基于高通量測序技術分析北京清香型大曲微生物多樣性

張雙燕，廖永紅，紀南，周曉宏*

（1.北京理工大學生命學院，北京100081；2.北京工商大學食品學院，北京100048）

基于高通量測序技術分析北京清香型大曲微生物多樣性

張雙燕1，廖永紅2，紀南2，周曉宏1*

（1.北京理工大學生命學院，北京100081；2.北京工商大學食品學院，北京100048）

利用高通量測序方法對北京某清香型酒廠大曲細菌16S rDNA V4區和真菌ITS1區進行測序分析其微生物多樣性，并對大曲微生物在不同分類水平相對豐度進行統計。結果表明：大曲中在細菌操作分類單元(OTU)為47、真菌OTU為11，細菌種類較真菌種類豐富；細菌中優勢菌是乳酸菌，包括乳桿菌屬、片球菌屬、乳球菌屬、明串珠菌屬四個屬。同時也檢測到醋桿菌屬、芽孢桿菌屬等；真菌中優勢菌是假絲酵母屬，此外還有曲霉屬、毛霉屬、威克漢姆酵母屬等；對大曲物種Alpha多樣性分析表明測序深度基本覆蓋該酒曲中微生物種類；最后分析討論了大曲優勢微生物在白酒釀造中的功能。該研究對于指導白酒生產具有重要意義。

清香型大曲；高通量測序；微生物；16S rDNA V4；內轉錄間隔區

我國白酒歷史悠久，是世界七大蒸餾酒之一。中國白酒傳統生產方式是固態發酵，用曲釀酒是我國白酒生產的特色，在世界釀酒史上獨樹一幟。日本學者板口謹一郎先生認為，中國創造酒曲釀酒，是我國勞動人民智慧的結晶，其重要性可與中國四大發明媲美[1-2]。酒曲是以糧食為原料制成的物系、酶系、菌系共存的糖化發酵劑。白酒生產實質上是多種微生物共同作用的結果，酒曲作為白酒生產中微生物的主要來源，其中的微生物按照功能可分為糖化微生物、釀酒微生物和產香微生物三大類[3]。

最初研究白酒微生物的方法多為傳統微生物分離培養法。利用傳統方法分離到的微生物在種類和數量上是有限的，相比之下，分子生物技術則成為微生物研究強有力的工具。近年來，聚合酶鏈式反應和變性梯度凝膠電泳結合（polymerase chain reaction-denatured gradient gel electrophoresi，PCR-DGGE）技術、DNA克隆文庫、高通量測序等方法逐漸被應用于白酒微生物研究。WANG H Y等[4]利用PCR-DGGE方法分析了10種酒曲的微生物類群，并對其進行比較，證明大曲微生物群落組成具有地區差異性。陳玲等[5]運用16S rDNA克隆文庫法與高通量測序法對比分析了濃香型大曲微生物群落結構，兩種方法各具優勢，在分析優勢菌群上結果基本相同，但高通量測序法分析到的微生物類群更多。

高通量測序技術[6-7]作為新一代測序方法，在微生態領域有廣泛的應用前景，該技術具有通量高、成本低、準確率高、可進行雙向測序等優點，可以方便快捷地分析樣品中復雜的微生物菌群結構，是分析復雜多樣微生物樣品的首選。酒曲微生物非常復雜、種類繁多，更需要從微生態角度探究微生物的多樣性。2015年，喬曉梅[8]利用高通量測序技術分析了清香大曲中真菌群落結構，但只在種水平上分析了真菌組成，并沒有在其他分類水平上分析真菌；雷振河[9]基于高通量測序技術分析了山西某酒廠大曲和酒醅中微生物群落結構，對于大曲，只有細菌門分類水平和真菌屬分類水平的分析；兩者對大曲微生物的分析都只局限于某一個分類水平，而沒有全面地從門、綱、目、科、屬、種等各個分類水平上分析微生物多樣性。本研究以北京某酒廠大曲微生物為研究對象，對其進行16S rDNA和內轉錄間隔區（internal transcribed spacer，ITS）可變區域高通量測序，同時分析酒曲細菌和真菌的多樣性，并全面系統地統計分析酒曲微生物在門、綱、目、科、屬、種不同分類水平上的相對豐度。酒曲微生物多樣性分析對于指導篩選白酒釀造過程中功能微生物有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

大曲樣品：取自北京某清香型白酒酒廠。

1.1.2 主要試劑

氯仿、異戊醇、無水乙醇、異丙醇（分析純）：北京化工廠；Tris-酚：美國Sigma公司；蛋白酶K：德國Merck公司；RNA酶：日本TaKaRa Biotechnology公司。

1.2 儀器與設備

ProS聚合酶鏈式反應（polymerasechainreaction，PCR）儀：德國Eppendorf公司；PowerPac3000電泳儀：美國Bio-Rad公司；Miseq高通量測序平臺：美國Illumina公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 酒曲樣品準備

自酒廠曲房內大曲的表層、中間、底部分別取樣約10 g并粉碎至合適大小后混勻放于無菌袋中，于-20℃保存備用。

1.3.2 基因組DNA的提取

采用鹽析改進法[10]提取大曲中微生物基因組DNA，具體可分為大曲預處理、核裂解液和蛋白酶K裂解、酚/氯仿/異戊醇的抽提、異丙醇的沉淀、體積分數70%乙醇的洗滌、DNA的溶解及RNA酶酶解等步驟。然后用1%瓊脂糖凝膠電泳對提取的基因組進行檢測，置于-20℃備用。

1.3.3 PCR擴增及高通量測序

利用引物515F和806R對細菌16SrDNAV4區進行PCR擴增，同時利用引物ITS1F和ITS2對真菌ITS1區進行PCR擴增；最后通過Illumina Miseq測序平臺對擴增子片段進行高通量測序。

1.3.4 序列數據處理與分析

得到的高通量測序數據通過去除接頭污染、低質量、低復雜度和含N堿基reads獲得Clean Data；使用Flash軟件利用重疊關系將雙末端測序得到的成對reads組成一條序列得到可變區Tags，最后利用UCHIME軟件通過與嵌合體數據庫比對去除嵌合體得到CleanTags；利用軟件USEARCH將Clean Tags進行分類操作單元（operational taxonomic units，OTU）聚類，通過RDP classifer（v2.2）軟件將OTU代表序列與數據庫比對進行物種注釋；最后通過mothur（v1.31.2）軟件計算Alpha多樣性值并用R（v3.1.1）軟件做出相應的稀釋曲線圖。

2 結果與分析

2.1 酒曲OTU統計

利用軟件USEARCH在97%相似度下將Clean Tags聚類為用于物種分類的OTU。OTU可初步說明樣品物種豐富程度。經分析，酒曲中的細菌OTU數為47，真菌OTU數為11，說明酒曲微生物組成中細菌種類更為豐富。

根據每個OTU在酒曲樣品中的相對豐度，按照豐度從大到小排列，以OTU序號作為橫坐標，OTU的相對豐度作為縱坐標使用R（v3.1.1）軟件作圖，得到OTU Rank曲線（見圖1）。根據OTU統計結果和OTU Rank曲線圖可知，酒曲中細菌種類較真菌種類多，從每種OTU的相對豐度來看，無論細菌還是真菌在酒曲中物種組成并不均勻，說明酒曲中不同物種含量相差較大。

圖1 大曲細菌(a)與真菌(b)OTU Rank曲線Fig.1 OTU Rank curve of bacteria(a)and fungi(b)fromDaqu

2.2 酒曲物種及其豐度分析

通過RDP classifer（v2.2）軟件對OTU代表序列分別與細菌和真菌數據庫比對進行物種注釋。對酒曲細菌以及真菌中各物種在門、綱、目、科、屬、種6個分類水平上的相對豐度進行統計，結果分別見表1、表2。

表1 大曲細菌不同分類水平相對豐度統計Table 1 Relative abundance ofDaqubacteria in different classification levels

表2 大曲真菌不同分類水平相對豐度統計Table 2 Relative abundance ofDaqufungi in different classification levels

根據酒曲物種相對豐度統計表可知，細菌中以Firmicute（厚壁菌門）下的Bacilli（芽孢桿菌綱）下的Lactobacillales（乳酸桿菌目）為優勢菌群，相對豐度值為29.72%；在屬分類水平，乳酸桿菌屬（Lactobacillus）相對豐度值為18.04%、片球菌屬（Pediococcus）相對豐度值為4.45%、乳球菌屬（Lactococcus）相對豐度值為0.58%、明串珠菌屬（Leuconostoc）相對豐度值0.29%，這些細菌均為乳酸菌，此外，芽孢桿菌屬（Bacillus）相對豐度值為0.76%、埃希氏桿菌屬（Escherichia）相對豐度值為1.34%、醋桿菌屬（Acetobacter）相對豐度值為0.33%、葡萄球菌屬（Staphylococcus）相對豐度值為0.87%、高溫放線菌屬（Thermoactinomyces）相對豐度值為0.23%、糖多孢菌屬（Saccharopolyspora）相對豐度值為2.41%，同時一些豐度很低的菌屬（表1未列出）也被檢測到，如棒狀桿菌屬（Corynebacterium）相對豐度值為0.02%、黃單胞菌屬（Xanthomonas）相對豐度值為0.01%、鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）相對豐度值為0.02%等，還有許多未分類的物種。

酒曲中真菌種類較少，以熱帶假絲酵母（Candidatropicalis）為優勢菌種，相對豐度高達98.5%；曲霉屬（Aspergillus）相對豐度值為0.89%、根毛霉屬（Rhizomucor）相對豐度值為0.08%、交鏈孢屬（Alternaria）相對豐度值為0.40%、翹孢霉屬（Emericella）相對豐度值為0.01%、威克漢姆酵母屬（Wickerhamomyces）相對豐度值為0.05%等均被檢測到。

2.3 酒曲樣品Alpha多樣性分析

Alpha多樣性（Alpha diversity）是對單個樣品中物種多樣性的分析，包括observed species指數、chao指數、ace指數，shannon指數以及simpson指數等。observed species指數、chao指數和ace指數反映樣品中群落的豐富度（species richness），這3個指數對應的稀釋曲線還可以反映樣品測序量是否足夠，稀釋曲線是從已測得的序列中隨機抽取n條序列計算對應的Alpha指數的期望值，然后根據n值與其相對應的Alpha指數的期望值繪制曲線。本次研究分別針酒曲中細菌和真菌用R（V3.1.1）軟件作出的Alpha指數稀釋曲線圖，結果分別見圖2、圖3。

圖2 大曲細菌Alpha多樣性指數稀釋曲線Fig.2 Alpha diversity rarefaction curve ofDaqubacteria

圖3 大曲真菌Alpha多樣性指數稀釋曲線Fig.3 Alpha diversity rarefaction curve ofDaqufungi

由酒曲Alpha多樣性指數稀釋曲線圖可知，隨著抽取序列數增大，真菌和細菌稀釋曲線均趨于平緩，說明本次測序深度已經基本覆蓋到樣品中所有的物種。從圖3細菌Alpha多樣性指數稀釋曲線可以看出只要對15 000條序列進行測定分析就可以覆蓋酒曲所有細菌，而本次研究細菌多樣性分析了28294條序列；同樣地由圖4可知，只要對20000條序列進行測定分析就能基本覆蓋酒曲所有真菌，而實際分析了34 931條序列。因此，本次對酒曲微生物多樣性的分析已基本覆蓋酒曲中微生物種類。

2.4 討論

乳酸菌作為大曲中的優勢細菌對于白酒中風味物質的產生至關重要。乳酸菌在白酒發酵過程能產生乳酸，乳酸又是形成乳酸乙酯的前體物質，而乳酸乙酯是清香型白酒中除乙酸乙酯外含量最多的酯類物質，適量的乳酸乙酯能增加酒體的醇厚感。乳球菌除發酵產乳酸外，也可生成乙醇、乙酸、甘油等副產物。此外，乳酸菌的代謝產物能夠維持白酒發酵的酸性環境[11-12]。除乳酸菌外，酒曲中還有芽孢桿菌、醋桿菌等細菌在白酒釀造過程中發揮重要作用。一般認為芽孢桿菌能產生淀粉酶和蛋白酶分解淀粉和蛋白質等大分子物質[13-14]，此外，有些芽孢桿菌能影響白酒風味物質如酯、醇的形成[15]。在白酒生產過程中，醋酸菌的主要代謝產物是醋酸，是白酒中主要的酸類物質，同時也是丁酸、己酸及酯類的前體物質，此外，醋酸菌也可以氧化葡萄糖生成少量酒精[16]。

有很多假絲酵母屬菌株都具有酒精發酵能力，有些假絲酵母還具有生香作用[17-18]。曲霉屬真菌在白酒發酵過程中可形成糖化力、液化力、蛋白質分解力，降解大分子物質如蛋白質、淀粉形成還原糖、氨基酸、多肽等[19]，產風味物質微生物可以進一步利用這些小分子物質生產多種多樣的香味物質。

酒曲質量的好壞直接影響白酒的質量和風格。酒曲制作即培養微生物的過程，酒曲為微生物的生長代謝提供了良好的環境，使得不同來源微生物可以共存其中；在制曲過程中，表現出微生物群落交替更迭的現象，形成了非常寶貴的微生物資源庫[20]。利用高通量測序技術能夠快速便捷地分析酒曲中微生物群落結構，了解酒曲微生物分布及其中的優勢菌群，同時能發現一些未知的微生物。

3 結論

本研究基于高通量測序技術在不同分類水平上全面系統地分析了北京清香型酒曲細菌和真菌的多樣性，對酒曲樣品進行Alpha多樣性分析表明本次測序深度足以覆蓋其微生物種類。

本次研究結果表明，酒曲中細菌OTU數為47，真菌OTU數為11，且每種OTU在酒曲中分布并不均勻；酒曲中細菌種類比真菌種類豐富；對微生物的相對豐度進行統計表明，乳酸菌是北京清香型酒曲中的一類優勢細菌，主要的乳酸菌包括乳酸桿菌屬、片球菌屬、乳球菌屬、明串珠菌屬四大類，還有其他細菌如芽孢桿菌、醋酸菌等；假絲酵母屬是酒曲中的優勢真菌，霉菌也被檢測到如曲霉屬、根毛霉屬等；此外也檢測到一些未分類的微生物。微生物研究將會是白酒永恒的課題，分子生物技術的發展必將促進白酒微生物的研究進展，使人們對白酒生產過程中微生物的認識不斷深入，從而促進我國白酒的進一步發展。

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Analysis on microbial diversity of Beijing light-flavorDaquby high-throughput sequencing

ZHANG Shuangyan1,LIAO Yonghong2,JI Nan2,ZHOU Xiaohong1*
(1.School of Life Science,Beijing Institute of Technology,Beijing 100081,China;2.School of Food and Chemical Engineering, Beijing Technology and Business University,Beijing 100048,China)

In order to analyze microbial diversity in Beijing light-flavorDaqu,16S rDNA V4 region and ITS1 region were analyzed by high-throughput sequencing technology,then the relative abundance ofDaqumicrobes in the different classification levels were counted.The results showed that Daqubacteria operational taxonomic units(OTU)was 47,fungi OTU was 11,the varieties of bacteria was more abundant than that of fungi.Lactic acid bacteria were the predominant bacteria,includingLactobacillus,Pediococcus,Lactococcus,Leuconostoc,andBacillusandAcetobacterwere also detected.Candidawas the predominant fungi.Aspergillus,Rhizomucor,Wickerhamomycesand other genus were also identified.Alpha diversity analysis showed that the number of analyzed sequences was enough to cover microbial species inDaqu.Finally,the possible function of dominant microbes in the process ofBaijiu-making was discussed.This study had important significance for the guidance ofBaijiu(Chinese liquor)production.

light-flavorDaqu;high-throughput sequencing;microbe;16S rDNA V4;ITS

Q93-3；TS261.1；TQ920

0254-5071（2016）11-0049-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.11.010

2016-08-18

國家“十二五”科技支撐計劃項目（2014BAC28B01）

張雙燕（1992-），女，碩士研究生，研究方向為食品微生物。

*通訊作者：周曉宏（1965-），男，副教授，博士，研究方向為食品生物技術。