南瓜黃色素阻斷亞硝胺合成與抑菌活性研究

趙二勞，楊勤帥，郝麗琴，趙三虎

(忻州師范學院化學系，山西忻州 034000)

亞硝胺是當前最令人關注的一類化學致癌物，它能引起人和動物多種組織器官病變或惡性腫瘤[1,2]，嚴重影響人體健康。迄今，尚未發現人和動物能依靠自身機體功能抵抗和防御亞硝胺的致癌作用[3]。正常情況下，人們直接從食物中攝入的亞硝胺甚少，但形成亞硝胺的前體物質亞硝酸鹽卻大量存在于食物中，極易通過食物鏈進入人體。進入人體的亞硝酸鹽在胃液條件下很適宜合成亞硝胺[4,5]。因此，清除體內亞硝酸鹽以及阻斷亞硝胺在人體內的合成是防癌抗癌的有效途徑。在人們日益關注自身保健的今天，研究食物清除亞硝酸鹽以及阻斷亞硝胺合成是一項極有意義的課題。

南瓜為葫蘆科南瓜屬植物南瓜(CucurbitamoschataDuch.)的果實，其營養成分豐富、全面而獨特[6]。從南瓜中提取的南瓜黃色素作為一種天然色素，色澤自然、兼有營養或藥理作用，受到人們廣泛關注[7]。目前，有關南瓜黃色素提取、純化的研究不少[8,9]，但對南瓜黃色素營養功能的研究較少[10]，特別是關于南瓜黃色素清除亞硝酸鹽和阻斷亞硝胺合成以及抑菌活性的研究未見報道。因此，本文研究南瓜黃色素清除亞硝酸鹽和阻斷亞硝胺合成及其抑菌活性，以期為人們科學認識南瓜黃色素的營養保健功能，合理使用、深度開發利用南瓜黃色素提供依據。

1 實驗部分

1.1 儀器

723型可見分光光度計(上海光譜儀器有限公司)；KQ-400KDE型高功率數控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；WD-9403A型紫外儀(北京市六一儀器廠)；Scientz-10N型冷凍干燥機(寧波新芝生物科技有限公司)。

1.2 試劑與材料

無水乙醇、亞硝酸鈉、1-萘胺、檸檬酸、無水碳酸鈉、N-1-萘基乙二胺鹽酸鹽和磷酸氫二鈉等均為國產分析純；質量分數33%的二甲胺、2,6-二叔丁基對甲酚(BHT)為化學純；蛋白胨、牛肉膏和瓊脂粉為生物試劑。實驗用水為二去離子水。

供試菌種金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和大腸桿菌由本校生物系實驗室提供。

南瓜購于當地農貿市場，洗凈、晾干、去皮和瓤，切成5mm左右的薄片，在烘箱中烘干后，粉碎，過40目篩，制得南瓜粉，裝瓶備用。

1.3 實驗方法

1.3.1南瓜黃色素的提取參考文獻方法[11]略作改進。稱取南瓜粉50 g，以95%乙醇為提取溶劑，在料液比(g∶mL)1∶15，超聲功率280 W，溫度60 ℃的條件下，提取40 min。提取液過濾，旋轉蒸發除去溶劑后冷凍真空干燥，得南瓜黃色素，產品得率為8.09%。

1.3.2南瓜黃色素與BHT對亞硝胺合成的阻斷率采用紫外光解法[12]測定。 實驗時參照文獻方法[2]略作改進。精確吸取質量濃度為2.34 mg/mL的南瓜黃色素溶液0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0和4.5 mL，置于10支25 mL比色管中，均依次加入10 mL pH約為3.0的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖溶液，1.0 mL 1.0 mmol/L的NaNO2溶液和1.0 mL 1.0 mmol/L二甲胺溶液，去離子水定容至刻度，在水浴鍋中37 ℃恒溫反應1 h。準確吸取此含有亞硝胺的反應液1.0 mL于10 mL比色管中，加入0.5 mL的質量分數為0.5%的Na2CO3溶液，用紫外燈照射15 min，取出后加1.5 mL質量分數1%的對氨基苯磺酸溶液，1.5 mL質量分數0.1%的1-萘胺溶液，以及0.5 mL去離子水，搖勻，靜置15 min后，在波長525 nm處測其吸光度值，計算阻斷率(%)。

阻斷率(%)=[(A0-A)/A0]×100

(1)

式中：A0為未加南瓜黃色素時體系吸光度；A為加入南瓜黃色素后體系吸光度。

為了比較南瓜黃色素對亞硝胺合成的阻斷能力，以上述方法測定不同體積質量濃度為0.2 mg/mL的常用抗氧化劑BHT對亞硝胺合成的阻斷率。

1.3.3南瓜黃色素與BHT對亞硝酸鈉的清除率參考文獻方法[2,13]，采用鹽酸萘乙二胺法測定。在10支25 mL比色管中分別加入2.0 mL 5.0g/mL的NaNO2標準溶液，加入10 mL pH約為3.0的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖溶液，再分別加入0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0和4.5 mL 2.34 mg/mL的南瓜黃色素溶液，在37 ℃恒溫反應20 min，然后各加入2.0 mL質量分數為0.4%的對氨基苯磺酸，搖勻，靜置5 min，再各加入1.0 mL質量分數0.2%鹽酸萘乙二胺，用去離子水稀釋至刻度，搖勻，靜置反應15 min后，在最大吸收波長540 nm處測定吸光度，并計算南瓜黃色素對亞硝酸鈉的清除率(%)：

清除率(%)=[(A0-A)/A0]×100

(2)

式中：A0為未加南瓜黃色素時體系吸光度；A為加入南瓜黃色素后體系吸光度。

為了比較南瓜黃色素對亞硝酸鈉的清除能力，以上述方法，測定不同體積質量濃度為0.2 mg/mL的常用抗氧化劑BHT對亞硝酸鈉的清除率。

1.3.4南瓜黃色素抑菌活性參考文獻采用濾紙片法[14]測定。將牛肉膏蛋白胨培養基制成帶菌平皿，浸有南瓜黃色素溶液的直徑5 mm濾紙片分別貼于含菌平皿的外圍，浸有無菌水的濾紙片貼于中央，以做陰性對照。然后將平皿倒置于恒溫培養箱中，37 ℃培養24 h。每種濃度濾紙片做3次重復，觀察結果并用游標卡尺測量抑菌圈直徑取平均值。陰性對照組抑菌圈直徑應小于或等于5.0 mm，否則實驗無效。

1.4 數據處理

實驗均做三次重復，數據取平均值，數據分析采用Excel.2007進行。

2 結果與討論

2.1 南瓜黃色素與BHT對亞硝胺合成的阻斷率

實驗結果如圖1。由圖1可知，在模擬人體胃液條件(pH=3.0，溫度37 ℃)下，南瓜黃色素對亞硝胺合成具有一定的阻斷能力，阻斷率隨其用量的增加而增大。4.5 mL 2.34 mg/mL的南瓜黃色素溶液對亞硝胺合成阻斷率可達93.58%。但其阻斷率明顯弱于BHT，計算得南瓜黃色素、BHT對亞硝胺合成阻斷率的Ec50分別為1.14、0.09 mg/mL。

2.2 南瓜黃色素與BHT對亞硝酸鈉的清除率

由圖2可知，在模擬人體胃液條件下，南瓜黃色素與BHT對亞硝酸鈉的清除率，隨其用量的增加而增高，4.5 mL 2.34 mg/mL的南瓜黃色素溶液對亞硝酸鈉的清除率可達71.56 %。表明南瓜黃色素具有一定亞硝酸鈉清除能力。對亞硝酸鈉的清除率南瓜黃色素明顯弱于BHT，南瓜黃色素、BHT對亞硝酸鈉清除率的Ec50分別為1.47、0.13 mg/mL。

2.3 南瓜黃色素的抑菌活性

由表1可知，隨南瓜黃色素質量濃度增大抑菌圈直徑增大，表明抑菌能力與南瓜黃色素質量濃度正相關。南瓜黃色素對三種供試菌均有一定的抑制作用，對大腸桿菌的抑制作用最強，對枯草芽孢桿菌的抑制作用相對最弱。同時可以發現，供試菌中既有桿菌，又有球菌；既有革蘭氏陽性菌，又有革蘭氏陰性菌，這表明南瓜黃色素具有廣譜抑菌活性。

表1 南瓜黃色素的抑菌活性

Note:Table shows the antibacterial circle diameter(including the filter diameter),"-" antibacterial；"+" no antibacterial.

金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和大腸桿菌是食品加工和貯藏中常見的腐敗細菌，本實驗證明南瓜黃色素對它們均有一定的抑制作用，表明南瓜黃色素具有作為食品防腐劑的應用前景。有關南瓜黃色素的抑菌機制尚不很明確，一般認為可能是南瓜黃色素中一些活性物質能特異性地凝固細菌蛋白，從而改變了細菌生理功能抑制了細菌的生長；或者是南瓜黃色素與細菌生長所需的物質結合，使細菌由于缺乏生長所需的物質受到抑制而死亡[14]。具體作用機制還有待進一步深入研究。

3 結論

在模擬人體胃液條件(pH=3.0,溫度37 ℃)下，南瓜黃色素對亞硝胺合成的阻斷率和對亞硝酸鈉的清除率，隨其濃度的增加而增加，對亞硝胺合成的阻斷率最大可達93.58%，對亞硝酸鈉的清除率可達71.56 %。表明南瓜黃色素具有一定的阻斷亞硝胺合成能力和清除亞硝酸鹽能力，但其阻斷亞硝胺合成能力和清除亞硝酸鹽能力明顯弱于常用抗氧化劑BHT。同時抑菌實驗表明，南瓜黃色素對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和大腸桿菌均有一定的抑菌活性，且其對三種供試菌種抑制能力大小順序為：大腸桿菌>金黃色葡萄球菌>枯草芽孢桿菌。南瓜黃色素具有廣譜抑菌活性。

南瓜黃色素不僅是一種天然食用色素，可用于食品添加劑，本實驗還證明南瓜黃色素具有防腐作用和防癌抗癌營養保健功能，南瓜黃色素極有可能是一種防癌抗癌保健品和綠色天然防腐劑的新資源，開發前景可觀。值得進一步深入研究。