人臍帶間充質干細胞體外分離培養及其生物學特性的研究*

韓　瀟，白　海，趙　強，楊　柯，歐劍鋒

(1.蘭州大學第二醫院血液內科，蘭州 730030；2.蘭州軍區蘭州總醫院血液科/全軍血液病中心，蘭州 730050)

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論著·基礎研究

人臍帶間充質干細胞體外分離培養及其生物學特性的研究*

韓瀟1,2，白海2△，趙強2，楊柯2，歐劍鋒2

(1.蘭州大學第二醫院血液內科，蘭州 730030；2.蘭州軍區蘭州總醫院血液科/全軍血液病中心，蘭州 730050)

目的研究人臍帶間充質干細胞(MSCs)詳細的生物學特性，包括其細胞形態、免疫表型、純度及增殖能力，從而建立穩定的MSCs體外分離培養體系。方法將剔除動靜脈及內膜的新鮮人臍帶組織剪切成1 mm3小塊，用含10% 胎牛血清的DMEM/F12培養，得到貼壁細胞。觀察貼壁細胞形態，利用CCK-8試劑盒測定生長曲線，流式細胞術研究特殊細胞表面抗原CD29、CD73、CD90、CD105、CD31、CD14、CD34、CD45、CD11b、HLA-DR表達，并檢測細胞周期。結果體外培養7～10 d后，可見細胞從組織塊中游出；細胞主要呈紡錘體樣、成纖維細胞樣形態；生長曲線顯示其增殖能力強；特殊表面抗原CD29、CD73、CD90、CD105表達強陽性，造血性抗原標志CD31、CD14、CD34、CD45、CD11b、HLA-DR表達均呈陰性，流式細胞儀周期檢測結果顯示G0/G1期細胞超過80%。結論利用組織塊法可有效獲得人臍帶MSCs，具有高純度、低成本優點，并在體外較易培養、擴增。

流式細胞術；人臍帶間充質干細胞；培養；分離；組織工程

間充質干細胞(mesenchymal stem cells,MSCs)是存在于多種組織中的一種非造血多能干祖細胞，可誘導分化成不同的細胞系。人體內包括骨髓、脂肪組織、皮膚、肝臟、胎盤及臍帶在內的組織均可產生MSCs[1]。然而，來源不同的MSCs在分化成多種細胞系時具有不同的潛能。在活體條件下，MSCs最重要的特性是具有較強的自我更新能力和分化潛能，如成骨細胞、脂肪細胞、軟骨細胞或骨骼肌細胞[2]。最近研究表明，體外培養的MSCs具有修復受損組織和免疫調節的潛能，已應用于臨床[3]。但人體骨髓單核細胞功能中MSCs所占比例極小，其增殖分化潛能和擴增數量隨著供體年齡的增加而下降，且骨髓穿刺是一種侵入性過程，也使其來源受限。因此，當前認為人臍帶MSCs是一種理想的取代骨髓MSCs的資源[4-5]。本研究從人臍帶分離擴增培養MSCs，鑒定其詳細的生物學特征，為組織工程種子細胞提供有效的體外擴增培養體系和方法。

1　材料與方法

1.1儀器與試劑臍帶取自蘭州軍區蘭州總醫院產科同一足月剖宮產健康產婦，符合倫理學要求且均知情同意，收集標本后4 h內處理。DMEM/F12培養液、胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)及0.25%胰蛋白酶-EDTA(1×)均購自美國Gibco公司，培養皿、培養瓶及凍存管均購自美國Corning公司,CCK-8購自日本Dojindo研究所，流式細胞儀(FACS Calibur)及CD29-PE、CD73-PE、CD90-PE、CD105-PE、CD31-PE、CD14-PE、CD34-PE、CD11b-PE、CD45-Percp、Anti-HLA-DR-FITC標記的抗人單克隆抗體均購自美國Becton Dickinson公司，二甲基亞砜(DMSO)購自韓國BIOSHARP公司，CO2培養箱購自美國Thermo公司，倒置相差顯微鏡購自日本Olympus公司，酶聯免疫分析儀購自奧地利Tecan集團公司，細胞周期檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術研究所。

1.2細胞分離與培養足月生產后獲取新鮮人臍帶，4 h內用DMEM/F12(含10% FBS)培養基4 ℃運至實驗室，在超凈工作臺內浸入75% 乙醇30 s，PBS反復沖洗直至無血液及血塊后，置于DMEM/F12培養基大皿中，剔除動靜脈血管及內膜，培養基清洗數次，剪為1 mm3大小組織塊，以適當密度接種于直徑15 cm的大皿中，加入5.0 mL含體積分數10% FBS 的DMEM/F12培養基，置于37 ℃，5% CO2飽和濕度的培養箱內培養。次日加入10.0 mL相同培養基，繼續培養3～5 d后待組織塊貼壁后半量換液，此后每5～7 天更換1次培養基，10～14 d后剔除組織塊。待全血細胞貼壁融合至80%時，用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化收集細胞，按1∶3的比例傳代培養。

1.3臍帶MSCs生長曲線測定取第3代細胞，按2×104/mL密度接種于96孔培養板內，每板按4×5的規格連續接種20孔，每孔200 μL，共計7板。接種第2天起，每天固定時間取1板加入10 μL CCK-8液，混勻。37 ℃繼續孵育3 h后，酶標儀測定每孔吸光度(A)值，連測7 d，根據A450nm值繪制細胞生長曲線，每板3次重復。

1.4臍帶MSCs表面抗原檢測取第3代細胞，棄去培養液，PBS洗滌1遍，0.25%胰蛋白酶-EDTA消化收獲細胞，每管加入100 μL密度為1×106/mL的單細胞懸液，然后分別加入CD29-PE、CD73-PE、CD90-PE、CD105-PE、CD31-PE、CD14-PE、CD34-PE、CD45-Percp、CD11b-PE、HLA-DR-FITC抗體各10 μL，室溫避光孵育30 min，PBS洗滌重懸，流式細胞儀上機檢測，Cell-Quest(Mac)軟件分析，每個樣本至少收獲20 000個細胞。

1.5臍帶MSCs細胞周期檢測取第3代細胞，棄去培養液，PBS洗滌1遍，0.25%胰蛋白酶-EDTA消化收獲細胞，再用PBS液洗滌1遍，加入1.0 mL-20 ℃的70%乙醇，混勻，4 ℃固定24 h，離心去上清，加入1.0 mL冷浴PBS，混勻，再次離心去上清后，每管加入0.5 mL配好的PI染液，混勻，37 ℃避光溫浴30 min，流式細胞儀檢測，ModFitLT V3.2(Mac)軟件分析，每個樣至少收獲20 000個細胞。

2　結　　果

2.1臍帶MSCs的形態學觀察組織塊培養7～10 d后，可見組織塊周圍有細胞游出，且在組織塊周圍形成50%～75%的融合，其細胞形態呈多角形或短梭形，不規則(圖1)。繼續培養8～10 d后去除組織塊，并換液培養3～5 d后，貼壁細胞迅速增生，達80%～90%融合，形態類似于短成纖維細胞，胞質豐富，核偏大，呈平行排列、旋渦狀、網狀、輻射狀生長，細胞界限不清楚(圖2)，消化傳代。傳代細胞在4～12 h內完全貼壁，繼續培養3～5 d后，重新變為長梭形成纖維樣細胞，細胞大小均一，低倍鏡下觀察見細胞呈旋渦狀或單極向放射狀生長(圖3)。細胞傳代后生長迅速，增生快，5～7 d達到80%～90%融合。

A:4倍鏡下所見;B:10倍鏡下所見。

圖1組織塊培養7 d時形態

A：4倍鏡下所見；B：10倍鏡下所見。

圖2去除組織塊培養3 d后所見形態

圖3　　第1代所見細胞形態(4倍鏡下所見)

圖4　　臍帶MSCs生長曲線

2.2臍帶MSCs生長曲線的分析由圖4可見，1～3 d曲線陡升，為細胞生長對數期，3～5 d曲線平緩，略有上升，第6天開始有所下降，說明細胞生長已進入平臺期，整個過程符合干細胞生長規律。經計算其倍增時間約為50 h。

2.3臍帶MSCs的細胞周期分析通過檢測臍帶MSCs細胞的DNA含量，發現G1期細胞超過80%，G2/G1=1.86，說明此貼壁細胞增殖活躍，與干細胞生長特性相一致，見圖5。

圖5　　細胞周期分析結果

2.4臍帶MSCs細胞表面抗原特性流式細胞儀檢測抗原結果顯示，臍帶MSCs特殊表面抗原CD29、CD73、CD90、CD105表達強陽性，造血性抗原標志CD31、CD14、CD34、CD45、CD11b、HLA-DR表達則呈陰性，見圖6。

圖6　　細胞表面抗原分析結果

3　討　　論

1960年，有研究者首次在骨髓間葉組織中發現一種非造血干細胞并將其命名為MSCs，他們發現這是一種具有可塑黏附、成纖維樣細胞，并可分化為軟骨細胞、脂肪細胞和骨細胞。大量研究表明，MSCs治療對各種組織的修復具有重要意義[6]。應用MSCs可減少移植后惡性疾病發展的風險，還能避免胚胎干細胞相關的倫理問題[7]。在活體條件下，MSCs最重要的特性是具有明顯的自我更新能力和分化潛能，如脂肪細胞、成骨細胞、軟骨細胞、神經元或骨骼肌細胞[2]，此分化過程是促進再生的一個基本步驟。

近年來，臍帶代替骨髓作為MSCs的一種選擇性資源，其特性優于骨髓及其他成人組織[8]。組織塊法和酶消化法是從人臍帶中分離MSCs的兩種主要技術[9]。盡管在收集臍帶后，組織塊法花費更多時間才能獲得細胞，但這種方法可獲得更純、少血源性細胞，且增殖率較高[10]。相對于酶消化法，組織塊法實驗強度較小，且更能節省成本，因此，此法更適合臨床目的。酶消化法可能引起一些問題，包括在應用于臨床但未證實的不同樣本中，由于細胞溶解酶活性及其對膠原酶敏感性的差異，從而減弱了細胞的生存能力[11]。Yoon等[12]分別用組織塊法和酶消化法從沃頓膠質中分離MSCs，并描述了組織塊法產生的細胞生存能力更強，且MSCs數量也更多。他們的研究顯示組織塊法提取MSCs的數量是酶消化法提取MSCs數量的2.8倍。他們也檢測了培養基中由沃頓膠質碎片分泌的基礎成纖維生長因子(bFGF)，并發現這種生長因子在組織塊法培養的主要階段從其組織碎片中釋放而出。Iftimia-Mander 等[13]研究亦表明酶消化法從儲存時間較長的臍帶中分離出的MSCs，其產量較組織塊法低。這可能是由于臍帶長期儲存未處理，使細胞更容易分離為單個細胞，從而在消化期間更易受損。此外，臍帶儲存期間細胞外基質降解，從而在組織塊培養過程中，間充質貼壁細胞能更好地游出組織。

本研究應用組織塊法分離、培養與鑒定MSCs。根據細胞治療國際社會(ISCT)準則，MSCs在標準培養條件下以可塑黏附為基礎，須表達CD105、CD90、CD73抗原，而且CD45、CD34呈陰性表達[14]。本實驗通過流式細胞儀檢測，臍帶MSCs特殊表面抗原CD29、CD73、CD90、CD105表達強陽性，而造血細胞表面抗原CD31、CD14、CD34、CD45、CD11b、HLA-DR表達均為陰性，均與ISCT準則相符合。細胞周期顯示80%以上的細胞處于G1期，符合干細胞自我更新特征的靜止期。這些結果均顯示組織塊法可分離出具有干細胞特征的MSCs。組織塊法的另一個益處似乎是培養基中含有自組織碎片分泌的細胞因子和生長因子，這些因子可刺激細胞生長[15]。因此，培養基中不需再添加額外的任何生長因子。由此在研究和臨床環境中組織塊法提取MSCs可使用單純培養基，從而節省更多成本[16]。

用簡單可再生的組織塊法從整條臍帶中分離出大量成纖維細胞樣的MSCs，具有高增殖性，能較好地忍受低溫保存，復蘇后可長期增殖，更重要的是，他們能合成大量營養因子，如神經營養因子、促血管再生因子和造血因子[17]?？傊?，從臍帶分離的細胞能滿足干細胞庫所有需求，包括再生醫學領域中細胞材料可利用的永久性。雖然組織塊法限制臍帶游出的細胞數量，但其獲得的細胞具有更強的新陳代謝活性。實際上，通過應用組織塊技術分離和培養原始細胞，細胞從體內轉到體外，這個過程同時伴有相關組織碎片，且不能從其先前體內條件下立即分離出來。因此，這一過渡階段使細胞能更好地忍受分離壓力；反之，在酶消化分離技術中，當細胞轉入體外后將忍受來自身體和酶干擾分離的雙重壓力。在這方面，Otte等[18]證實了MSCs在原始組織片段存在下的長期體外培養期間保持干細胞特性，這意味著相應組織片段提供一個MSCs可保持其干細胞樣狀態的微環境。

總之，本研究利用組織塊法從人臍帶中成功分離出MSCs，且檢測了其詳細的生物學特性，包括其細胞形態、免疫表型、純度及增殖能力，結果顯示臍帶中富含高增殖性的MSCs，且操作簡單、成本低，從而建立了穩定的MSCs體外分離培養體系。因此，此研究為干細胞種子工程研究和人臍帶MSCs大規模的臨床應用奠定了基礎。

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The study of isolation and culture in vitro of human umbilical cord mesenchymal stem cells and their biological properties*

HanXiao1,2,BaiHai2△,ZhaoQiang2,YangKe2,OuJianfeng2

(1.DepartmentofHematology,SecondHospitalofLanzhouUniversity,Lanzhou,Gansu730030,China;2.DepartmentofHematology,LanzhouMilitaryAreaGeneralHospital/CenterforHematologicDiseasesofChinesePLA,Lanzhou,Gansu730050,China)

ObjectiveTo identify a detailed biological characterization of mesenchymal stem cells (MSCs) isolated from human umbilical cord(UC) tissue regarding their morphology,immunophenotype,purity and proliferative capacity and establish a reasonably cultured and amplified system.MethodsAfter stripping off arteries and veins,the remaining parts of umbilical cord were cut into 1 mm3small sections and cultured with DMEM/F12 containing 10% fetal bovine serum.Adhere cells were obtained and the morphology of the cells was observed under inverted phase contrast microscope.The growth curves of them were drawn by CCK-8 and the cell cycle and surface antigens (CD29，CD73，CD90，CD105，CD31，CD14，CD34，CD45，CD11b，HLA-DR) were detected by flow cytometry.ResultsSeven to ten days after primary culture,adhere cells came out of fragments.The MSCs harvested were a high purity and mainly presented as a fibroblast-like morphology.UC-MSCs had a strong ability of proliferation through the cell growth curve.The special surface antigens CD29，CD73，CD90，CD105 were positive expression,while CD31，CD14，CD34，CD45，CD11b，HLA-DR were negative.More than 80% cells of MSCs were found at G0/G1phase.ConclusionHuman UC-MSCs could be cultured and proliferated in vitro.

flow cytometry;human umbilical cord mesenchymal stem cells;culture;isolate;tissue engineering

10.3969/j.issn.1671-8348.2016.07.004

甘肅省科技重大專項(1102FKDA005)。作者簡介：韓瀟(1990-)，在讀碩士，主要從事血液病及間充質干細胞研究?！?/p>

，E-mail:baihai98@tom.com。

R329

A

1671-8348(2016)07-0876-04

2015-09-08

2015-11-10)