核桃多肽制備酶解關鍵技術研究

李麗，劉陽，張帥，周涵黎，王亞云，吳娜，阮金蘭，*（.武昌理工學院生命科學學院，生物多肽糖尿病藥物湖北省協同創新中心，湖北武漢430223；2.武漢工程大學化工與制藥學院，湖北武漢430073）

核桃多肽制備酶解關鍵技術研究

李麗1，2，劉陽1，2，張帥1，周涵黎1，2，王亞云1，2，吳娜1，2，阮金蘭1，2，*
（1.武昌理工學院生命科學學院，生物多肽糖尿病藥物湖北省協同創新中心，湖北武漢430223；2.武漢工程大學化工與制藥學院，湖北武漢430073）

以核桃仁為原料，以水解度和對α-淀粉酶抑制率為評價指標，正交設計研究核桃蛋白酶解中相關的單酶水解、多酶水解、酶添加順序、復合酶最佳配方等關鍵因子。結果表明，單酶對核桃蛋白的水解度大小依次為：堿性蛋白酶＞中性蛋白酶≈酸性蛋白酶＞胃蛋白酶＞胰蛋白酶，而酶解產物對α-淀粉酶抑制率大小依次為：酸性蛋白酶＞中性蛋白酶＞堿性蛋白酶＞胃蛋白酶＞胰蛋白酶，并發現依次添加單酶比同時添加的效果更好。綜合考慮，先加中性蛋白酶再加堿性蛋白酶的添加方式最佳，可使核桃蛋白水解度達到40%左右，同時還保證酶解產物對α-淀粉酶抑制率較大，可達到85.9%。關鍵詞：核桃多肽；酶解；α-淀粉酶；核桃

核桃（Juglans regia L.），別名羌桃等，系胡桃科核桃屬落葉喬木的果核，是一種罕見兼具經濟價值和營養價值的果木，在植物界占據十分重要的地位。核桃仁中不僅含有豐富的不飽和脂肪酸，還擁有優質的蛋白質［1-2］資源，是人們喜好的堅果美食和常用的醫療保健原料?，F代醫學研究表明，核桃仁具有化痰、養血、補氣、治喘等多種醫療和保健的功能，澳大利亞科學家進行的最新實驗再次證明，糖尿?。―M）患者每天堅持吃核桃可以將體內無益膽固醇LDL的含量降低10%［3］。近期有研究［4］發現與蛋白質相比，多肽具有分子量小、結構簡單、乳化性和熱穩定性強、毒副作用小、特異性高、吸收快、水溶性好、利用效率高、易于改造和修飾等獨特的優勢，一些多肽不僅能夠提供人體生長所必須的營養物質，還具有某些特殊的生理功能，例如：抗疲勞［5］、抗氧化［6］、降血壓［7］等。

為了充分利用和開發核桃多肽資源，本研究采用堿溶酸沉法［8］提取核桃蛋白，以水解度和對α-淀粉酶的抑制率為指標，考察5種單酶和兩酶協同水解方式及同時加酶和分步依次加酶方式對核桃蛋白水解的效果進行了解系統的研究，以期解決核桃多肽制備中酶解關鍵技術問題，確定最適酶的種類及其最佳酶解條件和參數，從而為核桃多肽制備及深加工提供實驗參考，為核桃資源的綜合開發利用奠定基礎。

1　儀器與材料

1.1儀器

Avanti J-26XP超速冷凍離心機：貝克曼庫爾特（美國）；雷磁pHs-3c pH計：上海儀電科學儀器有限公司；UV-1800紫外分光光度計：島津（日本）；FreeZone TriadTM2.5 L冷凍真空干燥箱：LANCONCO（美國）。

1.2材料與試劑

核桃仁：購自新疆阿克蘇，經華中科技大學同濟藥學院張長弓副教授鑒定為Juglans regia L.的果核；堿性蛋白酶（批號：060910）、中性蛋白酶（批號：060900）為BR：武漢市華順生物技術有限公司；胃蛋白酶（批號：20140619）為BR、甲醛、NaOH、HCl、可溶性淀粉、酒石酸鉀鈉均為AR、考馬斯亮藍G250為BR：國藥集團化學試劑有限公司；酸性蛋白酶（批號：CAS#9025-49-4）為BR：上海金穗生物科技有限公司；胰蛋白酶（批號：J130062）為BR：賽默飛世爾科技（中國）有限公司；無水硫酸鈉為AR：天津市化學試劑有限公司；α-淀粉酶為BR：北京雙旋微生物培養基制品廠；結晶酚為GC：阿拉丁。

2　方法

2.1核桃蛋白的提?。?］

試驗工序為：核桃仁精選→浸泡→去皮→均漿→調pH 8～8.5→攪拌，浸泡過夜→以3 000 r/min，4℃離心30 min→去油層和下層沉淀→調pH 4.0～4.5→攪拌，靜止→以3 000 r/min，4℃離心30 min→取沉淀層→水洗→調pH 7.0→冷凍干燥，得凍干粉。

2.2蛋白質含量測定

采用考馬斯亮藍法［9］測定提取蛋白含量，酶解液中多肽含量測定也采用此法。

2.3最適單酶種類篩選

配制一定濃度的核桃蛋白溶液，調至相應的pH（見表1），按比例分別加入常用的堿性、中性和酸性蛋白酶，胃蛋白酶，胰蛋白酶，以水解度和對α-淀粉酶的抑制率為評價指標，篩選確定最適水解酶的種類。

2.3.1氨基氮及總氮的測定

氨基氮的測定采用甲醛滴定法［10］，總氮采用凱氏定氮法［11］。

氨基氮的測定：在5 mL水解液加蒸餾水25 mL，用0.05mol/LNaOH標準液滴定至pH為8.2，加入10mL的中性甲醛溶液混勻，再用0.05 mol/L NaOH溶液繼續滴定至pH為9.2，記錄加入甲醛后溶液滴定至pH=9.2所消耗的堿量。同時取水30 mL，做試劑空白試驗。計算公式如下：

表1　各種酶的最適作用條件Table 1　The optimum hydrolysis condition of enzymes

式中：W為樣品中氨基氮含量，g/100 mL；V1為測定用樣品加入甲醛稀釋NaOH標準液的體積，mL；V2為試劑空白試驗加入甲醛后消耗NaOH標準液的體積，mL；V3為樣品稀釋液取用量，mL；C為NaOH標準液的濃度，mol/L；14為N的摩爾質量，g/mol。

總氮的測定：稱取一定量的蛋白凍干粉于105℃的烘箱中干4 h，待降至室溫后稱重，隨后繼續干燥樣品，每干燥1 h，稱重一次，恒重即可。經消化、蒸餾后，用0.010 0 mol/L標準鹽酸溶液滴定至終點。計算公式如下：

總氮含量/%=（V2-V1）×C×0.014×6.25m×V′/V×100

式中：V2為滴定試樣時所需標準酸溶液體積，mL；V1為滴定空白時所需標準酸溶液體積，mL；C為鹽酸標準溶液濃度，mol/L；m為試樣質量，g；V為試樣分解液總體積，mL；V′為試樣分解液蒸餾用體積，mL。

2.3.2水解度的計算

水解度的計算公式如下：

2.3.3對α-淀粉酶活性抑制率測定

參照DNS（3，5-二硝基水楊酸）比色法［12］。將α-淀粉酶溶液在37℃水浴中孵育5 min后，加入淀粉溶液（1%）以啟動反應，向反應體系中加入多肽液，體系于37℃反應20min后，加入NaOH停止反應，并加入2mL DNS，于沸水浴中反應10 min，冷卻后于540 nm處測定吸光值，重復3次，α-淀粉酶活性抑制體系見表2。

計算公式如下：

表2　α-淀粉酶活性抑制體系表Table 2　α-amylase activity inhibition system table

2.4單酶最佳酶解條件［13］

根據5種酶的水解度和對α-淀粉酶抑制率的效果，選出合適的蛋白酶即酶Ⅰ和Ⅱ，通過底物濃度、時間、pH 4、酶用量（酶量/底物量）種單因素設計正交試驗，得到單酶的最佳水解條件。

酶Ⅰ（堿性蛋白酶）正交試驗：采用底物濃度2 g/100 mL～4 g/100 mL，酶解pH 8.0～10.0，酶解時間2 h～4 h，酶用量8 000 U/g～12 000 U/g（酶量/底物量），進行正交試驗，以確定酶Ⅰ最佳水解條件，選用因素及水平見表3。

表3　酶Ⅰ選用因素和水平Table 3　The selection factors and levels of enzymeⅠ

酶Ⅱ（中性蛋白酶）正交試驗：采用底物濃度2 g/100 mL～4 g/100 mL，酶解pH 6.0～8.0，酶解時間2 h～4 h，酶用量8 000 U/g～12 000 U/g（酶量/底物量），進行正交試驗，以確定酶Ⅱ最佳水解條件，選用因素及水平見表4。

表4　酶Ⅱ選用因素和水平Table 4 The selection factors and levels of enzymeⅡ

2.5加酶方式［10］對酶解過程影響

以水解度和對α-淀粉酶抑制率為指標考察分步加酶和同時加酶對核桃蛋白酶解過程的影響。分步加酶的方式為先加入一種酶，水解完成后滅酶，調整最佳條件下加入第二種蛋白酶水解；同時加酶為在兩種酶中采取較合適的水解條件下同時加入兩種酶進行水解。依據單酶最佳酶解結果，加酶方式設計見表5。

表5　加酶方式Table 5　Sequence of adding enzyme

3　結果與分析

3.1蛋白含量測量

在試驗研究中，為了增加核桃蛋白的溶解性和測量結果的準確性，首先對核桃蛋白凍干粉進行粉粹、過篩前處理，盡量減小蛋白顆粒直徑，促進溶解；同時在溶解蛋白時采用遠離其等電點范圍（pH 4.0～4.5）［14］的pH約為8.0的溶劑，并且將核桃蛋白液通過0.45 μm微孔濾膜過濾后在進行UV檢測。經此處理后，蛋白凍干粉的產率為9.38%，在0.5%濃度下純度可達到56.36%。

3.2最適單酶的選擇

各種蛋白酶水解核桃蛋白的能力各不相同，根據各個酶廠家提供的酶的最適條件，在各種酶的最適條件下，水解核桃蛋白4 h，測定各種酶對核桃蛋白的水解度和酶解液對α-淀粉酶抑制率如圖1。

圖1　5種蛋白酶水解效果的比較Fig.1　The Comparison of five enzymes

從圖1中可看出堿性蛋白酶對核桃蛋白的水解度最高，且對α-淀粉酶抑制率較高，因此，確定堿性蛋白酶水解核桃蛋白能力最強，為最適水解酶。同樣就中性蛋白酶和酸性蛋白而言，兩種酶對核桃蛋白的水解能力基本一致，雖然酸性蛋白酶對α-淀粉酶抑制率最高，但是酸性蛋白酶最適pH與核桃蛋白的等電點相近，使得核桃蛋白溶解性很差，對蛋白的酶解影響較大。因此，最終選擇堿性蛋白酶（酶Ⅰ）和中性蛋白酶（酶Ⅱ）作為后期復合酶酶解的種類。

3.3單酶最佳酶解工藝

3.3.1酶Ⅰ（堿性蛋白酶）正交試驗

酶Ⅰ（堿性蛋白酶）正交試驗結果與分析見表6。

表6　酶Ⅰ（堿性蛋白酶）正交試驗結果與分析Table 6　The results and analysis of orthogonal test on enzymeⅠ（Alkaline Protease）

由表6可見RA＞RB＞RD＞RC，即底物濃度（A）、酶解時間（B）、酶解pH（C）和酶用量（D）4個因素對試驗考查指標影響的主次關系是ABDC，即底物濃度影響最大，酶解時間次之，隨之是酶用量，酶解pH影響最小。由于kA1＞kA3＞kA2，所以可以確定A1為A因素的最優水平。同理B3、C2和D2分別為B、C和D三因素的最優水平。故酶Ⅰ（堿性蛋白酶）酶解核桃蛋白的最佳工藝條件為：A1B3C2D2，即底物濃度為2 g/100 mL，酶解時間為4 h，酶解pH為9，酶用量為10 000 U/g。經試驗驗證，在A1B3C2D2條件下，核桃蛋白水解度達30.08%。3.3.2酶Ⅱ（中性蛋白酶）正交試驗

酶Ⅱ（中性蛋白酶）正交試驗結果與分析見表7。

由表7可見RA＞RC＞RB＞RD，即底物濃度（A）、酶解時間（B）、酶解pH（C）和酶用量（D）4個因素對試驗考查指標影響的主次關系是ACBD，即底物濃度影響最大，酶解pH次之，隨之是酶解時間，酶用量影響最小。由于kA1＞kA2＞kA3，所以可以確定A1為A因素的最優水平。同理B2、C2和D1分別為B、C和D三因素的最優水平。故酶Ⅱ（中性蛋白酶）酶解核桃蛋白的最佳工藝條件為：A1B2C2D1，即底物濃度為2 g/100 mL，酶解時間為3 h，酶解pH為7，酶用量為8 000 U/g。經試驗驗證，在A1B2C2D1條件下，核桃蛋白水解度達17.48%。

3.4加酶方式對水解度的影響

按照試驗方法2.5，以水解度和對α-淀粉酶抑制率為指標，考查加入方式對水解過程的影響，試驗結果見圖2。

表7　酶Ⅱ（中性蛋白酶）正交試驗結果與分析Table 7　The results and analysis of orthogonal test on enzymeⅡ（Neutral protease）

圖2　不同加酶方式試驗結果與分析Fig.2　The results and analysis of different enzyme tests

由圖2可知，不論以何種方式加酶，復合酶的水解效果都優于單酶，并且分步加入酶方式的水解度明顯高于同時加入酶的方式。這是因為分步加酶的方式最大限度地保證在各個酶反應都是在最佳條件，因此選用分步依次加酶能夠達到最大水解度，保證對α-淀粉酶抑制率最大的5號試驗組方案，即先在最佳條件（參考3.3.1）下加中性蛋白酶，經歷滅酶，調整至最佳條件（參考3.3.2）下再加堿性蛋白酶，并且保證中性蛋白酶與堿性蛋白酶酶解時間和酶量比為1∶2。

4　結論

核桃蛋白水解程度與酶解釋放出具有對α-淀粉酶抑制率的生物活性肽密切相關。本文以核桃蛋白的水解度以及酶解產物對α-淀粉酶抑制率為綜合評價指標，考察了5種單酶及復合酶對核桃蛋白酶解效果的影響。

研究5種單酶在生產商提供的最適條件下，對核桃蛋白的水解度大小依次為：堿性蛋白酶＞中性蛋白酶≈酸性蛋白酶＞胃蛋白酶＞胰蛋白酶，而酶解產物對α-淀粉酶抑制率大小依次為：酸性蛋白酶＞中性蛋白酶＞堿性蛋白酶＞胃蛋白酶＞胰蛋白酶，且結合核桃蛋白在pH 3.5～4.5溶解度很低，因此選用堿性蛋白酶和中性蛋白酶作為復合酶組分。

分別對堿性蛋白酶和中性蛋白酶進行正交試驗，確定其最佳酶解條件。分別為，堿性蛋白酶：底物濃度為2 g/100 mL，酶解時間為4 h，酶解pH為9，酶用量為10 000 U/g；中性蛋白酶：底物濃度為2 g/100 mL，酶解時間為3 h，酶解pH為7，酶用量為8 000 U/g。

考察分步依次加酶和同時加酶對核桃蛋白酶解的影響，試驗結果表明論以何種方式加酶，復合酶的水解效果都優于單酶，并且分步依次加入酶方式的水解度明顯高于同時加入酶的方式，并且先加中性蛋白酶再加堿性蛋白酶的方式可使核桃蛋白水解度達到40%左右，同時還保證酶解產物對α-淀粉酶抑制率較大，達到85.9%。

本試驗結論可為后續核桃多肽功能性開發利用提供參考依據，核桃作為優質植物蛋白、多肽營養重要來源之一，對其功能性的開發將有助于我國核桃資源的充分利用，將對我國開發新型功能性食品有深遠意義。

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Study on the Key Technology of Enzymatic Hydrolysis for Preparation of Walnut Peptides

LI Li1，2，LIU Yang1，2，ZHANG Shuai1，ZHOU Han-li1，2，WANG Ya-yun1，2，WU Na1，2，RUAN Jin-lan1，2，*
（1.Synergy Innovation Center of Biological Peptide Antidiabetics of Hubei Province，School of Life Science，Wuchang University of Technology，Wuhan 430223，Hubei，China；2.School of Chemical Engineering and Pharmacy，Wuhan Institute of Technology，Wuhan 430073，Hubei，China）

Taking the walnut as raw material，degree of hydrolysis and the inhibition rate to α-amylase as index，the enzyme hydrolysis technology was studied about single-enzyme hydrolysis，multi-enzyme hydrolysis，sequence of adding enzyme and the best formula of multi-enzyme by orthogonal.The rank of hydrolysis rate of single-enzyme was：alkaline protease＞neutral protease≈acidic protease＞pepsin＞trypsin，and inhibition rate of hydrolysates to α-amylase was in the order of：acid protease＞neutral protease＞alkaline protease＞pepsin＞trypsin.The effects of multi-enzyme hydrolysis by adding enzymes in turn were better than that at the same time. Considing all，the alkaline protease and neutral protease was added in turn，the hydrolysis rate of walnut protein could reach about 40%，and also keep a higher inhibition rate to α-amylase，which could up to 85.9%.

walnutpolypeptide；enzymatichydrolysis；α-amylase；walnut

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.15.030

湖北省自然科學基金資助項目（2013CFB482）；湖北省大學生創新訓練項目（201312310012）

李麗（1992—），女（漢），碩士研究生，研究方向：生物多肽糖尿病藥物研究。

阮金蘭，教授，研究方向：天然藥物藥效物質基礎研究。

2015-08-20