芪桂益脈靈對大鼠急性心肌缺血模型P38及ERK 1/2蛋白表達的影響

徐京育， 張超越， 趙 龍

芪桂益脈靈對大鼠急性心肌缺血模型P38及ERK 1/2蛋白表達的影響

徐京育1， 張超越2， 趙 龍2

（1.黑龍江中醫藥大學附屬第一醫院心血管病四科， 黑龍江 哈爾濱 150040 2.黑 龍 江 中 醫 藥 大 學 研 究 生 學 院， 黑龍江 哈爾濱 150040）

目的：觀察芪桂益脈靈對大鼠急性心肌缺血模型心肌組織中P38及ERK1/2蛋白表達的影響。方法：取SD大鼠50只，隨機分為5組，空白對照組灌服生理鹽水后不做任何處理，假手術組灌服生理鹽水后，開胸暴露左冠狀動脈，穿線但不作結扎，其余大鼠分別分成單純缺血再灌注組、芪桂益脈靈低劑量組和芪桂益脈靈高劑量組，分別給生理鹽水、芪桂益脈靈（大、小劑量），連續灌服7d，并且結扎冠狀動脈左前降支造成急性心肌梗死模型，造模成功后，取其心臟組織用中性福爾馬林固定。用免疫組化法檢測心肌組織P38和ERK1/2的蛋白表達水平。結果：單純缺血再灌注組P-P38和P-ERK1/2與假手術術組比較蛋白表達升高（P＜0.05）；灌藥組與單純缺血再灌注組比較，P-P38表達明顯降低，PERK1/2表達升高顯著（P＜0.05），高劑量組效果更佳。結論：芪桂益脈靈能夠抑制P38通路，減輕其磷酸化，并且能夠升高ERK1/2磷酸化水平，減輕炎癥因子的產生，減少心肌細胞的凋亡，能夠協同減輕缺血再灌注損傷。

芪桂益脈靈； 心肌缺血再灌注； P38絲裂原活化蛋白激酶； ERK1/2細胞外信號調節激酶

P38絲裂原活化蛋白激酶家族是體內重要的信號傳導通路之一［1，2］，ERK1/2細胞外調節激酶也是調節細胞凋亡和生存信號通路的重要部分。目前已發現的MAPK信號通路至少有3條，即EAK通路、JNK通路以及P38MAPK通路。EAK主要是由有絲分裂刺激源激活，而P38主要由應激刺激及炎癥因子刺激下激活［3］。前期實驗研究表明，芪桂益脈靈能抑制急性缺血再灌注損傷大鼠模型血管細胞粘附分子-1和微血管細胞間粘附分子-1的表達，減輕由炎癥導致的血管損傷，保護心臟功能。本研究，將進一步探討，芪桂益脈靈對心肌缺血再灌注損傷P38和ERK1/2信號通路的影響。

1 資料與方法

1.1 動物與分組：健康雄性SD大鼠50只，體重200～250g，由黑龍江中醫藥大學實驗動物中心提供［許可證號：SCXK（黑）2013-004］。將大鼠隨機分為5組，每組10只，最終入組8只?？瞻捉M每天清晨空腹灌服2mL生理鹽水、假手術組每天清晨空腹灌服生理鹽水2mL、單純缺血再灌注組每天清晨空腹灌服生理鹽水2mL、芪桂益脈靈低劑量組每天清晨空腹灌服芪桂益脈靈0.6g/kg 2 mL、芪桂益脈靈高劑量組每天清晨空腹灌服芪桂益脈靈1.2 g/kg 2 mL。

1.2 主要試劑：芪桂益脈靈中藥復方，由黨參，黃芪，黃連，三七，苦參，龍齒，桂枝，麥冬，五味子，炒棗仁組成，藥物來自江陰天江藥業有限公司，每毫升相當于生藥1.25mg；Sc-7149（兔一抗）試劑盒，sc-101759（兔一抗）試劑盒，pv-9001（兔二抗）試劑，購自北京中杉金橋生物技術有限公司。BS-3016R HPR（兔一抗）試劑、BS-0022R HPR（兔二抗）試劑，均購自北京博奧森生物技術有限公司。

1.3 主要設備及儀器：①小動物呼吸機（DH-150浙江大學醫學儀器廠生產）；②心電機（ECG-1150型，上海光電醫用電子儀器有限公司）；③低溫冰箱（日本三洋公司）；④電子分析天平（梅特勒-托利多儀器上海有限公司）；⑤NiKon E200光學顯微鏡（日本）；⑥冰凍切片機。

1.4 模型制備：SD大鼠飼用20%烏拉坦（1g/kg）腹腔麻醉固定于手術臺上并監測心電，氣管切開，連小動物呼吸機，潮氣量為12ml，呼吸頻率為90次/min，呼吸比為1：1。從胸骨左緣3、4肋間開胸，鈍性分離打開心包膜，充分的暴露心臟；于左心耳和肺動脈圓錐之間，經左冠狀動脈前降支下淺層心肌穿過一條絲線，兩端穿一條聚乙烯塑料管，末端用小動脈夾固定，最后將心臟送回胸腔。通過夾緊、打開小動脈夾造成冠狀動脈的缺血和再通。記錄冠狀動脈前降支結扎前后及再通后心電圖?？瞻捉M：只開胸，不穿線，不結扎；假手術組：開胸、只穿線但不結扎；單純缺血再灌注組：末次灌藥后1h行左主冠狀動脈結扎60min，再灌注180min；芪桂益脈靈高、低劑量組造模方法與單純缺血再灌注組相同。造模成功評判標準：心電圖示：S-T段拱背向上抬高；反復灌注后出現心律失常。

1.5 p38、ERK1/2的檢測：實驗結束后，取大鼠心臟，采用0.9%的氯化鈉溶液沖洗，用4%中性福爾馬林固定，采用免疫組化法檢測。檢測步驟如下：①脫蠟、水化組織切片；②根據應用的一抗的特殊要求，對組織切片進行預處理；③3%H2O2去離水孵育10min，以阻斷內源性過氧化物酶；④PBS沖洗，2min3次；⑤滴加一抗，室溫或37度孵育1～2h，PBS沖洗，3次/2min。⑥滴加試劑1，37度孵育10～20min，2min PBS沖洗3次；⑦滴加試劑2，37度孵育10～20min，PBS 2min沖洗3次；⑧應用DAB溶液顯色⑨用生理鹽水，進行充分沖洗、復染、脫水、透明、封片。見圖1、圖2。

1.6 統計學處理：應用SPSS19.0統計軟件包進行數據整理，所有資料以均數±標準差（ˉx±s）的形式表示，多組間比較用單因素方差分析，組間差異比較用SNK -q檢驗，以P＜0.05具有統計學意義。

2 結 果

2.1 P38和P-P38實驗結果：實驗各組大鼠心肌組織中P38蛋白表達較穩定，無顯著差異，組間差異無統計學意義（P＞0.05）；假手術組與空白組相比，大鼠心肌病理情況并無明顯差異，肌纖維排列相對規則，細胞核橢圓形，間質未見明顯異常，P-P38蛋白表達差異無統計學意義（P＞0.05），說明不結扎不引起P38MAPK信號通路的激活；缺血再灌注組與空白組和假手術組比較，心肌纖維出現斷裂溶解，間質出現水腫且增大，P-P38蛋白表達升高，有統計學意義（P＜0. 05），說明心肌缺血再灌注能夠使P38MAPK信號通路激活，使其磷酸化，也進一步表明造模的成功；芪桂益脈靈組與單純缺血再灌注相比，心肌間質水腫減輕，心肌纖維排列較為規則，P-P38蛋白表達下降，差異有統計學意義（P＜0.05）；高低劑量組比較，高劑量組心肌組織水腫現象減輕的更加明顯，P-P38降低更明顯（P＜0.05），說明芪桂益脈靈能夠抑制P38MAPK磷酸化水平，對缺血心肌具有保護作用，高劑量組效果更佳。

2.2 ERK1/2和P-ERK1/2實驗結果：實驗各組大鼠心肌組織中ERK1/2蛋白表達較穩定，無顯著差異，組間差異無統計學意義（P＞0.05）；假手術組與空白組相比，大鼠心肌病理情況并無明顯差異，肌纖維排列相對規則，細胞核橢圓形，間質未見明顯異常，P-ERK1/2蛋白表達差異無統計學意義（P＞0.05），說明不結扎不能激活ERK1/2信號通路。

2.3 缺血再灌注組與空白組和假手術組比較，心肌纖維出現斷裂溶解，間質出現水腫且增大，P-ERK1/2蛋白表達升高，差異具有統計學意義（P＜0.05），說明心肌急性缺血再灌注損傷能夠激活ERK1/2信號通路，提高其磷酸化水平，也表明造模的成功；芪桂益脈靈組與單純缺血再灌注相比，心肌間質水腫減輕，PERK1/2蛋白表達水平升高，差異有統計學意義（P＜0. 05）；高低劑量組比較，高劑量組心肌組織水腫現象減輕的更加明顯，P-ERK1/2升高更顯著（P＜0.05），說明芪桂益脈靈能夠提高P38MAPK磷酸化水平，對缺血心肌具有保護作用，高劑量組效果更佳。

表1 各組大鼠心肌組織P38 P-P38 ERK1 /2 P-ERK1 /2 蛋白水平的比較s）

表1 各組大鼠心肌組織P38 P-P38 ERK1 /2 P-ERK1 /2 蛋白水平的比較s）

注：灌藥組與單純缺血再灌注組比較均P＜0.05，高劑量組與低劑量組比較P＜0.05

組別　n　P38　P-p38　ERK1/2　P-ERK1/2空白組　8　0.80±0.25　1.23±1.12　0.75±0.05　0.32±0.03假手術組　8　0.82±0.09　2.55±1.43　0.75±0.05　0.38±0.02單純缺血再灌注組　8　0.84±0.30　13.69±3.65#　0.82±0.12　0.78±0.13◇芪桂益脈靈低劑量組　8　0.82±0.14　7.90±2.09#△○　0.81±0.14　2.12±0.11◇☆★芪桂益脈靈高劑量組　8　0.78±0.21　5.16±1.63#△○　0.82±0.21　2.31±.0.21◇☆★

圖1 P-P38組圖

圖2 P-ERK1/2組圖

3 討 論

近年來，血運重建術迅速發展和推廣應用，已經成為冠狀動脈粥樣硬化性心臟病治療的重要手段之一，該法能夠迅速讓缺血心肌恢復血流供應，但在此同時，又會造成相關損傷［4］。目前中藥對缺血再灌注損傷心肌影響效應及機制研究主要有以下幾個方面：①調控凋亡基因，拮抗細胞凋亡；②減少白細胞聚集，拮抗粘附分子表達；③改善心血管內皮細胞功能，調節血管活性因子活性；④保護細胞線粒體，改善細胞能量代謝；⑤抑制心肌細胞氧自由基、抗氧化；⑥抑制心肌細胞鈣超載；⑦干預MIRI期間的炎癥反應。中藥能多靶點，多途徑對缺血再灌注損傷的發揮護作用［5］。有研究表明，內皮損傷是心肌缺血再灌注損傷的關鍵因素，粘附分子是介導內皮損傷的重要環節，而P38MAPK信號通路在調控粘附分子的轉錄和表達過程中起到重要作用，缺氧等應急刺激、炎性因子等作用于內皮細胞使P38MAPK磷酸化激活，損傷內皮細胞，可見，抑制P38信號通路，能對心肌細胞起保護作用［6］。

ERK1/2是調節細胞凋亡及生存信號通路的重要部分，該通路的激活對缺血心肌保護有重要的作用，它可以抑制心肌細胞的凋亡、防止心肌細胞的壞死。有研究發現，ERK1/2通路的激活，可參與蛋白質和糖原的合成、葡萄糖的攝取和細胞的存活等多個細胞過程，心肌缺血后可引起 ERK1/2活性降低，所以提高ERK1/2活性，可以抑制細胞凋亡，起到心肌保護作用［7］。故本實驗從細胞凋亡入手，探討芪桂益脈靈對缺血再灌注損傷P38通路和ERK1/2通路的影響。本實驗研究顯示，芪桂益脈靈不增加P38和ERK1/2的總表達，而是通過降低P38磷酸化水平，提高ERK1/2磷酸化水平抑制細胞凋亡，減輕炎癥反應。由此表明，芪桂益脈靈具有很好的改善急性心肌缺血再灌注損傷，減輕心肌的壞死灶，改善心肌的病理學改變，保護損傷心肌。

芪桂益脈靈本方由黃芪、桂枝、三七、黨參、麥冬、五味子等藥物組成，方中黃芪補氣諸藥之最，可補全身之氣，桂枝溫通經脈，二藥相互配伍，為補氣通脈的主藥；黨參助黃芪增強補氣行氣作用；三七活血化瘀，養血行血通脈。諸藥相互配伍，實現益氣活血化瘀通脈之功效。此外，現在藥理研究發現，黃芪能清除自由基，促進血清蛋白質的更新，促進機體代謝，擴張冠脈血管和外周血管，黨參、麥冬、五味子能增加冠脈血流量，降低心肌耗氧，改善微循環。芪桂益脈靈能夠下調缺心肌組織P-P38蛋白表達，升高P-ERK1/2蛋白表達，抑制細胞凋亡，具有抗心肌缺血損傷的作用。

［1］ 金世云，何淑芳，吳昊，等.MAPK通路在瑞芬太尼預處理減輕心衰大鼠離體心臟缺血/再灌注損傷中的作用［J］.中國藥理學通報，2014，11：1590～1595.

［2］ 鄭曉丹，嚴世蕓，秦仲君.通心脈方對大鼠心肌缺血再灌注損傷AKt及p38αMAPK蛋白表達的影響［J］.中醫研究，2011，6：14～17.

［3］ 武敏.ERK1/2在不同年齡大鼠離體心臟缺血后適應中的保護作用［D］.河北醫科大學，2014.

［4］ 王峰，李建生，高劍峰.川芎嗪、參附注射液及聯合應用預處理對心肌缺血再灌注損傷大鼠心肌的保護作用［J］.中國實驗方劑學雜志，2015，16：147～151.

［5］ 蔡麗.大鼠腦缺血再灌注損傷Cathepsin D介導的細胞凋亡與ERK1/2信號通路的關系［D］.南華大學，2014.

［6］ 田明慧.厄貝沙坦對大鼠心肌缺血再灌注細胞凋亡與ERK1/2通路的影響［D］.遼寧醫學院，2012.

［7］ 李焰，劉鳳麗，田艷霞，等.依達拉奉對腦缺血再灌注損傷后p-ERK1/2表達的影響［J］.天津醫藥，2010，4：310～312，355.

黑龍江省自然科學基金，（編號：H201326）

趙 龍

1006-6233（2016）08-1302-04

A 【doi】10.3969/j.issn.1006-6233.2016.08.027