一測多評法與外標法測定膽黃連中生物堿類成分含量比較

王靜 陳悅 袁子民

摘要：目的 建立一測多評法（QAMS）測定膽黃連中3種生物堿成分含量，并與外標法測定結果進行比較，探討QAMS的可行性。方法 采用高效液相色譜法，以鹽酸小檗堿為內參物，建立鹽酸小檗堿與鹽酸巴馬汀、鹽酸藥根堿間的相對校正因子，用所得相對校正因子進行含量計算（計算值），實現一測多評。同時采用外標法測定3個成分的含量（實測值），比較計算值與實測值的差異。結果 10批膽黃連中3種生物堿成分含量的計算值與實測值無顯著差異。結論 QAMS可用于膽黃連中生物堿類成分的含量測定。

關鍵詞：一測多評法；外標法；膽黃連；生物堿；相對校正因子

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.11.019

中圖分類號：R284.1 文獻標識碼：A 文章編號：1005-5304（2016）11-0078-03

Abstract： Objective To establish QAMS method to determine the contents of three alkaloids in bile processed Coptidis Rhizoma； To compare the results of QAMS with those from external standard method； To prove the feasibility of QAMS. Methods An HPLC method was developed. Berberine hydrochloride was selected as the internal reference substance. 2 relative correction factors （RCF） of berberine hydrochloride to palmatine hydrochloride and to jatrorrhizine hydrochloride were established. Obtained RCFs were used to conduct content calculation （calculated value） to complete QAMS method. At the same time， the contents （measured value） of the three components were also determined by external standard method. Calculated value and measured value were compared. Results The analysis results showed that there was no significant difference between the calculated values and the measured values of the three alkaloids in 10 batches of bile processed Coptidis Rhizoma. Conclusion The QAMS method can be applied in the determination of alkaloids in bile processed Coptidis Rhizoma.

Key words： QAMS； external standard method； bile processed Coptidis Rhizoma； alkaloids； relative correction factors

膽黃連是黃連的炮制品之一，以豬膽汁炮制后，黃連的寒性增強，是“寒者益寒”“從制”的經典實例[1]。本試驗在前期確定膽黃連炮制工藝、藥效作用的基礎上，采用一測多評法（QAMS）對膽黃連中鹽酸藥根堿、鹽酸巴馬汀與鹽酸小檗堿含量進行研究，并將外標法和QAMS測定結果進行比較，建立膽黃連中3種生物堿類成分QAMS的含量測定方法，為膽黃連的質量評價和炮制機理研究提供依據。

1 儀器與試藥

Agilent1100高效液相色譜儀（chemistation system工作站），SG3300型超聲波清洗器（上海冠特超聲儀器有限公司），賽多利斯BT25S分析天平。

黃連購自大連權健中藥飲片有限公司（批號20130612，產地四川），經遼寧中醫藥大學鑒定教研室李峰教授鑒定為毛茛科植物黃連Coptis chinensis Franch.的干燥根莖；豬膽汁購于大連豬肉市場；膽黃連飲片自制10批（黃連飲片，加6%豬膽汁水溶液拌勻，悶潤1 h，94 ℃翻炒19 min制得[2]）；鹽酸小檗堿對照品（批號110713-201212）、鹽酸藥根堿對照品（批號110733-201108）、鹽酸巴馬汀對照品（批號110732-201108），中國食品藥品檢定研究院；乙腈為色譜純，其他試驗均為分析純，水為娃哈哈純凈水。

2 方法與結果

2.1 對照品溶液的制備

分別取鹽酸藥根堿、鹽酸巴馬汀和鹽酸小檗堿對照品適量，精密稱定，加甲醇-鹽酸（100∶1）溶液，配制成濃度為0.042、0.046、0.131 mg/mL的混合對照品溶液。

2.2 供試品溶液的制備

取膽黃連粉末（過二號篩）約0.2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇-鹽酸（100∶1）溶液50 mL，密塞，稱定質量，超聲處理（功率250 W，頻率40 kHz）20 min，放冷，再稱定質量，用甲醇-鹽酸（100∶1）溶液補足減失的質量，搖勻，過濾。精密量取續濾液2 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，過0.45 ?m濾膜，取續濾液，即得[3]。

2.3 色譜條件

色譜柱：Diamonsil C18（250 mm×4.6 mm，5 ?m）；流動相A為乙腈，B為磷酸三乙胺水溶液（精密量取磷酸3 mL，三乙胺2 mL，置1000 mL量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，即得），梯度洗脫（0～15 min，25%～30%A；15～20 min，30%～55%A）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：345 nm；柱溫為室溫；進樣量：10 ?L[4]。理論塔板數按鹽酸小檗堿計算應不低于3000。色譜圖見圖1。

2.4 線性關系考察

精密吸取“2.1”項下混合對照品溶液2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0 ?L，依次注入液相色譜儀，記錄各色譜峰，以進樣量對峰面積進行線性回歸，結果表明，各成分在相應的范圍內與峰面積呈良好的線性關系，見表1。

2.5 精密度試驗

取同一膽黃連飲片供試品（批號20140301）溶液，在上述色譜條件下，連續進樣6次，每次10 ?L，記錄峰面積，結果鹽酸藥根堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿峰面積的RSD分別為1.85 %、1.65 %、1.18 %，表明儀器精密度良好。

2.6 重復性試驗

取同一膽黃連飲片（批號20140301），按“2.2”項下方法分別制備6份供試品溶液，在上述色譜條件下進樣，測定含量，結果鹽酸藥根堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿平均含量分別為15.31、16.76、56.44 mg/g，RSD分別為1.25%、1.02%，0.55%，表明本法重復性良好。

2.7 穩定性試驗

取同一份膽黃連供試品溶液，分別于0、2、4、6、8 h，精密吸取10 ?L，在上述色譜條件下測定峰面積，計算RSD，結果鹽酸藥根堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿峰面積的RSD分別為1.71%、1.25%、1.13%，表明8 h內供試品溶液穩定性良好。

2.8 加樣回收率試驗

精密稱取已知含量的膽黃連（批號20140301，鹽酸藥根堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿含量分別為15.19、16.79、56.37 mg/g）約0.1 g，平行6份，分別按樣品含量加入鹽酸藥根堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿對照品溶液適量，按“2.2”項下方法制備供試品溶液，測定含量，結果鹽酸藥根堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿的平均回收率分別為100.1%、100.1%、99.9%，RSD分別為1.60%、1.34%、1.33%。

2.9 一測多評法的建立

2.9.1 校正因子的計算 以鹽酸小檗堿為內參物，按公式fk/m=fk/fm=Wk/Wm×（Am/Ak）計算鹽酸藥根堿、鹽酸巴馬汀的校正因子，式中Ak和Wk分別為內參物的峰面積和濃度，Am和Wm分別為其他組分m的峰面積和濃度[5-7]。鹽酸藥根堿、鹽酸巴馬汀和內參物鹽酸小檗堿間的校正因子分別為0.083 3、0.399 5。

2.9.2 一測多評法與外標法測定結果的比較 取10批膽黃連，按“2.2”項下方法制備膽黃連供試品溶液，分別精密吸取供試品溶液10 ?L，注入高效液相色譜儀，記錄峰面積。分別采用外標法和QAMS計算膽黃連中鹽酸藥根堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿的含量，結果見表2。測定結果表明，2種方法測得的各成分含量間無顯著差異，說明采用QAMS測定結果準確可靠。

3 討論

本研究對不同條件下（色譜儀、色譜柱、流速、柱溫）測定的相對校正因子的重復性進行了考察，結果表明相對校正因子均無明顯變化。另外，采用相對保留值法和保留時間差法對待測組分的色譜峰進行了定位，結果表明，2種方法均能準確定位色譜峰，但相對保留值法應用更為廣泛，且RSD更小，因此采用相對保留值法定位色譜峰。

本研究采用外標法和QAMS測定了10批自制膽黃連飲片的3種生物堿含量，結果表明2種方法測得的含量無明顯差異，說明該QAMS準確可靠，可以同時測定膽黃連中鹽酸小檗堿、鹽酸藥根堿、鹽酸巴馬汀的含量。

參考文獻：

[1] 龔千鋒.中藥炮制學[M].北京：中國中醫藥出版社，2007：160.

[2] 王靜，陳悅，袁子民，等.響應面法優化膽黃連的炮制工藝[J].中華中醫藥學刊，2015，33（6）：1298-1230.

[3] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：一部[M].北京：中國醫藥科技出版社，2015：303-304.

[4] 王靜，張朔，楊艷云，等.高效液相色譜法同時測定左金丸提取物中五種成分的含量[J].遼寧中醫雜志，2009，36（5）：804-805.

[5] 趙君穎，汪坤，張振凌.一測多評法比較不同黃連炮制品中4種生物堿的含量[J].中國實驗方劑學雜志，2012，18（18）：11-13.

[6] 劉暉暉，張輝，莫結麗，等.一測多評法測定黃連配方顆粒中4個成分的含量[J].中國藥業，2012，21（10）：39-40.

[7] 匡艷輝，朱晶晶，王智民，等.一測多評法測定黃連中小檗堿、巴馬汀、黃連堿、表鹽酸小檗堿、藥根堿含量[J].中國藥學雜志，2009，44（5）：390-394.