菊粉酶的研究進展

張天祥，丁寧，楊春光，孫慎俠，王克鑫，馬君燕*

（大連大學醫學院，遼寧大連116622）

菊粉酶的研究進展

張天祥，丁寧，楊春光，孫慎俠，王克鑫，馬君燕*

（大連大學醫學院，遼寧大連116622）

菊粉酶是一類能水解β-2,1-D-果聚糖果糖苷鍵的水解酶，屬于糖苷水解酶32家族。菊粉酶是菊芋生物煉制中的關鍵酶，它能將菊芋一步水解，獲得高純度的果糖漿，生產燃料乙醇、燃料丁醇、單細胞油脂、生物柴油、甘露醇和乳酸等其它工業產品，在食品、醫藥及生物能源等領域有著巨大的應用價值。該文介紹了菊粉的分子結構及來源，概述了菊粉酶的分類、來源、克隆表達、三維結構及應用，并對菊粉酶的未來發展方向進行了展望，旨在提高人們對菊粉酶的認識，推動菊芋生物煉制的研究。

菊粉酶；糖苷水解酶32家族；三維結構；生物煉制

隨著不可再生能源危機的加劇，尋找新的可再生資源以擺脫對化石資源的依賴，是21世紀最為重要而又艱巨的任務之一。生物質是自然界最豐富的含碳有機大分子功能體，它可以通過生物煉制生產燃料乙醇、燃料丁醇等新的可再生生物質能源。利用來源于糧食作物的淀粉作為原料生產生物質能源已不符合社會發展的需要，所以利用非糧作物生產生物質能源產品成為中國乃至全世界關注的焦點。

菊芋俗名洋姜、鬼子姜，多年生草本植物，具有種植簡單、產量高、生命力頑強、耐貧瘠、耐寒、耐旱、耐鹽堿等特性，所以被廣泛種植于不適宜于糧食作物和經濟作物生長的鹽堿、灘涂和荒漠地。每年我國菊芋的產量約為5.4 t/hm2[1]。其低廉的價格、較高的產量，更為重要的是屬于非糧作物，從而使菊芋成為生物煉制關注的焦點。近年來，菊芋作為果糖漿、低聚果糖、生物乙醇、2,3-丁二醇及其他化學品的生物質原料受到廣泛關注[2]。開發利用菊芋，成為生物煉制研究領域中一個重要的研究方向，在食品、醫藥及生物能源等行業有著巨大的開發價值和商業潛力。菊粉（inulin）又稱菊糖，是一種廣泛存在于自然界中的天然果聚糖，主要由果糖和葡萄糖組成，其中果糖分子通過β-2,1糖苷鍵相連。

菊粉酶（inulinase）EC3.2.1是一類能水解β-2,1-D-果聚糖的水解酶，廣泛存在于微生物和植物中，尤其是絲狀真菌和酵母菌[3-4]。菊粉酶可以在一定的溫度條件下水解菊粉成果糖，廣泛用于食品、醫藥和生物能源等行業中。因此，開發利用菊粉酶，成為科研人員關注的焦點。早在1900年，LINDER P發現馬克斯克魯維酵母（Saccharomyces marxianus）以及其他一些酵母菌能夠利用菊粉。隨后，其他研究者發現脆壁克魯維酵母（Kluyveromyuces fragilis）能夠在菊粉上生長。1924年，PRINGSHEIMH等首次報道了黑曲霉（Aspergillus niger）能產菊粉酶[5]。1991年，LALOUX O等[6]利用分子生物學方法，首次克隆了外切菊粉酶基因INU1。近年來，科研人員從微生物菊粉酶的菌株篩選、誘變改造、酶學性質、克隆表達及同步糖化發酵等方面進行了較多的研究，并初步開始解析其結構和功能基團，然而，我國關于菊粉酶的研究比較晚，從20世紀90年代初開始，滯后于歐美等國家，現有菊粉酶在活力和穩定性方面仍較難達到工業化生產的要求。

本文介紹了菊粉的分子結構及來源，概述了菊粉酶的分類、來源、克隆表達、三維結構及應用，并展望了菊粉酶的未來發展方向，以期提高人們對菊粉酶的認識，為進一步推動菊粉酶在菊芋生物煉制中的應用奠定基礎。

1 菊粉

1.1 菊粉的分子結構

菊粉是由D-呋喃果糖分子通過β-2,1-糖苷鍵相連而成的鏈狀多糖，其末端與一分子葡萄糖殘基相連[3]，分子式為GFn，其中G為末端葡萄糖殘基，F代表果糖分子，n為聚合的果糖個數，菊粉酶結構如圖1。菊粉的聚合度一般為10～30，與植物來源、生長環境、收獲期和存儲時間等因素相關[7]，聚合度的差異對其溶解度影響較大，通常短鏈菊粉比長鏈菊粉易溶于水。

圖1 菊粉的分子結構[1]Fig.1 Molecule structure of inulin

1.2 菊粉的來源

菊粉是繼淀粉之后，植物中第二大儲藏性多糖，目前，已經在36 000多種植物組織中發現了菊粉的存在，數量約為植物種類總數的1/3，包括雙子葉植物中的菊科、橘?？?、龍膽科等11個科以及單子葉植物中的百合科、禾本科，都含有豐富的菊粉。然而，菊粉主要存在于菊科植物中，如廣泛存在于菊芋（Jerusalem artichoke）、菊苣（Chicorium intybus）、大麗花（Dahlia）和雪蓮果（Smallanthus sonchifolius）等植物的根和塊莖中[2]。其中菊粉在菊芋塊莖中的含量，可達其干質量的70%以上[8]。

菊粉可通過酸法（pH=1.0～2.0，80～100℃）或酶法直接轉化為易于利用的果糖漿。然而，酸法處理時，菊粉易形成沒有甜味帶顏色的副產物，如5-羥基康甲醛，而且產率低（＜45%），而酶法水解菊粉，具有工藝簡單、轉化率高、產物純、含量高等優點，尤其是菊粉酶通過一步水解，高達95%的果糖產率[5]。因而，菊粉酶作為菊芋生物煉制中的關鍵酶越來越受到重視[5]。

2 菊粉酶

2.1 菊粉酶的分類

根據對底物作用方式的不同，菊粉酶可以分成外切菊粉酶和內切菊粉酶。外切菊粉酶從底物分子的非還原末端催化水解下果糖殘基產生高果糖漿，其底物可以是菊粉、蔗糖或果聚糖[9]；內切菊粉酶催化水解菊粉內部的β-2,1-糖苷鍵，使其變成三糖、四糖或五糖為主的低聚果糖，但其缺少蔗糖酶活力[1，10]。通常用I/S的大小來區分內切菊粉酶和外切菊粉酶，I是以菊粉作底物時的酶活，S是以蔗糖作底物時的酶活，I/S大于10-2定義為菊粉酶，而I/S小于10-4定義為蔗糖酶。根據菊粉酶在微生物體內的主要分布可將其分為胞內酶、胞壁結合酶和胞外酶，它們的比例主要受菌種、碳源、溫度和pH的影響。根據來源，菊粉酶可以分為微生物菊粉酶和植物菊粉酶。

2.2 菊粉酶的來源

菊粉酶的來源很廣，自然界中的植物以及土壤、水和動物消化道中的多種微生物都可以分泌菊粉酶。植物來源的菊粉酶主要見于菊科植物，如菊芋的塊莖、天竺牡丹（大理菊）的塊根、薊的根等。植物來源的菊粉酶底物專一性強，只對菊粉具有催化活性，然而含量甚微；微生物來源的菊粉酶底物范圍廣，大多都能水解含有β-2,1呋喃果糖苷鍵的碳水化合物，如菊粉、蔗糖和棉子糖。但微生物來源的菊粉酶種類多，熱穩定性好，而且微生物生長迅速，培養簡單，且有些菌株可產生大量的酶，所以對菊粉酶的研究和利用主要針對各種微生物來源的酶。

根據報道，酵母菌約有10個屬20余種[2]、絲狀真菌約有17個屬40余種[2]、細菌約有12個屬10余種都能夠產生菊粉酶[2]，尤其是絲狀真菌和酵母菌[11]。其中，酵母菌產菊粉酶的能力比真菌和細菌產菊粉酶的能力強[12]。酵母菌中的馬克斯克魯維酵母（Kluyveromyces marxianus）、脆壁克魯維酵母（Kluyveromyces fragilis）、畢赤酵母（Pichia pastoris）和金黃色隱球酵母（Cryptococcus aureus）具有較高而且穩定的產酶活性，存在著潛在的工業應用價值[5]。尤其是馬克斯克魯維酵母。由于它和釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）進化關系最近，有共同的進化起源，與乳酸克魯維酵母（Klyuveromyces lactis）是姐妹菌株，可以分解乳糖和菊粉，并且具有生長快速、繁殖時間短、耐熱性好、能大量分泌外源蛋白、食品安性高等優點，使其在生物技術應用領域面臨的限制小，更加具有商業價值。K.marxianus CDBB-L-278菌株在以甘油和菊粉為碳源的培養基中生長，分泌的外切菊粉酶活力達34.78 U/mL[13]。SINGHR S等[14]報道以質量濃度2 g/100 mL的大麗花塊莖提取物為碳源，培養K.marxianusYS-1菌株，在通氣振蕩條件下，60 h后，獲得55.4 U/mL的外切菊粉酶。SHENG J等[15]發現在含有4%菊粉和0.5%酵母粉pH 5.0的人工海水中，28℃培養42 h后，CryptococcusaureusG7a酵母菌產外切菊粉酶的活力達85 U/mL。GONG F等[16]發現48 h搖瓶發酵后，季也蒙畢赤酵母（Pichia guilliermondii）產菊粉酶的活力為60 U/mL。

絲狀真菌中的曲霉菌屬（Aspergillussp.）和青霉菌屬（Penicilliumsp.）也是很好的生產菊粉酶的來源[2]。其中，曲霉菌屬是研究最多的真菌微生物。從土壤分離的無花果曲霉（Aspergillusficuum）JNSP5-06，在含菊粉的培養基中，30℃培養5 d后，產菊粉酶的活力為25 U/mL[17]。

雖然，細菌來源的菊粉酶產量遠不及酵母菌和絲狀真菌，但某些菌株能在較高的溫度生長。為了尋找適合工業生產的高溫酶，研究者對某些產菊粉酶的細菌菌株也展開了一定的研究，主要是芽孢桿菌屬（Bacillussp.）[18]、假單胞菌屬（Pseudomonassp.）和鏈霉菌屬（Streptomycessp.）[19-20]。嗜熱芽抱桿菌（G.stearothermophilus）KP1289菌株在41～69℃范圍內分泌外切菊粉酶，酶的最適作用溫度為60℃[21]。

2.3 菊粉酶的克隆表達

隨著分子生物學的發展，許多不同來源的微生物菊粉酶被克隆，并在大腸桿菌、克魯維酵母、畢赤酵母等宿主中表達[18，22-30]。外切菊粉酶中第一個被克隆和表達的基因INUI來自馬克斯克魯維酵母（Klyuveromyces marxiarzus var.marxianus）ATCC 12424菌株[6]。INU1的開放閱讀框（open reading frame，ORF）為1 668 bp，編碼555個氨基酸，其中前16個氨基酸是信號肽序列，共有13個可能的糖基化位點。該序列與S.cerevisiae來源的蔗糖酶有67%的同源性，它們來自共同的祖先。

WEN T Q等[31]對高產菊粉酶的菌株K.cicerisporus CBS4857的菊粉酶基因進行了克隆和分析，此基因ORF為1 665 bp，編碼555個氨基酸，前23個氨基酸為該菊粉酶基因的信號肽部分，與K.marxianusCBS6556和K.marxianus var.marxianusATCC12424菊粉酶基因的同源性分別為99%和98%。

ZHANG S F等[32]將K.marxianusCBS6556菌株的菊粉酶基因克隆并在P.pastorisX-33表達，獲得具有較高菊粉酶活力的重組菌株。重組菌分泌的上清中外切菊粉酶活力對伊利菊粉和Sigma菊粉分別為6 667 U/mL和1 212 U/mL。該基因的ORF編碼556個氨基酸，其氨基酸序列與S.cerevisia蔗糖酶有59%的同源性，基因序列與K.marxianusvar. marxianusATCC12424來源的菊粉酶基因有95%的同源性?；蛐蛄械?′端含有Migl結合位點（TAAATCCGGGG），說明該菊粉酶基因的表達受葡萄糖的抑制作用。

近年來，池振明課題組從中國南海海泥中分離得到可產菊粉酶的海洋酵母C.aureusG7a和C.aureusHYA，兩菌株分泌的外切菊粉酶基因的ORF分別是1557bp和1653bp，基因都不含內含子，編碼518和550個氨基酸，分子質量分別為60.0 ku和59.5 ku[12，15]。

2.4 菊粉酶的三維結構

菊粉酶屬于糖苷水解酶32家族（goycoside hydrolase 32，GH32），此家族有共同的3D結構特征：N-端5-折疊β-螺旋漿形成的催化區域和C-端的β-折疊三明治區[33-35]，如圖2。N-端的每個螺旋漿包括4個反向平行的β-折疊片，形成經典的‘W'拓撲結構，輻射狀圍繞著中心軸，封閉帶負電荷的催化活性口袋[36]。每個β-折疊片之間由發卡環連接，其中，β-折疊片1離中心軸最近，并與中心軸平行。整個N-端結構域的形狀類似圓柱形，每個螺旋漿中β-折疊片4位于圓柱筒的最外面[36]。C-端結構域由2個反向平行的β-折疊片組成，每個β-折疊片包括6個β-折疊股，組裝成類似三明治的結構，此區域具有協調二聚體相互作用、識別底物與底物結合的作用[36-39]。

圖2 菊粉酶的三維結構[37]Fig.2 Three-dimensional structure of inulinase

有關GH32家族結構的研究，可以追溯到20世紀90年代，早期的研究主要是通過定點突變來確定酶的催化活性中心，隨后開展了保守區域氨基酸所起作用以及活性位點周圍氨基酸在酶催化、空間結構穩定、底物特異性方面的研究。上述研究主要以植物果聚糖1-外源水解酶、6-外源水解酶、蔗糖酶為研究對象[37，40-41]，針對微生物菊粉酶結構與功能關系的研究較少，曾有報道內外切菊粉酶底物選擇性不同，是因為內切菊粉酶在催化活性中心有兩個loop環形成的額外的口袋[42]。目前，GH32家族已有12種酶的晶體結構得到解析。菊粉酶有兩個晶體結構得到解析，一個是泡盛曲霉（Aspergillus awamori）來源的外切菊粉酶[36]，另一個是無花果曲霉來源的內切菊粉酶（晶體結構數據庫（protein data bank，PDB）3RWK）。天然外切菊粉酶在相同的結晶條件下呈現出兩種晶型。一種晶型是P212121斜方晶系空間群（PDB：1Y9M），另一種晶型是P21單斜晶系空間群（1Y4W），這兩種晶型除了糖基化程度不一致外，其它結構基本一致[36]。晶體結構的解析可以確定酶的催化活性中心、酶與底物的結合位點及最優構象、闡明催化機制，認識結構與功能之間的關系，從而幫助研究者設計動力學性質更優越的酶，適合工業化生產的需求。

2.5 菊粉酶的應用

2.5.1 生產高果糖漿

果糖是理想的甜味劑，其甜度是蔗糖的1.8倍。其代謝不受胰島素制約，可以供糖尿病患者食用，而且不易被口腔微生物利用，對牙齒的不利影響小于蔗糖，可以預防糖尿病、肥胖癥，被認為是21世紀全球代替蔗糖、葡萄糖的新型功能性糖。果糖廣泛用于食品、醫藥和代替蔗糖生產飲料等行業中。果糖漿可由外切菊粉酶以菊粉為原料一步催化完成，果糖含量高達95%。相對于以淀粉為原料經多步酶法生產果糖的工藝及酸法水解菊粉獲得果糖的方法，具有工藝簡單、轉化率高、產物純等優點。因此，菊粉酶在果糖及果葡糖漿的生產上具有巨大的開發價值和應用潛力。

2.5.2 生產低聚果糖

低聚果糖的聚合度為2～7，是純天然、高效能、無公害的綠色食品和飼料添加劑，是一種功能性多糖，有多種生理功能，如改善腸道內微生物區系，使腸道菌群中雙歧桿菌等有益菌數量增加、產氣莢膜梭菌等有害菌群數量降低；改善脂質代謝，降低血脂和膽固醇；促進礦物質的吸收等。低聚果糖以其優越的生理功能，日益得到人們的廣泛重視。內切菊粉酶水解菊粉可以得到高純度的低聚果糖。不同來源的內切菊粉酶可得到不同聚合度的低聚果糖，如青霉菌屬（Penicilliumsp.）TN-88內切菊粉酶的產物以二聚果糖（F2）、三聚果糖（F3）和四聚果糖（F4）為主；黃單胞菌屬（Xanthomonassp.）所產內切菊粉酶的水解產物主要為聚合度為大于等于5的低聚糖。

2.5.3 生產生物乙醇

生物乙醇是一種新的可再生資源，可作為石油、煤炭等能源的替代燃料和燃料添加劑，已在中國、美國、印度等國家廣泛應用。以菊芋為原料，利用外切菊粉酶生產果糖，進而通過能利用果糖的微生物（如S.cerevisiae）發酵產生生物乙醇，為解決能源枯竭問題開辟了一條新途徑。相較于木質纖維素的利用過程，菊粉酶預處理簡單，反應條件溫和，且僅需要菊粉外切酶一步就可以把菊粉轉化為果糖。國內外對此方面的研究較多[2]，如ZHANG T等[23]克隆季也蒙畢赤酵母（P.guilliermondii）strain l中的外切菊粉酶基因INUI，在Saccharomycessp.WO尿嘧啶突變菌株中表達，72 h發酵培養后，外切菊粉酶活力為34.2 U/mL，加入菊粉后，重組菌株可以直接利用菊粉的水解產物進行發酵生產乙醇，從100 mL發酵液中得到13.7 mL的乙醇，果糖的轉化率為99.1%。

2.5.4 其他產品

以菊芋為原料，利用外切菊粉酶的水解產物果糖和葡萄糖，制備生物丁醇、生物油脂、2,3-丁二醇、乳酸、甘露醇、單細胞蛋白等產品，廣泛應用在食品、醫藥和化工等領域。

3 展望

從自然界中尋找生產菊粉酶的微生物是科研工作者努力的方向，但大量的菌株篩選既耗時又費力，且存在菊粉酶在天然材料中表達水平低、分離純化困難、活性低等難題，難以達到工業化生產的要求，限制了菊芋生物煉制的工業化發展。伴隨分子生物學和糖生物學的發展，20世紀80年代興起的對現有的天然蛋白質進行改造的蛋白分子改造工程和對蛋白質進行糖基化修飾的蛋白質糖基化工程，是解決這一系列問題的有效措施，可以獲得適合工業生產的高活性、表達量高及熱穩定性好等理化性質優越的“量身定制”的工業菊粉酶。

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[40]LE ROY K,LAMMEMS W,VERHAEST M,et al.Unraveling the difference between invertases and fructan exohydrolases:a single amino acid(Asp-239)substitution transformsArabidopsiscell wall invertase1 into a fructan 1-exohydrolase[J].Plant Physiol,2007,145(3):616-625.

[41]LE ROY K,LAMMENS W,VAN LAERE A,et al.Influencing the binding configuration of sucrose in the active sites of chicory fructan 1-exohydrolase and sugar beet fructan 6-exohydrolase[J].New Phytol, 2008,178(3):572-580.

Research progress of inulinase

ZHANG Tianxiang,DING Ning,YANG Chunguang,SUN Shenxia,WANG Kexin,MA Junyan*
(Medical College,Dalian University,Dalian 116622,China)

Inulinase is a hydrolase that targets on the β-2,1-D-fructosyl-fructose bonds,belonging to glycoside hydrolase family 32.Inulinase is a key enzyme inJerusalem artichokebiorefinery.It can hydrolyzeJ.artichokeinto high purity fructose syrup by one step.The fructose can be further transformed into fuel ethanol,biobutanol,single cell oil,biodiesel,mannitol,lactic acid and other important industrial products which can be widely used in food,pharmaceutical and biofuels fields.The paper introduced the molecular structure and source of inulin,summarized the classification,source, cloning expression,three dimensional structure and application of inulinase,meanwhile,the future development of inulinase was discussed as well, which aimed to improve people's awareness of inulinase and promote the research development ofJ.artichokebiorefinery.

inulinase;glycoside hydrolase family 32;three dimensional structure;biorefinery

Q55

0254-5071（2016）11-0021-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.11.004

2016-05-30

國家自然科學基金資助項目（31370937）；遼寧?。▏遥┐髮W生創新創業訓練計劃項目（201511258026）

張天祥（1993-），男，本科生，研究方向為酶工程與糖生物學。

*通訊作者：馬君燕（1981-），女，講師，博士，研究方向為酶工程與糖生物學。