6種藥劑林間注干施藥防控松材線蟲效果分析

李　橋，張紹勇，仇輝康，陳　明，葉玉珠，袁　媛（.浙江省景寧畬族自治縣林業局，浙江 景寧 500；.浙江農林大學 生物農藥高效制備技術國家地方聯合工程實驗室，浙江 臨安00；.浙江省縉云縣森林病蟲害防治檢疫站，浙江 縉云400）

6種藥劑林間注干施藥防控松材線蟲效果分析

李橋1，張紹勇2，仇輝康2，陳明3，葉玉珠1，袁媛1
（1.浙江省景寧畬族自治縣林業局，浙江 景寧 323500；2.浙江農林大學 生物農藥高效制備技術國家地方聯合工程實驗室，浙江 臨安311300；3.浙江省縉云縣森林病蟲害防治檢疫站，浙江 縉云321400）

為研究注干施藥預防松材線蟲Bursaphelenchus xylophilus的效果，以6種松材線蟲藥劑林間注干，測定了施藥2 a內的防治效果。采用高效液相色譜（HPLC）測定了各藥劑主要有效成分注干后3個月和1 a的在樹體殘留動態，并利用松材線蟲恒溫擴增核酸試紙條精準檢測了注藥后死亡松樹體內松材線蟲數量。結果表明：6種注干藥劑林間防治后，對松材線蟲防治效果存在顯著差異（P＜0.05），各種注干藥劑在注干2 a后將馬尾松Pinus massoniana的死亡率控制在0.4%～4.4%，以甲維鹽、阿維菌素、啶蟲脒為主要成分的藥劑注干防治效果在80%以上；藥后1 a高效液相色譜（HPLC）抽檢測定的樹體內各藥劑均有殘留（枯死松樹中未檢測到），其中甲維鹽質量分數較高，平均為（0.15±0.11）mg·kg－1。檢測注藥后死亡松樹體內均有松材線蟲，且平均至少為897.34條·g－1，說明能在樹體內傳導的注干藥劑均有一定的防效及持效期，可在林間推廣和應用。表3參24

森林保護學；松材線蟲；藥劑防治；注干藥劑；殘留檢測；林間效果

松材線蟲Bursaphelenchus xylophilus是目前國際公認的檢疫對象，能引起林業上的最具毀滅性病害——松材線蟲?。?－2］，其原產于北美地區，但在中國和日本造成的損失最為嚴重［3－4］。在傳入中國的30多年中，此病迅速蔓延，國內外學者、林業技術人員等對其防治手段進行不斷探索與實踐，但至今尚未找到根除松材線蟲病的方法［5］。在眾多松材線蟲病的防治方法中，注干施藥是一種有效、安全的防治技術，對未感病松樹進行藥劑注干能夠起到很好的預防效果，特別適合于重點風景名勝、自然文化遺產等地區的松材線蟲病的防治，在害蟲種群的有效控制和保護天敵方面發揮著重要作用［5－6］。對于注干藥劑的篩選，國內外學者也做了大量研究，其中日本、葡萄牙等都開發預防松材線蟲病的注射針劑［6－7］。進入21世紀，中國加大了對松材線蟲病防治藥物的篩選研究［8－11］，取得了系列成果。在實際應用中，林茂松等［12］引入日本2%阿維菌素針注射試驗，證明的確能預防松材線蟲病。賈進偉［13］研究了甲維鹽注干對松材線蟲病的預防和治療效果表明，提前注干預防對松材線蟲的效果達100%；線蟲侵染樹體后20 d注藥，治療效果僅為20%，林間試驗注藥預防1次，可連續3 a將馬尾松Pinus massoniana的死亡率控制在1%以下，說明注干防治可在一定程度上防控松材線蟲的發生與傳播。本研究選取市場上應用較多的6種藥劑，進行其林間防治效果試驗并比較分析，采用高效液相色譜測定了松樹體內各藥劑主要有效成分的殘留量，并利用松材線蟲恒溫擴增核酸試紙條檢測試劑盒測定了注藥前后死亡松樹體內是否含有松材線蟲。試驗結果為松材線蟲的有效防控提供數據參考。

1　材料與方法

1.1供試儀器

Waters 600-2998高效液相色譜儀（Waters Symmetry C18 250×4.6×5 μm），SPE凈化柱（C18，Vac 3 cc/200 mg），美國Waters公司生產；IKA RV10基本型立式旋轉蒸發儀，中國廣州儀科實驗室技術有限公司生產；超聲波清洗儀KQ-500，中國昆山市超聲儀器有限公司生產；搖擺式萬能高速粉碎機，中國溫嶺市林大機械有限公司生產；CGD-8側掛式電動打孔機，中國臨沂華森林業藥械有限責任公司生產。

松材線蟲恒溫擴增核酸試紙條檢測試劑盒及相關配件，中國杭州優思達生物技術有限公司生產。

1.2供試藥劑

甲維鹽標準品（質量分數為97%），阿維菌素標準品（質量分數為99%），中國浙江海正藥業有限公司生產；啶蟲脒標準品（質量分數為97%），中國鄭州綠康化工有限公司生產；苦參堿（質量分數為99%），中國西安瑞仁生物技術有限公司生產；甲醇、乙腈等試劑為色譜純，其他試劑均為分析純，中國國藥集團化學試劑有限公司生產。

6種注干藥劑分別為質量分數為1.0%的阿維菌素微膠囊懸浮劑（A），質量分數為3.0%的甲維鹽松材線蟲注干防治劑（B），質量分數為3.2%的阿維菌素注干劑（C），質量分數為5.0%的啶蟲脒注干劑（D），質量分數為1.0%的甲維鹽松材線蟲注射液（E），質量分數為0.3%的苦參堿松材線蟲疫苗注射液（F）。均購買自市場（鑒于行業關系，不提供生產廠家）。

1.3試驗方法

1.3.1林間防治試驗注干試驗地于浙江省景寧畬族自治縣沙灣鎮仙姑村3，4，11和12號小班松材線蟲病發生區，為獨立山頭，共計33.3 hm2，距村1 000 m，屬純馬尾松林，平均樹高15 m，平均胸徑20 cm，密度1 050株·hm－2左右。將試驗地隨機劃分為8塊標準樣地，標準樣地0.67 hm2，樣地間距大于500 m。其中6種注干藥劑各1塊，清理及不清理枯死松樹處理各1塊作為對照。除清理枯死松樹對照標準樣地（僅2013年1月10日清理）外，其他試驗標準樣地不進行枯死松樹處理（2012年9月至2015 年1月）。于2013年1月10日注干藥劑標準樣地選擇500株健康馬尾松樹按照廠家使用要求注干施藥（50 mL·株－1），藥劑注干部位距離地面松樹基部10 cm處，注干后用紅色噴漆進行編號標記并在冊記錄，清理枯死松樹和不清理枯死松樹對照區分別選擇500株健康馬尾松進行標記并編號。注藥當日（2013年1月10日），分別調查統計7塊標準樣地（除清理枯死松樹對照樣地）的松樹枯死數量，并分別于2014 年1月10日和2015年1月10日調查8塊標準樣地中，標記500株馬尾松樹的死亡數量。

1.3.2松樹體內各藥劑殘留量測定①樣品采集：用高枝剪勾取注藥3個月和1 a后的相同試驗馬尾松主干樹枝5段（至少50 cm長），每種注干藥劑取樣30株樹，其中每標準樣地中死亡馬尾松樹全部取樣，于實驗室內自然陰干，粉碎機打成細小木屑后備用。②樣品提取和凈化［13］：稱取備用木屑100.0 g 于1 000 mL三角瓶中，加入300 mL V（丙酮）∶V（水）=1∶1混合液，震蕩提取30 min，重復3次，過濾去除殘渣后合并提取液，40℃水浴減壓濃縮至干，用10 mL V（甲醇）∶V（水）=80∶20混合液溶解，2 000 轉·min－1離心5 min，取上清液過0.45 μm濾膜，待凈化。采用C18-SPE柱凈化，分別用5 mL的V（甲醇）∶V（水）=80∶20混合液活化和平衡小柱，取1 mL待凈化提取液上樣，然后用20 mL甲醇淋洗3次后（上樣和洗脫過程中流速保持1 mL·min－1），收集洗脫液150 mL圓底燒瓶中，無水硫酸鎂干燥30 min后，40℃水浴減壓濃縮至干，用1 mL甲醇溶解殘留物后待高效液相色譜（HPLC）檢測。③樣品殘留量檢測分析：各種藥劑的分析方法參考下列國家標準和文獻并加以改進：甲維鹽和阿維菌素參照SNT 2114－2008《進出口水果和蔬菜中阿維菌素殘留量檢測方法 液相色譜法》測定，啶蟲脒參照GB/T 23584－2009《水果、蔬菜中啶蟲脒殘留量的測定》進行測定，苦參堿參照文獻［14］的方法測定。采用外標法將各藥劑將配制成質量濃度為0.1，0.5，1.0，5.0，10.0 mg·L－1的系列標準工作溶液，按照分析方法中注干藥劑的儀器色譜條件進行測定，并繪制標準曲線。④添加回收率：將未注藥的空白木段，陰干，粉碎，30℃下烘箱烘干至質量不再變化，每20 g空白木屑中添加一定量的藥劑標準品，將空白木屑中藥劑添加水平調整到分別為0.05 mg·kg－1，重復3次，按上述①②③順序方法對樣品進行提取、凈化，測定添加回收率。

1.3.3枯死松樹松材線蟲陽性及含量檢測將樣地中注干后所有死亡松樹進行取樣、線蟲分離并統計松材線蟲含量，利用松材線蟲恒溫擴增核酸試紙條檢測試劑盒進行陽性檢測、結果讀判。結果描述及判定標準為：陰性：僅在質控區C出現1條紅線，表示樣品中無松材線蟲。陽性：出現2條紅線，1條檢測線，1條質控線，表示樣品中存在松材線蟲。無效：無紅色線條出現，表明核酸試紙條失效或一次性核酸檢測裝置損壞，使用原樣本重新擴增和檢測。

1.4數據統計方法

數據采用軟件SPSS 20.0進行統計分析。

2　結果與分析

2.1藥劑注干后防治效果

表1　各種藥劑防治效果Table 1　Control effect of different trunk injections in forest

林間各處理防治效果見表1。由表1可知：與不清理死樹對照區相比，各種注干藥劑施藥對松材線蟲病的防治效果顯著，均與對照組差異顯著（P＜0.05）。各注干藥劑在注干2 a后將馬尾松的死亡率控制在0.4%～4.4%，防治效果為58.49%～96.23%；6種防治藥劑中，3.0%甲維鹽注干防治劑、3.2%阿維菌素注干劑、5.0%啶蟲脒注干劑防治效果較好，1 a后其注干標準樣地松樹死亡率分別為0.4%，0.8%和0.6%，防治效果均大于82.61%，藥后2 a其防治效果均大于86.79%，與其他幾種處理有顯著性差異（P＜0.05）；1.0%阿維菌素微膠囊懸浮劑及1.0%甲維鹽注射液的防治效果大于79.25%；0.3%苦參堿疫苗注射液較差。清理死樹對照也有一定的效果，松樹死亡率分別僅為2.0%和4.0%，不清理死樹對照樣地的馬尾松死亡率最高，2 a后高達10.6%，與整片林地防治前的平均死亡率相當（約為10.0%）。

2.2松樹體內各藥劑殘留量

采用高效液相色譜測定了各藥劑的質量分數，添加回收率均在85%以上。6種藥劑有效成分在藥后3個月和1 a在樹體內均能被檢測到（表2）。其中，5.0%啶蟲脒注干劑與3.0%甲維鹽注干防治劑在藥后3個月檢測，樹體內殘留藥劑質量分數最高，分別為（5.67±1.07）和（2.65±0.35）mg·kg－1；而在藥后1 a，3%甲維鹽注干防治劑、1.0%甲維鹽注射液在樹體內殘留質量分數較高，分別為（0.95±0.11）和（0.15± 0.04）mg·kg－1，說明各藥劑能在樹體內有一定的持效期。對藥后死亡松樹進行藥劑殘留量檢測，所有藥劑均未被檢測到。

表2　各種藥劑注干后樹體內后藥劑殘留量Table 2　Residue of different trunk injections in pine tree

2.3枯死松樹松材線蟲陽性及線蟲數量檢測

采用松材線蟲恒溫擴增核酸試紙條檢測試劑盒，對樣地中注干后所有死亡松樹采用貝爾曼漏斗法進行線蟲分離，并進行線蟲陽性檢測。結果表明：所有死亡松樹內均含有松材線蟲，含線蟲數量至少為897.34條·g－1。

表3　注干后枯死松樹松材線蟲陽性及線蟲數量檢測Table 3　Positive and quantitative detection of Bursaphelenchus xylophilus in died pine tree

3　結論與討論

研究了6種藥劑注干施藥防控松材線蟲的林中效果，并初步測定了藥劑主要成分注藥3個月和1 a后在樹體內殘留動態及添加回收率。各藥劑有效成分注干后在松樹體內均能被檢測到，其中5.0%啶蟲脒注干劑與3.0%甲維鹽注干防治劑在藥后3個月檢測質量分數最高，分別為（5.67±1.07）和（2.65±0.35）mg·kg－1，均高于藥劑對松材線蟲的95%致死濃度值（LC95）0.75 mg·kg－1，而在藥后1 a，3.0%甲維鹽注干防治劑質量分數較高為（0.95±0.11）mg·kg－1，依然高于LC95（0.75 mg·L-1）［13］，注藥2 a后，盡管馬尾松的死亡率由防治1 a后的0.2%～2.4%增加至防治2 a后的0.4%～4.4%，藥劑持效期有所下降，但其防治效果還是有所提高，所有藥劑在注干2 a后防治效果在80%以上（除0.3%苦參堿疫苗注射液外），說明各藥劑能在樹體內有一定的持效期且能一定程度殺死線蟲。

藥劑在樹木體內傳導與蒸騰作用有極其密切的關系。藥劑在樹體內的長距離輸導發生在木質部（向頂性）或韌皮層（向頂性和向基性）［15］，而在散孔材和針葉樹體內的輸導則是在整個木質部邊材中進行［16］。接種試驗和組織病理學研究表明：樹脂道泌脂細胞最先受到線蟲侵襲，造成軸向和射線薄壁細胞死亡［17］。受害樹木木質部中的射線薄壁細胞的死亡可以使管胞空穴化，因而造成木質部輸水堵塞，致使藥劑在樹體內傳導緩慢甚至不能傳導［18－19］。同時，樹木的種類、樹齡及天氣條件如溫度、濕度、風速等都會影響樹木對水分及藥劑的吸收和傳導，殺蟲劑的理化性質對傳導速度和傳導量的影響更為明顯，因此，即使藥劑注干，仍可能傳導不充分或不傳導，從而導致部分樹木受松材線蟲病危害而緩慢死亡［20］。對藥后死亡松樹體內沒有檢測到藥劑殘留量，說明藥劑并未隨樹木蒸騰作用在體內傳導，沒有對松材線蟲起到預防作用。對死亡松樹中進行松材線蟲檢測均呈陽性且線蟲數量均大于897.34條·g－1也證明了殘留檢測結果。

本試驗中，砍伐松林中死樹是一種傳統的防治手段，但不能清除林中且有隱蔽性 “松材線蟲病潛在攜帶者”的松樹［2］。據FUTAI［21］報道：松樹感染松材線蟲后，受到外界環境如氣候變冷、溫度過高等影響，松材線蟲在松樹體內繁殖受到嚴重影響，進入 “潛伏期”，致使松樹不能立刻表現出癥狀或發病死亡，但這些松樹緩慢的變化，難逃松材線蟲的傳播媒介松墨天牛Monochamus alternatus的 “法眼”，依然可以傳播松材線蟲。野外觀察結果證實，在線蟲侵染的初期，進入樹木的線蟲大多分布在侵染點周圍，線蟲群體的增長則是在病樹分泌樹脂停止和出現外部癥狀后開始，樹脂道、射線和形成層內出現空洞，并緩慢延伸至皮層和木質部，引起組織的破壞，導致松樹在1～2 a內死亡［22］。實驗中清理死樹對照區2 a后，松樹死亡率還是有明顯的增加（表1），與上述研究結果相符。

注干施藥防治松材線蟲，是一種 “打點控面”的防治技術，注入樹體內的藥劑在一定程度上可以滅殺松材線蟲［6，12，23］，也可影響松墨天牛的生長發育，控制松墨天牛種群密度，抑制其傳播松材線蟲［24］。上述6種藥劑注藥2 a后的松樹死亡率較不清理死樹對照區域明顯降低。從防治后的數據得知，高濃度的甲維鹽、阿維菌素系列藥劑防效均在80%以上，對新疫點的拔除，老疫點控制均具有實際應用價值，推薦在重點防治區預防應用。

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Field efficacy of six trunk-injected pesticides on Bursaphelenchus xylophilus

LI Qiao1，ZHANG Shaoyong2，QIU Huikang2，CHEN Ming3，YE Yuzhu1，YUAN Yuan1
（1.Forest Enterprise of Jingning County，Jingning 323500，Zhejiang，China；2.Local and National Joint Engineering Laboratory of Biopesticide High-efficient Preparation Technology，Zhejiang A&F University，Lin'an 311300，Zhejiang，China；3.Forest Pest Control Quarantine Station of Jinyun County，Jinyun 321400，Zhejiang，China）

Forest efficacy of six liquid-formulated trunk-injected pesticides（avermectin，emamectin benzoate，matrine and acetamiprid）were studied using auto flow trunk injection.After 15 months residues from liquidformulated trunk-injections in pine were recovered and detected using high-performance liquid chromatography （HPLC）.Also，positive and quantitative detection of Bursaphelenchus xylophilus（BX）in dead pine trees was studied with a BX Isothermal Amplification Diagnostic Kit.Results showed that the prevention effect from the six liquid-formulated trunk injection pesticides was significant（P＜0.05）with one injection controlling pine death rate between 0.4%－4.4%for two consecutive years.Avermectin，emamectin benzoate，and aloperine with trunk-injection slowed the spread of pine wilt disease with a field efficacy above 80%.All liquid-formulated residue concentrations in the trunk xylem were reached except dead pine trees one year after injection the maximum residue concentration was found with emamectin benzoate［having at least（0.15±0.11）mg·kg－1］. Also，after injection all pine trees died due to BX nematodes with an average BX nematode content of at least 897.34 g－1in the trunk xylem.Thus，because of its favorable effect and long duration of efficacy，this liquidformulated pesticide injection could be popularized and used in practical control.［Ch，3 tab.24 ref.］

forest protection；Bursaphelenchus xylophilus；chemical control；trunk-injection agent；residue de-tection；field efficacy

S763.3

A

2095-0756（2016）04-0718-06

10.11833/j.issn.2095-0756.2016.04.023

2015-06-22；

2015-11-09

國家林業公益性行業科研專項（201204501）；浙江省景寧縣科技計劃項目（2014A05-2）

李橋，工程師，從事農林病蟲害測報、防治和害蟲生物學研究。E-mail：liqiaoxinong@126.com。通信作者：張紹勇，博士，從事生物農藥研究。E-mail：1zhangshaoyong@163.com