Cbl-b基因沉默對小鼠原代淋巴細胞免疫活性影響的研究

胡彬 倪娜娜 呂雅琳 陳浩 劉毅 孫建方

210042南京，中國醫學科學院 北京協和醫學院 皮膚病研究所病理科（第一作者現在武漢市第一醫院皮膚科，430022）

·論著·

Cbl-b基因沉默對小鼠原代淋巴細胞免疫活性影響的研究

胡彬 倪娜娜 呂雅琳 陳浩 劉毅 孫建方

210042南京，中國醫學科學院 北京協和醫學院 皮膚病研究所病理科（第一作者現在武漢市第一醫院皮膚科，430022）

目的 體外初步研究Cbl-b基因經特異性siRNA沉默后對小鼠淋巴細胞免疫活性的影響。方法摘取C57BL/6小鼠的脾臟，體外無菌分離小鼠脾臟淋巴細胞后進行培養。通過EntransterTM-R4000試劑將Cbl-b siRNA轉染入小鼠原代淋巴細胞以沉默細胞內Cbl-b的表達。轉染72 h后通過酶聯免疫吸附實驗（ELISA）檢測淋巴細胞培養上清中干擾素γ（INF-γ）及腫瘤壞死因子α（TNF-α）的表達量。通過與B16F10黑素瘤細胞共培養，研究Cbl-b基因沉默后的淋巴細胞對B16F10黑素瘤細胞免疫殺傷活性的影響。結果 Cbl-b siRNA成功轉染進小鼠原代淋巴細胞并能有效沉默細胞內Cbl-b的表達。與陰性對照轉染組及空白組相比，轉染Cbl-b siRNA的淋巴細胞IFN-γ、TNF-α分泌量增加（P<0.05）。共培養檢測結果顯示，Cbl-b siRNA轉染組比轉染陰性對照組能更高效地殺傷小鼠B16F10細胞。結論 Cbl-b基因沉默能夠促進小鼠淋巴細胞INF-γ、TNF-α分泌能力，并能增強淋巴細胞對B16F10黑素瘤細胞的體外免疫殺傷作用。

黑色素瘤；基因沉默；小鼠；淋巴細胞；RNA，小分子干擾；免疫活性；Cbl-b

惡性黑素瘤腫瘤微環境中存在較多導致腫瘤免疫逃逸的負性調控因素，導致免疫治療的臨床有效率仍較低。研究發現，泛素連接酶Cbl-b（casitas B cell lymphoma-b）是調節T細胞活化的關鍵因子，在維持外周T細胞免疫耐受方面具有作用。Cbl-b在T細胞的活化過程中就起到了“閘”的作用，可能是惡性黑素瘤免疫治療的理想靶位［1］。我們用Cbl-b基因特異性siRNA成功沉默小鼠原代淋巴細胞Cbl-b基因的表達，研究Cbl-b基因沉默對小鼠原代淋巴細胞增殖及免疫活性及殺傷活性的影響，為后續研究黑素瘤Cbl-b基因為靶向的免疫治療建立基礎。

材料與方法

一、材料

C57BL/6野生基因型小鼠，雌性，購自揚州大學比較醫學中心（合格證號：201512801）。淋巴細胞分離液（天津灝洋生物制品科技有限責任公司，小鼠干擾素 γ（INF-γ）、腫瘤壞死因子 α（TNF-α）ELISA試劑盒（北京達科為生物技術有限公司），培養基為含10%胎牛血清的1640（美國Gibco公司）并添加100 U/ml青霉素和100 g/L鏈霉素（上海碧云天生物技術有限公司），TrizolReagent（美國Invitrogen公司），反轉錄試劑盒（美國Fermentas公司），PCR試劑盒（日本TaKaRa公司），Cbl-b單克隆抗體（sc-8006）（美國Santa Cruz公司），PVDF膜（美國Millipore公司），CCK-8試劑盒（日本同仁化學研究所）。PCR引物由深圳華大基因科技有限公司合成，其余為國產分析純。CO2細胞培養箱（美國Thermo Scientific公司），PCR儀（美國ABI公司），凝膠成像及分析裝置、聚丙烯酰胺凝膠電泳儀、聚丙烯酰胺凝膠垂直電泳槽、微型轉膜儀（美國Bio-Rad公司），超純水儀（美國Millipore公司），電熱恒溫水槽（上海精宏實驗設備有限公司）。Cbl-b siRNA和陰性對照siRNA均由上海吉瑪制藥技術有限公司合成。

二、方法

1.細胞培養：從6周齡C57BL/6小鼠取出脾組織，D-Hanks液沖洗1次，含1%青霉素、鏈霉素的磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗1次，磨碎后過濾。將過濾得到的液體以1∶1的比例與淋巴細胞分離液混合，1 118×g離心25 min后液體分為3層，取中間云霧狀細胞層。D-Hanks液洗2遍，將細胞重懸于含1640培養基（含90%RPMI 1640培養基+10%胎牛血清+20 μg/L IL-2）中，整個過程無菌操作，于37℃、5%CO2飽和濕度培養箱中培養。B16F10黑素瘤細胞培養及共培養均用1640培養基。

2.原代淋巴細胞轉染：淋巴細胞在6孔板中培養2～3 d，至細胞融合至80%～90%時，用PBS洗滌細胞2次。用Opti-MEM培養基稀釋吹打細胞成單細胞懸液，以2×108/L密度接種24孔板，每孔500 μl，按照 EntransterTM-R4000 說明書轉染。轉染組每孔加1 μl EntransterTM-R4000和50 pmol Cbl-b siRNA，陰性對照組每孔加等量EntransterTM-R4000和陰性對照siRNA，同時把未經任何處理的細胞作為空白對照組。

3.RT-PCR和蛋白印跡法檢測轉染后Cbl-b的表達：細胞轉染48 h后，收集各組細胞總RNA及總蛋白。其中RNA經RT-PCR擴增Cbl-b基因及內參照β肌動蛋白。RT-PCR所用Cbl-b正向引物：5′-GTCGCAGGACAGACGGAATC-3′，反向引物：5′-GAGCTGATCTGATGGACCTCA-3′。β 肌動蛋白正向引物：5′-ATGACCCAAGCCGAGAAGG-3′，反向引物：5′-CGGCCAAGTCTTAGAGTTGTTG-3′。PCR 條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 40 s，63 ℃ 40 s，72 ℃ 1 min，循環28次；最后1次延伸72℃10 min。提取的各組細胞蛋白經BCA法定量后進行蛋白印跡實驗，實驗用1抗為1∶200稀釋的鼠抗Cbl-b，2抗為1∶2 000稀釋的HRP標記的羊抗鼠IgG。以β肌動蛋白為內參照，加入ECL顯色劑顯色后曝光成像。各目的基因和目的蛋白的相對表達量以其與β肌動蛋白的灰度值比值表示。

4.ELISA法檢測培養液中IFN-γ和TNF-α的分泌量：參照ELISA試劑盒說明要求，轉染48 h后，取細胞培養上清液，把標準品、稀釋液和待測樣品分別加入酶標板中，每孔0.1 ml。37℃反應120 min后，加入0.1 ml生物素抗小鼠IFN-γ、TNF-α抗體工作液，37℃反應60 min。加入親和素過氧化物酶復合物的工作液0.1 ml，37℃反應30 min。每孔依次加入TMB顯色液，37℃避光反應30 min，加入0.1 ml終止液，酶聯免疫監測儀450 nm測定吸光度（A值）。

5.CCK-8法檢測小鼠淋巴細胞對B16F10黑素瘤細胞的殺傷活性：轉染淋巴細胞24 h后，將轉染組細胞、陰性對照組細胞分別與B16F10黑素瘤細胞按效靶比為 40∶1、20∶1、10∶1接種于 96孔板，每組3個復孔，體積各為100 μl。同時每個比例組均設相同數目單純轉染淋巴細胞、陰性對照組細胞及單純腫瘤細胞作為效應細胞組和靶細胞組，每孔100 μl。培養48 h后，CCK-8試劑盒測定各組淋巴細胞對小鼠B16F10黑素瘤細胞的殺傷作用。腫瘤細胞殺傷率（%）=（單獨效應細胞的A值+單獨靶細胞的A值-效應細胞與靶細胞混合培養孔A值）/單獨靶細胞的A值×100%。

6.統計學方法：采用SPSS13.0統計軟件，所有試驗重復3次，實驗數據用±s表示。多組間比較采用方差分析，兩兩多重比較采用LSD法，小鼠淋巴細胞對B16F10黑素瘤細胞的殺傷作用比較采用兩因素方差分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、RT-PCR檢測轉染后Cbl-b基因mRNA表達水平

Cbl-b特異性siRNA轉染小鼠原代淋巴細胞48 h后，轉染組細胞內Cbl-b的相對表達水平（0.370±0.016）明顯低于陰性對照組（0.840±0.03）和空白對照組（0.850±0.015），差異有統計學意義（n=3，F=480.78，P ＜ 0.01）。見圖 1。

二、蛋白印跡法檢測轉染后Cbl-b基因蛋白表達水平

Cbl-b特異性siRNA轉染小鼠原代淋巴細胞48 h后，Cbl-b蛋白相對表達水平（0.460±0.022）明顯低于陰性對照組（0.740±0.006）和空白對照組（0.740±0.022），差異有統計學意義（n=3，F=240.57，P ＜ 0.01）。見圖 2。

三、ELISA法檢測轉染后淋巴細胞IFN-γ及TNF-α分泌改變

Cbl-b siRNA轉染淋巴細胞48 h后，培養液中IFN-γ及TNF-α濃度在轉染組、陰性對照組和空白對照組間差異均有統計學意義，且轉染組IFN-γ及TNF-α濃度均顯著高于陰性對照組和空白對照組，差異均有統計學意義（P＜0.01），但陰性對照組與空白對照組間差異均無統計學意義（P＞0.05）。見表1。

四、小鼠淋巴細胞與B16F10黑素瘤細胞共培養

C57BL/6小鼠淋巴細胞與B16F10黑素瘤細胞混合培養。腫瘤細胞未貼壁時呈圓形，有核；約2～3h后開始貼壁生長，呈長梭形，核仁明顯；約12 h完全貼壁。淋巴細胞呈圓形，懸浮生長，有集群生長能力，能形成肉眼可見幾十到幾百個細胞成簇生長，淋巴細胞與腫瘤細胞之間有廣泛的緊密膜接觸。

圖1 實時PCR檢測Cbl-b siRNA轉染淋巴細胞后Cbl-b mRNA的表達水平

圖2 蛋白印跡實驗檢測轉染后淋巴細胞內Cbl-b蛋白表達水平

五、CCK8法檢測小鼠淋巴細胞對B16F10黑素瘤細胞的殺傷作用

實驗結果顯示，淋巴細胞與腫瘤細胞的不同效靶比對淋巴細胞的殺傷活性有顯著影響（F=82.36，P＜0.01），效靶比為40∶1時，淋巴細胞的殺傷最強，顯著高于20∶1和 10∶1組（n=3，均P＜0.01）。轉染組淋巴細胞的殺傷活性顯著高于陰性對照組（F=31.54，P＜0.01）。見表 2。

討 論

惡性黑素瘤是惡性程度最高的皮膚腫瘤，其對放療和化療均不敏感，且術后復發率高，臨床上迫切需要新的治療策略［2］。近年來研究發現，泛素連接酶Cbl-b是調節T細胞活化的關鍵分子，在避免免疫無能、維持外周T細胞耐受力方面具有作用［3］。研究表明，Cbl-b在調節T細胞轉化生長因子β（TGF-β）信號轉導通路中起著重要作用，可抑制TGF-β誘導的Foxp3+功能性Treg細胞的生成［4］，還可控制T細胞活化的預支，其缺失能使T細胞對低親和力配體產生反應，這在以分化抗原為靶點的腫瘤免疫治療中相當重要，對抗腫瘤的負性調控有重要的意義。本實驗旨在研究小鼠原代淋巴細胞經過Cbl-b基因特異性siRNA轉染后，淋巴細胞抗腫瘤的細胞因子分泌情況，以及淋巴細胞與小鼠B16F10黑素瘤細胞混合培養后，對腫瘤細胞的殺傷活性的變化情況。

表1 ELISA法檢測Cbl-b siRNA轉染淋巴細胞48 h后干擾素γ及腫瘤壞死因子α分泌水平比較（±s，ng/L）

表1 ELISA法檢測Cbl-b siRNA轉染淋巴細胞48 h后干擾素γ及腫瘤壞死因子α分泌水平比較（±s，ng/L）

注：n=3

組別 干擾素γ 腫瘤壞死因子α轉染組 95.80±17.85 62.23±4.41陰性對照組 49.92±9.89 32.29±2.10空白對照組 51.40±10.89 27.14±5.89 F值 11.43 65.70 P值 ＜0.01 ＜0.01

表2 淋巴細胞對B16F10黑素瘤細胞的殺傷率（%，±s）

表2 淋巴細胞對B16F10黑素瘤細胞的殺傷率（%，±s）

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本研究利用合成并篩選出沉默效率最高的Cbl-b 基因特異性 siRNA［5］，體外轉染 Cbl-b siRNA至小鼠原代淋巴細胞，并觀察其Cbl-b基因沉默后的效應。為了確保成功轉染Cbl-b基因特異性siRNA，通過RT-PCR在基因水平檢測基因的沉默情況，蛋白印跡實驗在蛋白水平檢測Cbl-b蛋白的表達下降情況，證實Cbl-b siRNA成功轉入小鼠原代淋巴細胞并有效沉默Cbl-b的表達。

抗腫瘤免疫主要是以T細胞介導的細胞免疫為主，T細胞分為CD8+細胞毒性T細胞（CTL）和CD4+T輔助T細胞。CD4+T輔助細胞在接受抗原提呈細胞（APC）上的MHC-抗原復合物和共刺激分子雙信號刺激后，發生活化及克隆性增殖，釋放出多種細胞因子，其中以白細胞介素2（IL-2）、INF-γ、TNF-α等為主。這些細胞因子在活化、調節巨噬細胞、CD8+細胞毒性T細胞及B細胞的抗腫瘤效應中起重要作用。本試驗通過ELISA法檢測轉染后淋巴細胞分泌抗腫瘤性細胞因子INF-γ、TNF-α的分泌情況，結果顯示，轉染組淋巴細胞相對于陰性對照組和空白對照組INF-γ、TNF-α分泌量明顯增多，表明小鼠原代淋巴細胞經過Cbl-b基因特異性siRNA沉默后更易活化，能產生更多抗腫瘤細胞因子，因而對腫瘤細胞可能有更強的殺傷作用。另外，在淋巴細胞對B16F10黑素瘤細胞的殺傷實驗中，我們將轉染過Cbl-b基因特異性siRNA的淋巴細胞與小鼠B16F10黑素瘤細胞共培養，觀察其對B16F10黑素瘤細胞的殺傷活性，結果顯示，轉染組腫瘤細胞殺傷率明顯高于陰性對照組，表明Cbl-b基因沉默在體外可以增強淋巴細胞對于黑素瘤細胞的殺傷作用，當然，這種腫瘤抑制作用還需更為精確的方法，如3H-TdR摻入法等進一步驗證。

［1］Wallner S,Gruber T,Baier G,et al.Releasing the brake:targeting Cbl-b to enhance lymphocyte effector functions［J］.Clin Dev Immunol,2012,2012:692639.DOI:10.1155/2012/692639.

［2］Gray-Schopfer V,Wellbrock C,Marais R.Melanoma biology and new targeted therapy［J］.Nature,2007,445（7130）:851-857.DOI:10.1038/nature05661.

［3］Paolino M,Thien CB,Gruber T,et al.Essential role of E3 ubiquitin ligase activity in Cbl-b-regulated T cell functions［J］.J Immunol,2011,186（4）:2138-2147.DOI:10.4049/jimmunol.1003390.

［4］Venuprasad K.Cbl-b and itch:key regulators of peripheral T-cell tolerance［J］.Cancer Res,2010,70（8）:3009-3012.DOI:10.1158/0008-5472.CAN-09-4076.

［5］胡彬,倪娜娜,呂雅琳,等.Cbl-b基因shRNA干擾載體的構建及鑒定［J］.中華皮膚科雜志,2015,48（3）:204-207.DOI:10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2015.03.018.Hu B,Ni NN,Lv YL,et al.Construction and identification of a short hairpin RNA expression vector targeting the Cbl-b gene［J］.Chin J Dermatol,2015,48（3）:204-207.DOI:10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2015.03.018.

In vitroeffects of Cbl-b gene silencing on immunocompetence of primary murine lymphocytes

Hu Bin,Ni Nana,Lyu Yalin,Chen Hao,Liu Yi,Sun Jianfang

Department of Pathology,Institute of Dermatology,Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College,Nanjing 210042,China（the current affiliation of the first author was Department of Dermatology,Wuhan No.1 Hospital,Wuhan 430222,China）

Objective To evaluatein vitroeffects of specific small interfering RNA （siRNA）-silencing of the casitas B-lineage lymphoma b （Cbl-b）gene on immunocompetence of primary murine lymphocytes.Methods Spleens were resected from C57BL/6 mice,and splenic lymphocytes were sterily isolated and culturedin vitro.These lymphocytes were divided into 3 groups:silence group transfected with a Cbl-b-specific siRNA using the EntransterTM-R 4000 reagent,negative control group transfected with a negative control siRNA using the EntransterTM-R4000 reagent,blank control group receiving no treatment.After additional culture for 72 hours,ELISA was performed to measure levels of interferon γ（IFN-γ） and tumor necrosis factor α （TNF-α） in culture supernatants of lymphocytes.In addition,the Cbl-b genesilenced lymphocytes were co-cultured with B16F10 melanoma cells to evaluate their immunocytotoxic effects on melanoma cells.ResultsSplenic lymphocytes were successfully isolated from C57BL/6 mice and culturedin vitro,and the Cbl-b-specific siRNA was also successfully transfected into the primary murine lymphocytes and effectively downregulated the expression of Cbl-b gene in them.Compared with the negative control group and blank control group,the silence group showed significantly increased supernatant levels of IFN-γ and TNF-α（allP<0.05）.The immunocytotoxic effect of lymphocytes on melanoma cells was significantly stronger in the silence group than in the negative control group.Conclusion Cbl-b gene silencing can promote secretion of IFN-γ and TNF-α by murine lymphocytes,and enhance their immunocytotoxic effects on B16F10 melanoma cellsin vitro.

Melanoma;Gene silencing;Mice;Lymphocytes;RNA,small interfering;Immunocompetence;Cbl-b

s:Sun Jianfang,Email:Sunjf57@163.com;Liu Yi,Email:dr.liuyi@gmail.com

孫建方，Email：Sunjf57@163.com；劉毅，Email：dr.liuyi@gmail.com

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2016.03.004

國家自然科學基金（81171513）；江蘇省自然科學基金（BK2012506）

Fund programs:National Natural Science Foundation of China（81171513）;Natural Science Foundation of Jiangsu Province of China（BK2012506）

2015-06-08）

（本文編輯：吳曉初）