復方止血貼溶血性的研究Δ

馮潤東，羅世書，高　翔，崔亞寧

(陜西省食品藥品檢驗所人事教育科，陜西 西安　710065)

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復方止血貼溶血性的研究Δ

馮潤東*，羅世書，高翔，崔亞寧

(陜西省食品藥品檢驗所人事教育科，陜西 西安710065)

目的：研究復方止血貼中各成分的溶血作用，為臨床應用提供實驗依據。方法：采用家兔體外試管法，插管采集家兔頸動脈血，經處理后留兔血紅細胞，并加入0.9%氯化鈉溶液和蒸餾水，將各管輕輕搖勻，立即置于37 ℃的恒溫箱中進行溫育，分別于保溫15、30、45、60、120、180 min用肉眼觀察各管溶血情況，必要時用顯微鏡觀察紅細胞是否破裂，以此判斷復方止血貼及其主要成分凝血酶、氨基己酸的溶血作用。結果：復方止血貼及其主要成分均未產生溶血現象，并且經過溶血率測定得出復方止血貼及其主要成分凝血酶和氨基己酸的溶血率均<5%。結論：復方止血貼及其主要成分在家兔體外試管實驗中未見明顯溶血作用，表明其在臨床可以安全使用。

復方止血貼； 溶血； 兔

外傷引起的失血是傷殘、死亡的主要原因[1]。盡管目前醫院已有許多行之有效的止血產品救治受傷人員，但對入院前外傷人員的急救止血還停留在傳統方式上，如包扎、固定和高體位的機械性止血等[2]。目前，市場上多采用明膠海綿等材料，這些材料在親水性、止血效果等方面仍有待改進。為提高一線救治率、減少出血量[3]，英代生物科技有限公司研制了復方止血貼，擬申報國家一類新藥，其是由凝血酶、氨基己酸2種成分組成的復方制劑，其凝血和止血作用顯著，有很好的臨床應用前景，但對其是否存在溶血方面的不良反應還未有研究。本研究旨在探討復方止血貼的溶血作用，為開展進一步臨床應用提供依據。

1　材料

1.1儀器

5804R型離心機(德國艾本德公司)；UV-721型紫外分光光度計(上海優尼科公司)。

1.2藥品與試劑

復方止血貼(英代生物科技有限公司，批號：130309)；PVF海綿(英佳麥迪克醫用材料有限公司，批號：130420)；手術吸收性止血海綿(天和藥業生物科技有限公司，批號：20120602)；凝血酶(上海生化藥業有限公司，批號：1110011)；氨基己酸(常州制藥公司，批號：120209)。

1.3實驗動物

新西蘭大白兔，雌雄兼用，體質量約2 kg，由西安交通大學醫學院實驗動物中心提供，陜動證字08-018號，實驗在溫度18～26 ℃中完成。

2　方法

2.1藥物濃度

復方止血貼中的藥物含量：貼片每片50 cm2，每片含凝血酶304 IU、氨基己酸3.04 g。假設敷片能被機體全部吸收，人體全身血液按5 L計算，則溶血實驗所用濃度=每片所含藥物量/5 L，故本研究中復方止血貼組藥物含量為凝血酶61 IU/L、氨基已酸0.61 g/L。

2.2家兔體外溶血實驗

于家兔頸動脈插管取血約40 ml置于錐形瓶中，用玻璃珠攪拌去除纖維蛋白后移取10份1 ml移入10支10 ml刻度離心管中[5]，各加入0.9%氯化鈉溶液9 ml，混勻后1 500 r/min轉速下離心15 min，去除上清液，沉淀的紅細胞再用0.9%氯化鈉溶液按上述方法洗滌3次，至上清液不顯紅色[4-5]。將10支試管所得紅細胞合并，并用0.9%氯化鈉溶液稀釋成體積比為2%的混懸液，備用。取潔凈試管21支，分為復方止血貼組、凝血酶組、氨基己酸組各7支，3組試藥分別為復方止血貼、凝血酶、氨基己酸。每組編號：1～5號管為供試品管，6號管為陰性對照管，7號管為陽性對照管。依次加入2%紅細胞混懸液、試藥、0.9%氯化鈉溶液和蒸餾水，見表1。將各管輕輕搖勻，立即置于37 ℃的恒溫箱中進行溫育，分別于保溫15、30、45、60、120、180 min后肉眼觀察各管溶血情況，必要時用顯微鏡觀察紅細胞是否破裂，以標準判斷紅細胞溶血、凝集程度：溶液澄明紅色(粉紅色混懸液)、管底無細胞殘留為全溶血；溶液澄明紅色或棕色(粉紅色混懸液)、管底有少量紅細胞殘留為部分溶血；紅細胞全部下沉、上層液體無色澄明(純乳白色不顯紅色混懸液)為無溶血；紅細胞凝聚成塊、振搖后不能分散為凝集。

表1　體外溶血試驗加樣表

注：“—”表示未加入試藥

Note：“—” stands for no use of the reagent

3　結果

3.1實驗結果

蒸餾水對照管在15 min即全部溶血，其余各管在30、60、120、180 min均無溶血現象發生。

3.2溶血率測定

將“2.2”項下7支試管的液體置入離心管中，1 500 r/min轉速下離心15 min，結果顯示：7號管管底無細胞殘留，全管溶液澄明紅色；1～6管紅細胞全部下沉，上層液體為無色透明液體。取各管上清溶液在UV-721型紫外分光光度計上545 nm處，以蒸餾水為空白讀取各管光密度(OD)[6-7]。溶血率計算公式如下：溶血率(%)=(ODnc-ODt)/(ODnc-ODpc)×100%(式中，ODt：試驗管吸光度；ODnc：陰性對照管吸光度；ODpc：陽性對照管吸光度)，溶血率>5%表示出現了溶血[8]。結果顯示，1～6號試管溶血率均<5%，表明復方止血貼均無溶血，見表2。

表2　復方止血貼各組分對溶血作用相互影響測定的OD值

4　討論

本研究采用家兔體外溶血實驗，結果表明，復方止血貼及其各組分均未發現存在溶血作用，且溶血率均<5%，驗證了復方止血貼是安全可靠的，此研究為復方止血貼的臨床應用和不良反應提供了實驗依據。

近些年，國內外對于新型止血產品的研究正在成為新的熱點[9]。復方止血貼主要成分是凝血酶和氨基己酸。凝血酶作為凝血因子Ⅱa，可不需經過血液凝固的第一、二階段而直接作用于纖維蛋白原，使之轉變為纖維蛋白，進而使血液快速凝固、填塞出血點而達到止血的目的[10-11]。凝血酶的止血速度快、療效確切，主要用于臨床各科發生的毛細血管、小血管及實質性臟器出血[12]。復方止血貼的應用對臨床止血方法的創新起到了促進作用，對提高臨床一線救治率具有積極意義。

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Study on Hemolysis of Compound Hemostatic StickΔ

FENG Rundong, LUO Shishu, GAO Xiang, CUI Yaning

(Dept.of Personnel and Education, Shaanxi Institute for Food and Drug Control, Shaanxi Xi’an 710065, China)

OBJECTIVE：To study the hemolytic effects of compound hemostatic stick, so as to provide experimental basis for the clinical application. METHODS: Vitro test tube method on rabbit was adopted, carotid arterial blood of rabbit was collected by intubation, after processing the rabbit red blood cells was collected to add 0.9% sodium chloride solution and distilled water. After gently shake, the tubes were put into the thermostat at temperature of 37 ℃.The hemolysis was observed respectively after 15 min, 30 min, 45 min, 60 min, 120 min and 180 min; the rupture of blood cells can be observed by microscope when necessary, and the hemolytic effects of compound hemostatic stick and its main components as thrombin and aminocaproic acid were judged. RESULTS: After study, compound hemostatic stick and its main components would not induce hemolysis phenomenon, and through the determination of hemolysis rate, compound hemostatic stick and its main components as thrombin and aminocaproic acid hemolysis rate were below 5%. CONCLUSIONS: There are no obvious hemolysis in compound hemostatic stick and its main components in rabbits in vitro test tube experiments, which shows that its role in hemolysis is safe in clinic.

Compound hemostatic stick; Hemolysis; Rabbit

陜西省科技統籌創新工程項目(No.2014FWPT-01)

R944.2

A

1672-2124(2016)08-1021-02

10.14009/j.issn.1672-2124.2016.08.004

2016-01-13)

*主管藥師。研究方向：藥理學。E-mail：fengdong83@163.com