食品中4-甲基咪唑的分析方法

崔金梅，高麗華*，劉婷

（北京食品科學研究院，北京100050）

食品中4-甲基咪唑的分析方法

崔金梅，高麗華*，劉婷

（北京食品科學研究院，北京100050）

該文介紹了食品中4-甲基咪唑的常見來源，以及4-甲基咪唑對人體健康可能存在的風險，并對近年來食品中4-甲基咪唑含量的分析方法進行了總結，介紹了各分析方法的優缺點以及在國內外的應用情況。最后對食品中4-甲基咪唑檢測技術的發展進行了展望。

4-甲基咪唑；食品；分析方法；液相色譜-質譜法；氣相色譜-質譜法

4-甲基咪唑（4-methylimidazole，4-MI）是一種重要的有機雜環化合物，化學分子式為C4H6N2。它是由甲基取代咪唑4位的氫形成，是一種白色至類白色結晶粉末，溶于水和乙醇，有腐蝕性。在某些食品中，碳水化合物和含胺基化合物通過美拉德反應產生一種褐變反應的過程中通常會形成4-MI，在焙烤食品、烤肉、咖啡和以亞硫酸銨為原料生產的焦糖色素中往往會存在4-MI，在食品釀造過程中也會產生4-MI。

研究表明，4-MI能導致動物長腫瘤，有可能給人體帶來致癌風險。焦糖色素是一種在食品中應用范圍十分廣泛的著色劑，是食品添加劑中的重要一員。雖然4-MI有比較大的危害性，但只要它是合格食品添加劑焦糖中的物質，含量在允許的范圍內，那么對人體將不會有太大的損害。迄今為止我國僅在食品安全國家標準GB1886.64—2015《食品添加劑焦糖色》[1]中明確了4-MI的測定方法和限量要求（4-MI≤200 mg/kg），沒有制定人體每日允許攝入4-MI的每日允許攝入量（acceptable daily intake，ADI）。歐盟和世界衛生組織確定焦糖色素中4-MI的含量最高不得超過250 mg/kg。國際上尚沒有4-MI的既定ADI值，也還沒有涉及其他食品中4-MI的相關規定或標準。但是明確了加入焦糖色素的食品應在其標簽中注明，以使其日攝入量在安全范圍之內。

作為一種涉及食品質量安全的重要有機化合物，高效、靈敏和準確的4-MI檢測方法對質量控制和監督非常重要。4-MI主要涉及的食品是碳酸飲料、咖啡等含有焦糖色素的飲料、飲品以及醬類、焙烤食品和焦糖色素，其相關檢測方法有液相色譜法[2-8]（包括超高效液相色譜法）、液相色譜-質譜法（liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS）[3，9-20]、氣相色譜法（gas chromatography，GC）[21]、氣相色譜質譜聯用法（GC-MS）[22-31]、毛細管電泳法（capillary electrophoresis，CE）[32-33]、離子色譜法（ion chromatography，IC）[34]、二維液相色譜法（LC-LC）[35]、分光光度法（ultraviolet-visible spectrophotometry，UV-Vis）[36-38]和其他方法[39]。本文對近年來發表的有關4-MI分析測定方法的文獻進行了綜述，相關的結論可供質量控制和監督以及標準制定部門參考。

1 食品中4-甲基咪唑含量測定的難點

4-MI是一個兩性極性化合物，它的分子結構中含有一個堿性的“吡啶樣的氮”和一個弱酸性的“吡咯樣的氨基氮”，其pKa為7.6。4-MI分子的強極性特征增加了復雜的食品基質中提取和測定過程的難度，使得GC和LC法的直接應用都有一定的局限。高極性和堿性這些特征使得4-MI呈現出能與反相液相色譜柱填料的硅醇基發生反應和保留性不強的特征，在應用LC測定前需要采用一些辦法克服這些問題，改善保留使分離的色譜峰更對稱（如使用離子對試劑）。LC法測定4-MI需要采用固相萃取凈化樣品，且靈敏度有限。GC法測定食品中的4-MI，需要用離子對試劑對4-MI進行提取再衍生，前處理繁瑣、耗時、重復性差且靈敏度并不高。并且，GC法測定4-MI所能選用的衍生試劑比較有限，且容易對分離柱的靈敏度造成影響。與GC和LC法相比，GC-MS和LC-MS法靈敏度更高，更適合食品中微量4-MI的分析測定。在實驗室常用的分析方法中，薄層色譜法（thin layer chromatography，TLC）選擇性差、靈敏度低，不太適合基質復雜的食品中微量和痕量4-MI的準確測定。分光光度法需要有相應的顯色反應，且穩定性和靈敏度均較差，在實際的食品中4-MI的含量監測中應用有較大地局限性。特別要指出的是毛細管電泳儀在食品分析實驗室還不夠普及，因此毛細管電泳法雖然有較高的靈敏度，但在食品質量監督中的實際應用價值不高。

2 食品中4-甲基咪唑的測定方法

早在1979年日本就有焦糖中4-MI定量分析的研究報道。此后，應用反相離子對液相色譜法和薄層色譜法測定焦糖色素和食品中4-MI的方法均有報道。幾十年來，隨著儀器分析技術的不斷發展，針對食品中4-MI的新的分析方法也被陸續報道。表1對迄今為止SCI（2000年以來收錄的）和中文核心期刊（2005年以來）文獻報道的食品中4-MI的測定方法進行了總結，列出了食品中4-MI的提取方法、測定方式、方法的標準曲線的線性范圍、方法的檢出限和回收率。

從表1可以看出，涉及LC-MS技術的測定方法最多，其次為GC-MS法和LC法。此外，毛細管電泳[32-33]、離子色譜[34]和二維液相色譜[35]在食品中4-MI的測定中均有應用，而分光光度法測定4-MI的文獻[36-38]都是2010年前在中文核心期刊上發表的。顯然，隨著色譜、質譜、色譜質譜聯用技術、色譜柱技術及其樣品前處理技術的發展和儀器設備的更新和普及，特別是超高效液相色譜串級質譜技術在靈敏度、選擇性和準確性以及分析速度等方面具有其他分析技術無法媲美的優勢，它在食品這類復雜基質中4-MI的含量測定中應用最廣泛。

如表1所示，高效液相色譜-串級質譜（high performance liquid chromatography-mass spectrometry/mass spectrometry，HPLC-MS/MS）法（包括超高效液相色譜二級質譜法）在甘草汁[9]、焦糖色素[10]、醬油[16-17，20-21]、醋[10，13，20-21]、飲料[10-12，14-16，19-20]、醬[13]、咖喱[13]、咖啡[16]、焙烤食品[18]和其他調味料[13]等食品中4-MI測定的應用中，檢出限最低可達1.5 μg/kg[18，21]，定量限最低可達3.0 μg/kg[19]，回收率最低為67.5%[19]，最高達117.2%[21]，定量方法有內標法[9-11，15，18-21]和外標法[2，12-14，16-17]，使用的內標物有氘代4-MI[9，10，15，18-21]、密胺[11]。樣品前處理有直接稀釋進樣[11，13-15，39]，也有采用先酸化再經固相萃取對4-MI進行提取凈化，使用的固相萃取小柱有Waters Oasis MCX混合型陽離子萃取小柱[10，17，19-20]、StrataTMX-C含有N-乙烯吡咯烷酮的功能性聚合物吸附劑的固相萃取柱[12]、Waters C18固相萃取柱[13]和QuEChERS樣品凈化試劑包[18，21]。

GC-MS法在黃米酒[23]、醬油[23]、飲料[24，27]、咖啡[25]、焦糖色素[26，31]、啤酒[27]、食醋[28-29]等食品中4-MI測定的應用中檢出限最低可達5μg/kg[23，25]，最低檢出質量濃度可達0.6ng/mL[27]，定量限最低可達15 μg/kg[23]，回收率最低78.3%[23]，最高達114%[28]。定量方法有內標法[23-28]和外標法[29，31]，使用的內標物有氘代氨基甲酸酯[23]、2-甲基咪唑[24]、2-乙基咪唑[25-27]、N-甲基甲酰苯胺[28]。樣品前處理有采用堿性硅藻土固相萃取柱提取凈化[23]，有采用PDMS-DVB萃取頭富集提取的頂空固相微萃取方式[24]，有采用樣品堿化后用硅藻土凈化[28，31]的方式，有用固相萃取柱凈化提取[29]的方式，還有先采用離子對試劑雙（2-乙基己基）磷酸酯對樣品中的4-MI進行萃取，再用氯甲酸異丁酯進行衍生[25-27]的方式。

在LC-MS和GC-MS檢測食品中4-MI的方法中，比較新的樣品前處理技術如QuEChERS樣品凈化試劑包、具有離子交換功能的固相萃取小柱和新型色譜柱如HILIC色譜柱都有應用。這些新技術大大簡化了樣品處理步驟，提高了檢測方法的選擇性、靈敏度和準確性。

由于4-MI分子極性強，易形成氫鍵，因此直接測定易造成色譜峰脫尾，峰形不對稱。在采用GC-MS測定前需要對食品中的4-MI先提取再衍生，而提取方式和衍生試劑的選擇、提取試劑和衍生試劑的濃度、提取效率、衍生反應的pH條件、反應溫度、反應時間、衍生物的提取和衍生產物的穩定性都會影響最終測定結果的準確性和精密度。與LC-MS法相比，GC-MS法樣品前處理步驟更復雜、耗時更多，并且方法的靈敏度和準確性并沒有太明顯的優勢。

在食品中4-MI的測定中，LC法和GC法樣品前處理方式分別與LC-MS法和GC-MS法相似，但方法靈敏度遠遠低于LC-MS法和GC-MS法。

毛細管電泳法[32-33]和離子色譜法[34]測定食品中4-MI的方法檢出限高于LC-MS和GC-MS，相比之下并沒有明顯的優勢。同樣，基于適合分離復雜混合物的二維液相色譜技術[37]的測定方法，其標準曲線的線性范圍是20～500 mg/L，靈敏度并沒有LC-MS和GC-MS高。

目前，我國食品安全國家標準GB1886.64—2015《食品添加劑焦糖色》[1]采用氣相色譜-火焰離子化法測定焦糖色素中的4-MI。聯合國糧農組織食品添加劑聯合專家委員會標準“Caramel colours”[40]規定以2-甲基咪唑（2-MI）為內標，采用氣相色譜（氣液色譜）配置氫火焰檢測器測定焦糖色素中的4-MI。這兩種方法檢出限均達到mg/kg級。陜西省食品安全地方標準DBS61 0007—2015《飲料中4-甲基咪唑和2-甲基咪唑的測定》[41]規定采用液相色譜-串聯質譜法（LC-MS/MS）對碳酸飲料、特殊用途飲料、茶飲料、咖啡等飲料中4-甲基咪唑和2-甲基咪唑進行測定。試樣中的4-甲基咪唑和2-甲基咪唑經水溶解或稀釋，振蕩后，陽離子固相萃取柱凈化，液相色譜-串聯質譜法測定，氘代4-甲基咪唑內標法定量。該方法對4-甲基咪唑、2-甲基咪唑的定量限均為10.0 μg/kg，回收率為88.8%～119.9%。

表1 食品中4-甲基咪唑含量的分析方法Table 1 Analytical methods of 4-methylimidazole in foodstuffs

續表

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3 展望

綜上所述，檢測食品等復雜基質樣品中4-MI含量的各種方法中，采用固相萃取法提取凈化樣品中的4-MI，采用超高效液相色譜串級質譜法進行分析測定在分析速度、選擇性、靈敏度和準確性方面具有優勢，可以作為制定相關國家標準的首選方法。應該引起關注的是相關國標方法的欠缺不利于我國含有焦糖色素食品的質量安全控制和質量監督。由于我國許多不可或缺的傳統食品中都添加焦糖色素，例如醬油和醬等，因此，制定食品中4-MI測定方法的國家標準是十分必要和迫在眉睫的。

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Analytical methods of 4-methylimidazole in foodstuffs

CUI Jinmei,GAO Lihua*,LIU Ting
(Beijing Academy of Food Sciences,Beijing 100050,China)

The common sources of 4-methylimidazole(4-MI)in foodstuffs and the possible risk of 4-MI for human health were introduced in the paper.The analytical methods of 4-MI in foodstuffs were summarized.The advantages,disadvantages and application of each detection method were introduced home and abroad.Finally,the development of detection technologies of 4-MI in foodstuffs was prospected.

4-methylimidazole;foodstuffs;analytical method;LC-MS;GC-MS

TS207.5

0254-5071（2016）11-0007-08

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.11.002

2016-06-14

國家重點研發計劃課題（2016YFD0400505）

崔金梅（1977-），女，工程師，本科，研究方向為食品檢測。

*通訊作者：高麗華（1971-），女，高級工程師，本科，研究方向為食品檢測。