FTIR技術結合區間偏最小二乘法快速測定油脂中反式脂肪酸

葉 沁 潘丹杰 栗 磊 楊志成 孟祥河

(浙江工業大學海洋學院1, 杭州 310014) (杭州市糧油中心檢驗監測站2, 杭州 310009)

FTIR技術結合區間偏最小二乘法快速測定油脂中反式脂肪酸

葉 沁1潘丹杰2栗 磊1楊志成2孟祥河1

(浙江工業大學海洋學院1, 杭州 310014) (杭州市糧油中心檢驗監測站2, 杭州 310009)

研究了傅里葉紅外光譜技術結合區間偏最小二乘法(iPLS)快速分析食用油中低含量(0.1%～5%)反式脂肪酸的分析方法。通過系統地比較衰減全反射紅外光譜法(ATR-FTIR)及衰減透射紅外光譜法(TR-FTIR)光譜的模型效果，優化建模區間。研究結果表明，ATR-FTIR、TR-FTIR-PLS回歸模型均能有效測定油脂中低濃度反式脂肪酸的含量，但TR-FTIR法靈敏度優于ATR-FTIR法。iPLS區間選擇結果顯示，以1 000～940 cm-1波段透射光譜建模，相關系數R2為0.998 8，標準集的RMSEC 0.016 6，驗證集RMSEP為0.008 75，預測相對標準偏差2.92%，預測值與實際值高度相關，Y預測=1.00X實際-0.003 44，R2=0.998 7。12組外部驗證試驗相對標準偏差為4.80%，說明預測精確度較高、模型穩定性好，有潛力替代傳統氣相色譜法用于油脂中低含量反式脂肪酸快速定量測定。

FTIR iPLS 反式脂肪酸 油脂

反式脂肪酸(TFAs)是一類分子結構中含有非共軛反式雙鍵的不飽和脂肪酸[1]。研究表明，TFAs與血脂代謝，血管炎癥和心腦血管疾病的發展變化之間有很強的相關性[2]。傳統的油和脂肪中反式脂肪酸的分析一般采用氣相色譜(GC)技術。該方法準確度高，但需要脂類衍生化處理，耗時長，需要昂貴的標品及良好的試驗技能。與此相反，快速的測定方法，例如近紅外，拉曼和中紅外光譜(FTIR)也被應用于食物中脂肪酸的 分析[3-5]。

傅里葉變換中紅外光譜法克服了傳統的化學法需要甲酯化、使用有毒性、有害試劑等缺點，操作簡單，重復性高，時間短。其不足是靈敏度低，不適合于TFAs含量小于0.5%的樣品。本試驗對比研究了FTIR透射光譜與ATR-FTIR光譜快速定量分析TFAs技術，同時結合區間偏最小二乘法(iPLS)優化了定量模型，開發了低TFAs含量樣品的快速檢測方法。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

反式亞油酸甲酯C18:2(純度≥99%)：美國Nu Check公司；正己烷(色譜純)：美國 Tedia 公司；精煉大豆油、菜籽油、花生油：市售。

BRUKER TENSOR 27傅里葉紅外光譜儀(配有ATR采樣系統、TR樣品池、OPUS 操作軟件)：德國布魯克公司。

1.2 標準樣品的制備

將反式脂肪酸標準樣品分別按比例溶于大豆油、菜籽油和花生油中。用作標準曲線制備的反式亞油酸甲酯的加入比例分別為：5%、3%、1%、0.7%、0.5%、0.4%、0.3%、0.2%、0.15%、0.1%、0.05%，共得36個校正集樣品。精確配置成總體積為5 mL的混合溶液，搖勻，靜置后備用。精確移取1 mL配置好的標準樣品，用5倍(V/V)色譜級的正己烷稀釋，搖勻，靜置后作為透射標準樣品備用。另配置11個樣品作為驗證集，反式亞油酸甲酯加入比例為5%、3%、1%、0.7%、0.4%、0.2%、0.1%，隨機溶于大豆油、菜籽油和花生油中，搖勻靜置后，同樣精確量取1 mL，分別以1∶5稀釋混勻。

1.3 紅外光譜的采集

全反射樣品的采集，取適量樣品均勻地涂在ATR 附件的晶體材料(ZnSe) 上，使其完全覆蓋晶體表面，OPUS軟件記錄4 000～400 cm-1的吸收光譜，分辨率為4 cm-1，掃描次數為32次，測量環境的濕度需小于70%，溫度保持在25 ℃。

透射樣品的采集，樣品池用色譜純正己烷潤洗5遍后，用待測樣品潤洗3遍，上樣， 記錄光譜。

1.4 模型的建立

采用TQ Analyst光譜分析軟件對所得紅外光譜進行預處理及分析，通過對紅外光譜進行預處理，可以優化所建立的模型。預處理方式一般包括一階導數，二階導數，自動平滑等。在光譜采集過程中，光譜噪聲會造成偏最小二乘法出現微小偏差，影響模型的穩定性。因此，本研究采用將光譜采集后自動平滑，從而提高模型的穩定性。

1.5 模型穩定性的驗證

對于所建的模型，需要對其穩定性進行驗證。將反式亞油酸甲酯隨機溶于大豆油、菜籽油和花生油，摻入比例隨機配制12個預測集樣品。主要預測指標有校正相關系數(R)，交叉驗證誤差均方根(RMSECV)，預測均方差(RMSEP)，預測相對偏差(RPD)。

1.6 區間偏最小二乘法(iPLS)

選擇合適的波段能使所建立的模型具有更好的穩定性。本試驗將采用區間偏最小二乘法(iPLS)對光譜波段進行優化。區間偏最小二乘法(iPLS)建模是根據偏最小二乘法回歸模型將譜圖波段分成更小的區間。將每個子區間計算所得的交叉驗證誤差均方根(RMSECV)與全波段下的數值相比，然后選擇所得RMSECV較小的子區間[6]。該方法的一個主要優點是采用局部回歸建模的方法，主要體現在根據比較每一個子區間的模型和全波段模型比較，最后選擇確定最優區間[7-8]。

1.7 數據處理

利用 TQ Analyst 光譜分析軟件進行定標模型的建立，建立導入的預測樣品根據建立的模型進行數學運算從而得出預測樣品的反式脂肪酸的濃度。

2 結果與分析

2.1 食用油的紅外吸收光譜

由于孤立反式雙鍵中CH官能團的平面振動變形，反式脂肪酸在966 cm-1處表現特征吸收，吸收強度和反式脂肪酸在油樣中的含量相關[11]。隨著反式亞油酸甲酯含量的增加，966 cm-1處的吸收峰也隨之增加，吸收強度也隨之變大。

b 1∶5不同反式脂肪酸含量的食用油、正己烷溶液的TR-FTIR光譜圖

圖1 食用油中定量添加反式脂肪酸的紅外光譜圖

2.2 模型的優化

2.2.1 經典PLS

根據各特征官能團所在的波段，將全反射及透射光譜(4 000～600 cm-1)分為6個波段，其相應區間所對應的特征官能團及建模結果見表1。研究采用交叉驗證誤差均方根(RMSECV)，預測方差(RMSEP)以及相關系數(R) 3項指標綜合評價模型的準確性，結果顯示無論是全反射法還是透射法均是基于990～920 cm-1波段所建立的模型較好，其R值最接近1，且RMSECV最小，但RPD的值均偏高，所建立模型并不理想。

表1 ATR和TR經驗PLS波段選擇結果

注：RMSECV：交叉驗證誤差均方根， RMSEP：預測方差，R：相關系數，RPD：預測相對偏差，余同。

表2 ATR和TR區間偏最小二乘法(iPLS)波段選擇結果

2.2.2 iPLS

因此本試驗引入區間偏最小二乘法(iPLS)對全反射和透射波譜的最優波段進行選擇。全波段(4 000～600 cm-1)依次分成10、20、34、43、58個區間，依次建模，結果見表2。從表2中可以看出，在全反射和透射中，最優建模區間均為1 000～940 cm-1(全波段分為58個區間)。在此波段上，利用全反射光譜建模所得RMSECV為0.076，RMSEP為0.090 5，R為0.998 8，利用透射建模所得RMSECV為 0.016 6，RMSEP為0.008 75，R為0.998 8。但透射的RPD值(2.92%)小于全反射RPD值(8.24%)。由此可以看出波譜區間選擇對提高模型穩定性的重要性。

2.3 模型的驗證和預測

選取按一定比例添加反式亞油酸甲酯的大豆油、菜籽油、花生油共11組，作為驗證集，采用基于iPLS-58區間的FTIR/ATR和FTIR/TR最優模型進行驗證。預測效果如圖2所示。TFAs的預測結果均與實際值高度相關，斜率均為1，截距接近0，說明開發的TFAs的FTIR/TR、ATR/FTIR分析模型準確度較高。于修燭等[12]，陶健等[11]分別探討了FTIR-ATR技術結合二階導光譜測定油脂中反式脂肪酸，得到了較好的結果，但其主要針對TFAs含量高于0.5%的樣品。本研究開發的FTIR透射光譜與ATR-FTIR光譜模型均可準確預測低TFAs含量，尤其適合TFAs小于0.5%的樣品。

圖2 樣品標準集和預測集擬合曲線

2.4 準確性試驗

隨機配制12組低反式亞油酸甲酯含量的樣品驗證分析模型的準確性，見表3。其中FTIR/ATR模型預測組的平均相對誤差為6.34%；FTIR/TR預測組為4.80%。da Costa Filho[13]采用FTIR-ATR結合偏最小二乘法(PLS)技術檢測食用油中小于1%的反式脂肪酸含量，所得相關系數為0.982。黃向榮[14]等采用氣相色譜法測定50份動物油脂中的反式脂肪酸(5.15%～7.67%)，相應RSD為3.52%～4.63%。對比發現，本研究所采用的全反射傅里葉轉換紅外光譜法結合區間偏最小二乘法不僅避免了GC法復雜、費時的樣品前處理，同時也實現了油脂中低含量(<0.5%)反式脂肪酸的檢測，準確度較高。此外，數據顯示TR-FTIR法的準確度優于ATR-FTIR法。

表3 ATR準確性驗證結果

3 結論

建立了基于傅里葉變換紅外光譜技術的油脂反式脂肪酸的快速測定方法，分析時間從傳統GC方法的2～3 h縮短到3～5 min。經分析比較發現，水平衰減全反射傅里葉變換紅外光譜法和透射傅里葉變換紅外光譜法均可以用于反式脂肪酸含量的快速測定。其中，透射法線性關系和準確度明顯更好，且靈敏度也較高，對反式脂肪酸含量<0.5%以下的樣品亦有較高的參考價值。在模型建立方面，無論是全反射法還是透射法均是基于1 000～940 cm-1波段所建立的模型預測效果更好，其中ATR-FTIR組的R值為0.998 8，RMSECV為0.076，TR-FTIR組的R值為0.998 8，RMSECV為0.016 6。與經典的GC法相比，省略了繁瑣的脂肪酸皂化、甲脂化等樣品前處理過程，且實驗成本也大大降低，測定和計算過程也簡化了很多。

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Rapid Determination of Trans-Fatty Acids in Oils and Fats by FTIR Technology Combined with IntervalPartial Least Squares

Ye Qin1Pan Danjie2Li Lei1Yang Zhicheng1Meng Xianghe1

(Ocean College，Zhejiang University of Technology1，Hangzhou 310014)(Hangzhou Grain and Oil Center Inspection Station2，Hangzhou 310009)

In order to rapidly analyze the low level (0.1%～5%) trans fatty acids in edible oils, FTIR technology combined with interval partial least squares is studied in this paper. The effects of attenuated total reflection-Fourier transform infrared spectroscopy (ATR-FTIR) and Fourier transform infrared spectroscopy (TR-FTIR) models are systematically compared for optimization of spectral modeling interval. The results show that both ATR-FTIR regression model and TR-FTIR-iPLS regression model are effective in term of determination of low level trans fatty acids in oils. However, TR-FTIR method has higher sensitivity than that of ATR-FTIR method. The results of iPLS interval selection demonstrate that when transmission spectra model is established based on 1 000～940 cm-1, coefficient of correlationR2(0.998 8), RMSEC of 0.016 6, RMSEP of 0.008 75 and relative standard deviation of 2.92% are obtained. The FTIR/TR predictive values are highly correlated with the actual values with a regression equation ofYprediction= 1.00Xactuality-0.003 44,R2=0.998 7. The relative standard deviation of 12 groups of external validation tests (4.80%) shows that the model has higher prediction accuracy, and better stability. It is potential for TR/FTIR-iPLS method to be taken as an alternative to the traditional gas chromatography for rapid determination of low concentration of trans fatty acids in oils.

FTIR，iPLS，trans fatty acid，oil，determination

TQ646.4

A

1003-0174(2016)10-0137-05

國家自然科學基金(31271887)，杭州市社會發展科研專項( 20140533B20)

2015-02-07

葉沁, 女，1989年出生,碩士，油脂分析檢測

孟祥河，男，1974年出生，教授，糧油深加工技術