野黃芩苷對人舌鱗癌Tca8113細胞Fas和FasL表達的影響

李　戈，李俊玫，葛志華，楊　寧， 楊佳寧

（承德醫學院附屬醫院，河北承德 067000）

野黃芩苷對人舌鱗癌Tca8113細胞Fas和FasL表達的影響

李戈，李俊玫△，葛志華，楊寧， 楊佳寧

（承德醫學院附屬醫院，河北承德 067000）

目的：觀察野黃芩苷對人舌鱗癌Tca8113細胞Fas和FasL表達的影響。方法：體外培養人舌鱗癌Tca8113細胞分為對照組、不同濃度野黃芩苷藥物組，野黃芩苷組分別用80μg/ml、120μg/ml、160μg/ml的野黃芩苷作用人舌鱗癌Tca8113細胞48h。采用免疫細胞化學法觀察野黃芩苷對人舌鱗癌Tca8113細胞Fas和FasL表達的影響。結果：用藥組Tca8113細胞Fas和FasL的表達水平明顯高于對照組（P＜0.05）；并且隨著野黃芩苷藥物濃度的增加，Fas和FasL的表達水平逐漸升高（P＜0.05）。結論：野黃芩苷可能通過促進人舌鱗癌Tca8113細胞Fas蛋白和FasL蛋白的表達促進腫瘤細胞凋亡。

野黃芩苷；人舌鱗癌Tca8113細胞；Fas；FasL

舌鱗狀細胞癌（tongue squamous cell carcinoma，TSCC）是口腔癌中最常見的惡性腫瘤，惡性程度較高、生長快、浸潤性較強，易發生早期淋巴結轉移，且轉移率較高。由于其位置的特殊性，以及放療、化療副作用較大，術后復發率及轉移率均較高，5年存活率在50%-60%左右［1-2］。目前，TSCC的臨床治療主要采用手術為主、放化療為輔的綜合治療方法。中藥野黃芩苷又名燈盞花乙素，是從黃芩莖葉及燈盞細辛等藥物中分離得到的黃酮類化合物，在抗炎、抗微生物、抗變態反應、抗腫瘤等多方面都有一定的藥理作用［3］。楊鶴松［4］的研究顯示，野黃芩苷在一定濃度下對LA795瘤株的體內增殖具有明顯的抑制作用；另有學者研究發現［5］，野黃芩苷可通過激活caspase-6、致敏5-氟尿嘧啶等藥物誘導結腸癌細胞凋亡。本研究通過觀察野黃芩苷對人舌鱗癌Tca8113細胞Fas、FasL蛋白表達的影響，探討野黃芩苷對人舌鱗癌細胞是否具有凋亡誘導作用，以期為野黃芩苷應用于臨床治療舌癌提供理論和實驗依據。

1　材料與方法

1.1試劑和儀器 人舌鱗癌Tca8113細胞株（南京凱基生物科技有限公司），野黃芩苷（中國藥品生物制品檢定所），胎牛血清（FBS，中美合資蘭州民海生物工程有限公司），DAB顯色試劑盒（北京中杉金橋生物技術公司），CO2培養箱（SANYO，日本），倒置相差顯微鏡及照相系統（Olympus，日本）。

1.2實驗分組 細胞分為對照組、不同濃度野黃芩苷藥物組。對照組Tca8113細胞用含10% FBS的RPMI 1640培養液培養；不同濃度野黃芩苷藥物組細胞分別用含野黃芩苷終濃度為80μg/ml、120μg/ml、160μg/ml的RPMI 1640培養液處理細胞。

1.3人舌鱗癌Tca8113細胞的培養 將人舌鱗癌Tca8113細胞株用含100U/ml青霉素，100μg/ml鏈霉素、10% FBS的RPMI 1640培養液在37℃、5% CO2培養箱內進行培養，倒置顯微鏡觀察細胞生長情況，隔2-3天傳代一次，取對數生長期的細胞用于實驗，細胞消化液為0.25%的胰蛋白酶。

1.4免疫細胞化學法檢測Fas、FasL的表達 三個野黃芩苷藥物組在野黃芩苷處理細胞48h后甲醇固定細胞爬片，小牛血清封閉，一抗（1：50）4℃孵育過夜，DAB顯色，光鏡下觀察Fas、FasL的表達情況。

1.5結果判定 以細胞漿和（或）胞膜出現棕黃色顆粒，強度大于背景非特異性染色判定為陽性產物。每個標本選擇5個具有代表性的視野（×200倍），計數陽性細胞百分率：-，陽性細胞＜25%；+，陽性細胞25%-50%；++，陽性細胞51%-75%；+++，陽性細胞76%-100%。

1.6統計分析 數據采用SPSS 15.0統計學軟件進行處理，組間比較采用秩和檢驗，兩兩比較采用Tukey檢驗，P＜0.05為差異具有統計學意義。

2　結果

免疫細胞化學染色結果顯示：Fas和FasL陽性細胞的胞漿和胞膜呈棕黃色，對照組細胞胞漿著色很淺，野黃芩苷藥物組細胞隨藥物濃度的增加胞漿棕黃色逐漸增強。各組細胞Fas和FasL的表達水平比較，差異具有統計學意義（P＜0.05）；隨著野黃芩苷藥物濃度的增加，Fas和FasL的表達水平逐漸升高（P＜0.05）。見附表：

附表 人舌鱗癌Tca8113細胞Fas、FasL蛋白的表達情況

3　討論

腫瘤的發生與細胞凋亡過程被抑制、細胞增殖與凋亡間的平衡被破壞有關。Fas/FasL是介導細胞凋亡信號轉導途徑最主要的系統［6］。Fas是一種分子量為45kDa的膜蛋白，屬Ⅰ型跨膜糖蛋白，是腫瘤壞死因子（TNF）超家族成員，分子結構包括3個部分：膜外的N末端區、跨膜區和胞漿的C末端區。其N端有3個富含半胱氨酸、長度約40個氨基酸的死亡結構域（DD），是介導細胞凋亡的功能區。正常生理情況下，Fas在很多細胞中均有表達。FasL是一種分子量約為40kDa的Ⅱ型跨膜糖蛋白，為Fas的天然配體，僅有活化的T淋巴細胞、自然殺傷細胞、腫瘤細胞和免疫赦免區域內的體細胞等特定的細胞表達FasL。Fas與配體結合后發生三聚化，DD區與接頭蛋白FADD（Fas相關死亡結構域蛋白）的DD區結合，FADD的N端通過死亡效應結構域（DED）與caspase-8前體蛋白和CAP3結合，激活caspase-8，啟動caspase級聯反應，導致細胞凋亡［7］。

研究發現，腫瘤細胞普遍存在低表達或不表達Fas的現象，癌細胞Fas表達下調以抵抗FasL表達導致的TIL（腫瘤浸潤淋巴細胞）、CTL（細胞毒性T淋巴細胞）的免疫攻擊，因此有利于癌細胞生長。王建廣等［8］探討Fas基因與人口腔鱗癌細胞凋亡的關系，結果顯示口腔鱗癌組織Fas蛋白的陽性表達率有不同程度的下降。Muraki［9］等研究發現，口腔鱗狀上皮癌Fas的表達與化療反應、生存時間、腫瘤復發有關，Fas表達陰性組對化療反應弱，后果不佳；而Fas陽性組對化療反應良好，后果佳。

本研究分別用濃度為80μg/ml、120μg/ml、160μg/ml的野黃芩苷作用人舌鱗癌Tca8113細胞48h后，采用免疫細胞化學法染色檢測Fas、FasL蛋白表達的情況，結果顯示，用藥組Tca8113細胞Fas和FasL的表達水平明顯高于對照組，并且隨著野黃芩苷藥物濃度的增加，Fas和FasL的表達水平逐漸升高。因此提示，野黃芩苷可能通過增加Fas和FasL的表達水平，促進腫瘤細胞凋亡。但要將野黃芩苷應用于臨床抗腫瘤治療，還需進一步深入探討其促腫瘤細胞凋亡的機制。

[1]Parkin DM,Bray F,Ferlay J,et al.Global cancer statistics,2002[J]. CA Cancer J Clin,2005, 55(2):74-108.

[2]Sano D,Myers JN.Metastasis of squamous cell carcinoma of oral tongue[J].Cancer Metastasis Rev,2007,26(3-4):645-662.

[3]Chung CP,Park JB,Bae KH.Pharmacological effects of methanolic extract from the root of scutellaria baicalensis and its fl avonoids on human gingival f ibroblast[J]. Planta Med,1995, 61(2):150-153.

[4]楊鶴松.黃芩莖葉總黃酮對LA795小鼠肺腺癌的抑制作用［J］.承德醫學院學報，2008，25（4）：439.

[5]Chan JY,Tan BK,Lee SC.Scutellarin sensitizes drug-evoked colon cancer cell apoptosis through enhanced caspase-6 activation[J]. Anticancer Res,2009,29(8):3043-3047.

[6]Nagata S,Golstein P.The Fas death factor[J].Science,1995,267 (5203):1449-1456.

[7]Wajant H.The Fas signaling pathway: more than a paradigm[J]. Science,2002,296(5573):1635- 1636.

[8]王建廣，黃洪章，潘朝斌，等.口腔鱗狀細胞癌Fas基因表達與細胞凋亡關系的研究［J］.華西口腔醫學雜志，2004，22（4）：334-336.

[9]Muraki Y,Tateishi A,Seta C,et al.Fas antigen expression and outcome of oral squamous cell carcinoma[J].Int J Oral Maxillofac Surg,2000,29(5):360-365.

EFFECTS OF SCUTELLARIN ON EXPRESSION OF FAS AND FASL IN HUMAN TONGUE SQUAMOUS CARCINOMA TCA 8113 CELLS

LI Ge， LI Jun-mei， GE Zhi-hua， et al
(The Affiliated Hospital of Chengde Medical College, Hebei Chengde 067000, China)

Objective: To observe the effects of scutellarin on expression of Fas and FasL in human tongue squamous carcinoma Tca8113 cells. Methods: Human tongue squamous carcinoma Tca8113 cells were cultured in vitro and divided into control group and 3 scutellarin groups with different concentrations （80μg/ml，120μg/ml， 160μg/ml）. Immunocytochemical stain was used to detect the expression of Fas and FasL in human tongue squamous carcinoma Tca8113 cells. Results: The Fas and FasL expression level in Tca8113 cells of scutellarin groups was obviously higher than that of control group （P＜0.05）； Moreover， with increasing of scutellarin concentrations， the Fas and FasL expression increased gradually （P＜0.05）. Conclusions: Scutellarin may promote tumour cells apoptosis by upregulating the expression of Fas and FasL in human tongue squamous carcinoma Tca8113 cells.

Scutellarin； Human tongue squamous carcinoma Tca8113 cells； Fas； FasL

R739.86

【文章編號】1004-6879（2016）01-007-03

2015-05-26）