的毒力明顯減弱[13-15]。于豐宇等有關小鼠毒力實驗的LD50也顯示，內化素基因(inlA、inlB、inlC、inlJ)的缺失可能是導致菌株毒力降低的原因,目前有關報道表明致病性的LM都含有inlA,inlB[16-17]。plcB編碼磷脂酰膽堿磷脂酶(PC-PLC)，是細菌在宿主細胞間擴散并突破雙層膜時需要的關鍵因子之一，還可幫助單增李斯特菌逃離吞噬小體[18]。

本文101株單增李斯特菌菌株中hlyA基因、plcB基因檢出率均為98%。提示其在單增李斯特菌中毒力基因中占重要位置(除groupIII的兩株菌株未檢出hlyA基因、plcB基因外，其他菌株均有檢出)。inlA基因的共有25株菌株未檢出，占整個101株單增李斯特菌菌株的24.8%，其中的20株屬于groupI，占整個groupI中30株菌株的比例為67%(20/30)，提示groupI中缺失inlA基因的菌株比例較高。至于本文中單增李斯特菌菌株中inlA基因缺失株與inlA基因陽性菌株的毒力有無差異有待于進一步實驗確認。

本課題組將101株單增李斯特菌菌株進行了MLST分型分析，發現可將其中的1-89號共89株單增李斯特菌根據MLST分型并獲得相應的STs,并聚類分成3個群組：groupI,groupII和groupIII(分別與血清型譜系lineageI,lineageII和lineageIII相對應)。序號1-57共57株單增李斯特菌屬于groupII(相應于血清型分類的lineageII，)，除了序號44的菌株inlA基因陰性外，其余56株單增李斯特菌的hlyA、inlA、plcB3個基因均為陽性；序號58-87共30株單增李斯特菌屬于groupI(相應于血清型分類的lineageI，)，其hlyA、plcB均為陽性，但inlA基因陰性率較高(共20株，占67%)；序號88、89共2株單增李斯特菌屬groupIII(相對應于血清型分類的lineageIII)，其3個毒力基因hlyA、inlA、plcB3個基因全部未檢出。對于序號90-101這12株菌株，本課題組發現因未能獲得MLST要求的7個管家基因的完整序列而能成功進行MLST分型，但采用本文建立的三重實時熒光PCR方法，除序號90號和序號101的菌株不能檢出inlA基因外，其他均可檢出hlyA、inlA、plcB3個毒力基因，且經API listeria確認為全部為單增李斯特菌，提示應進一步完善MLST的分型方法。

目前認為單增李斯特菌具有13個血清型，可分為4個譜系，lineageI、lineageI、lineageIII 和lineageIV[19]。90%以上的李斯特菌病病例均由1/2a、1/2b、4b型引起，其中大多數暴發病例歸因于4b型。其中1/2b、4b屬lineageI，1/2a屬lineageII[20-23]。lineageIII和lineageIV譜系包含菌株數量很少，lineageIII血清型大多毒力較弱,很少引起發病[24]。在本次101株單增李斯特菌毒力基因的檢測中，除未能MLST分型的12株菌株(序號90-101)外，89株單增李斯特菌中有87株菌株均分布于lineageII(groupII)和lineageI(groupI)這兩個血清家系中，占比98%，且3個毒力基因均陽性的比例為75%,2個毒力基因均陽性的比例為98%，說明其毒力基因保持相對完整，具較強潛在致病力。其余2株(序號88-89)分布于groupIII (lineageIII)，結合其3個毒力基因均為陰性的結果表明，lineageIII中2株菌株的3個毒力基因均缺失，與lineageIII這一血清家系其毒力較弱的情況較為一致。此外從3個基因的檢出率顯示，groupII (lineageII)菌株陽性的毒力基因多于groupI (lineageI)的菌株,與其毒力強弱是否相關有待進一步的研究。

參考文獻：

[1] Mead PS, Slutsker L, Dietz V，et al.Food-related illness and death in the United States[J]. Emerg Infect Dis,1999, 5:607-625.

[2] Orsi RH,den Bakker HC,Wiedmann M. Listeria monocytogenes lineages:Genomics,evolution,ecology,and phenotypic characteristics[J].Int J Med Microbiol,2011,301(2):79-96.DOI:10.1016/j.ijmm.2010.05.002

[3] Xu LY, Yuan MY, Gao XJ,et al.Detection of Listeria monocytogenes by TaqMan probe based duplex real-time polymerase chain reaction[J]. Chinses Journal of Health Laboratory Technology,2011,08:1949-1951

許龍巖,袁慕云,高秀潔，等. 基于Taqman探針雙重實時熒光PCR檢測單增李斯特菌[J]. 中國衛生檢驗雜志,2011,08:1949-1951.

[4] Kutyavin IV,Afonina IA,Mills A,et al.3-Minor grouve binder-DNA probes increase sequence specificity at PCR extension temperature[J]. Nucleic Acids Res,2000,28(2):655-661.

[5] Feng YF,Ran L,Zhang LS.Listeriosis cases reported in medical literatures in China,2000-2009[J].Disease Surveillance,2011,08:654-659

馮延芳,冉陸,張立實. 2000-2009年中國李斯特菌病文獻報告病例分析[J]. 疾病監測,2011,08:654-659.

[6] Wang Y,Zhao A,Zhu R，et al.Genetic diversity and molecular typing of Listeria monocytogenes in Cina[J].BMC Microbiol,2012,12:119.DOI:10.1186/1471-2180-12-119.

[7] Jin XY,Han J,Yu HW, et al.The Survey on The Contamination Situation of Listeria Monocytogenes in Foods[J]. Journal of Chinese Institute Of Food Science and Technology, 2009,9(1):226-231

靳曉燕,韓軍,于宏偉，等.食品中單核增生性李斯特菌污染狀況研究[J].中國食品學報.2009,9(1):226-231.

[8] Zhang ZC,MengQL,Qiao J,et al.Effects of the deletion of RsbV gene on virulence of Listeria monocytogenes[J].Acta Microbiologica Sinica, 2013,53(1)：59-65.

張再超,孟慶玲,喬軍，等. RsbV基因缺失對單核細胞增生李斯特菌毒力的影響[J].微生物報.2013,53(1)：59-65.

[9] Kreft J,Vázquez-Boland JA，Altrock S，Dominguez-Bernal G，Goebel W．Pathogenicity islands and othervirulence elements in Listeria[J].Current Topics in Microbiology and Immunology,2002,264(2):109-125．

[10] Yi NN，Li W，Zhang ZQ，et al. Cloning and phylogenetic analysis of LIPI-1 gene cluster from three Listeria monoc togenes isolates[J].Chinese Veterinary Science.2013，43(O6)：565-571.

伊娜娜,李巍,張子群,等. 三株不同毒力單增李斯特菌第一毒力島基因全序列的克隆及遺傳變異分析[J]. 中國獸醫科學,2013,06:565-571.

[11] Glomski IJ，Decatur AL，Portnoy DA．Listeria monocytogenes mutants that fail to com partmentalize listerolysin O activity are cytotoxic，avirulent，and unable to evade host extracellular defenses[J]．Infect Immun，2003，71(12)：6754-6765.

[12] Yin YL,Jiao XA,Pan ZM,et al.Prokaryotic Expression and Bioactivity of The Listeria monocytogenes Listeriolysin O[J]. Acta Microbiologica Sinica, 2004,06:752-755.

殷月蘭,焦新安,潘志明,等. 李斯特菌溶血素基因的原核表達及其生物學特性[J]. 微生物學報,2004,06:752-755.

[13] Wu SY,Zhang C,Chen GW,et al.Progress in Understanding the Mechanism of Host Invasion by Listeria monocytogenes [J].Food Science, 2014,19:290-294.

吳淑燕,張超,陳國薇,等. 單增李斯特菌入侵宿主分子機理研究進展[J]. 食品科學,2014,19:290-294.

[14] Chen YF,Wang L,Wang PY,et al.Effect of InlA/InlB Deletion on Virulence of Listeria monocytogenes[J]. Journal of Shihezi University(Natural Science), 2015,04:432-437.

陳云飛,王麗娜,王鵬雁等. InlA/InlB基因的雙缺失對單增李斯特菌毒力的影響[J]. 石河子大學學報(自然科學版),2015,04:432-437.

[15] Chen JS, Jiang LL, Fang WH.Virulence determinants and its evolution of the genus Listeria[J].Acta Microbiologica Sinica,2007,47(4):738-742

陳健舜,江玲麗,方維煥. 李斯特菌毒力因子及其進化[J]. 微生物學報,2007,04:738-742.

[16] Yu FY,Li L,Wang H,et a. Rapid PCR Detection of Listeria monocytogenes virulence in Food l[J]. Food Science, 2010,23:164-168.

于豐宇,李林,王紅,等. 應用PCR技術快速測定食品中單核細胞增生李斯特氏菌毒力[J]. 食品科學,2010,23:164-168.

[17] Zhu RF, Ye CY. Virulence Factors of Listeria monocytogenes[J].Chinese Journal of Food Hygiene, 2007,19(2)：158-162.

祝仁發，葉長蕓.單核細胞增生李斯特菌的毒力因子[J].中國食品衛生雜志，2007,19(2)：158-162.

[18] Shaughnessy LM，Hoppe AD，Christensen KA，et al．Membrane perforations inhibit lysosome fusion by altering pH and calcium in Listeria monocytogenes vacuoles[J]．Cell Microbiol，2006,8(5)：781-792．

[19] Orsi RH,Den BHC,Wiedmann M.Listeria Monocytogenes lineages: Genomics, evolution,ecology and phenotypic characteristics[J].Int J Med Microbiol,2011,301(2):79-96.

[20] Kiss R,Tirczka T,Szita G,et al.Listeria monocytogenes food monitoring data and incidence of human listeriosis in hungarg,2004[J]. Int J Food Micorbiol,112(1):71-74.DOI:10.1016/j.ijfoodmicro.2006.06.13.

[21] Wang Y,Zhao A,Zhu R，et al.Genetic diversity and molecular typing of Listeria monocytogenes in Cina[J].BMC Microbiol,2012,12:119.DOI:10.1186/1471-2180-12-119.

[22] Chen J,Zhang X,Mei L,et al.Prevalence of Listeria in chinese food products from 13 provinces between 2000 and 2007 and virulence characterization of Listeria monocytogenes isolates[J].foodborne Pathog Dis,2009,6(1):7-14.

[23] Wiedmann M,Bruce JL,Keating C,et al.Ribotypes and virulence gene polymorphisms suggest three distinct Listeria monocytogenes lineages with differences in pathogenic potential[J].Infect Immun 1997,65:2707-2716.

[24] Jiang LL,Chen JS,Li AY,et al.Characterization of Listeria monocytogenes strains with low virulence[J].Acta Veterinaria et Zootechnica Sinica,2014,45(2):274-280.DOI:10.11843/J.issn.0366-6964.2014.02.016

江玲麗,陳健舜,李愛云,等. 單核細胞增多性李斯特菌弱毒株的生物學特性鑒定[J]. 畜牧獸醫學報,2014,02:274-280.

DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2016.05.007

通訊作者：許龍巖，Email: xlyciq@126.com

中圖分類號：R378

文獻標識碼：A

文章編號：1002-2694(2016)05-451-06

Corresponding author:Xu Long-yan,Email:xlyciq@126.com

收稿日期：2015-12-29修回日期：2016-02-03

Development of triplex TaqMan MGB-probe real-time PCR assay for detection ofListeriamonocytogenesand the distribution of virulence gene in isolates

LIU Er-long1,YUAN Mu-yun2,LU Ying-zi1,CHEN Ying3,WANG Ping3,XU Long-Yan2,LI Jia-qi1,ZHENG Gao-bing1,DU Ya-ping1,LIN Xue-qin1

(1.HuangpuEntry-ExitInspectionandQuarantineBureau,Guangzhou510730,China；2.GuangdongEntry-ExitInspectionandQuarantineBureau,Guangzhou510730,China；3.ChineseAcademyofInspectionandQuarantine,Beijing100025,China)

Abstract:To develop a sensitive and specific triplex TaqMan-MGB real-time PCR assay for the detection of Listeria monocytogenes isolated from animal derived food，specific primers and MGB probes targeted toward the hylA,inlA and plcB gene were designed based on the conserved sequences.Then,the virulence genes distribution among groups(groupI,groupII,groupIII) which aligned by Multilocus sequence typing (MLST)was analyzed. The results showed that the assay developed in this study has good sensitivity,specificity and repeatability for the detection of Listeria monocytogenes.The detection limit was 100 CFU/mL in pure culture.and the amplifying efficiencies and the correlation coefficient of standard curves were all in the acceptable ange.The positive rates of hylA,inlA and plcB were 98% (99/101),75% (76/101) and 98% (99/101) respectively in 101 Listeria monocytogenes strains. Among 89 of 101 strains classed into 3 clusters(groupI,groupII and groupIII) by MLST，20 of 30 isolates belonged to groupI were all negative in inlA gene;56 of 57 isolates belonged to groupII were positive in all 3 virulence gene；2 isolates grouped into groupIII which hlyA,inlA and plcB were all negative.The detection result showed that the distrubution of 3 virulence gene consistented with the type groups clustered by MLST and provided remarkable references value for evaluating the virulence of Listeria monocytogenes.

Key words:Listeria monocytogenes;TaqMan-MGB real-time PCR; distribution of virulence genes; Multilocus sequence typing Supported by Science and Technology Planning Project of Guangdong Province,China (No.2013B040402004)

廣東省科技計劃項目(No.2013B040402004)資助