粗糙脈孢菌固態發酵產纖維素酶工藝優化

周正東，李學如

(西南交通大學生命科學與工程學院，四川 成都 610031)

粗糙脈孢菌固態發酵產纖維素酶工藝優化

周正東，李學如

(西南交通大學生命科學與工程學院，四川 成都 610031)

從青儲飼料中分離得到一株產纖維素酶能力較強的絲狀真菌，經形態學和26S rDNA D1/D2區序列比對分析，確認該菌株屬粗糙脈孢菌(Neurosporacrassa)。通過單因素實驗和正交實驗探討了碳源、氮源、無機鹽、料水比、培養溫度、培養時間對菌株固態發酵產纖維素酶的影響。確定最適產酶工藝為：碳源麩皮與稻草稈的質量比6∶4、氮源3%(NH4)2SO4、料水比1∶1.5(g∶mL)、培養溫度30 ℃、培養時間60 h，無機鹽KH2PO4和MgSO4對產酶影響不顯著，在最適產酶工藝下，固態發酵產纖維素酶酶活達到251.27 U·g-1以上。

粗糙脈孢菌；纖維素酶；固態發酵

我國農作物秸稈年產量約9億t，且呈不斷增長態勢[1-2]。常規的焚燒、填埋返田以及堆肥等處理方法存在環境污染嚴重和利用率低等弊端[2]。農作物秸稈的主要成分為纖維素和半纖維素，利用微生物或其產生的纖維素酶可將秸稈中不能被大多數生物利用的木質纖維素降解為可利用的低分子糖，從而為農作物秸稈生物質能量轉化提供了一條有效途徑[3]。此外，以秸稈為原料通過微生物發酵所產纖維素酶在釀造工業、飲料加工業、紡織工業、飼料添加劑等領域有著很高的應用價值[4]。研究表明，許多絲狀真菌具有分泌纖維素酶和半纖維素酶的能力[5]，如粗糙脈孢菌產纖維素酶的能力與瑞氏木霉(Trichoderma)相近。林良才等[6]對粗糙脈孢菌降解木質纖維素的機制進行了較細致的分析。作者通過形態學和26S rDNA D1/D2區序列比對分析，對實驗室前期從青儲飼料中分離得到的一株產纖維素酶能力較強的絲狀真菌進行鑒定，并以農作物秸稈為原料對該菌株固態發酵產纖維素酶的工藝進行優化，以期為產纖維素酶的粗糙脈孢菌的進一步開發利用奠定基礎。

1 實驗

1.1 菌種與培養基

粗糙脈孢菌NCL，從青儲飼料中分離獲得。

PDA液體培養基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂15～20 g，自來水1 000 mL，自然pH值。

固態發酵培養基：250 mL三角瓶裝料10 g干基質。碳源(麩皮、稻草稈、玉米稈、玉米芯)、氮源(硫酸銨、酵母膏、蛋白胨)、料水比等根據實驗需求進行不同組合。

1.2 材料、試劑與儀器

麩皮、稻草稈、玉米稈和玉米芯等，采自成都溫江等地；稻草稈、玉米稈和玉米芯均烘干粉碎過20目篩。

真菌DNA提取試劑盒、PCR擴增試劑盒、PCR純化試劑盒等，Omega公司；四水合酒石酸鉀鈉、苯酚、無水亞硫酸鈉、一水檸檬酸、硫酸銨、硫酸鎂、磷酸二氫鉀等均為分析純。

3，5-二硝基水楊酸(DNS)試劑：稱取DNS 3.15 g，加水500 mL，攪拌3～5 s，水浴至45 ℃。逐步加入100 mL氫氧化鈉溶液(200 g·L-1)，不斷攪拌至溶液清澈透明。逐步加入四水合酒石酸鉀鈉91.0 g、苯酚2.5 g和無水亞硫酸鈉2.5 g，繼續45 ℃水浴加熱，同時補加水300 mL，不斷攪拌直至完全溶解。停止加熱，冷卻至室溫，用去離子水定容至1 000 mL。用燒結玻璃過濾器過濾，濾液儲存在棕色瓶中，避光保存。室溫下存放7 d后使用，有效期180 d。

檸檬酸鹽緩沖液(pH=5.5)：稱取一水檸檬酸10.5 g、氫氧化鈉5.0 g，加800 mL水溶解，調pH值至5.5，用去離子水定容至1 000 mL。

9902型PCR儀，美國Life Technologies公司；DYY-6C型電泳儀，北京六一儀器廠；GeneGenius型全自動凝膠成像分析系統，美國UVP公司；V-1100D型可見分光光度計，上海美譜達儀器有限公司；D3024R型高速冷凍離心機，美國賽洛捷克公司；ZHWY-2102C型恒溫搖床，上海智城分析儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株鑒定

形態學鑒定：在內置載玻片的PDA平板上接種一環粗糙脈孢菌，30 ℃培養3 d后取出載玻片，在顯微鏡下觀察菌落、菌絲及孢子的形態。

26S rDNA分子鑒定：參照文獻[7]稍做改進。將菌種接種于PDA液體培養基中，30 ℃搖瓶培養3 d，離心收集菌絲體，洗滌，加液氮研磨。按真菌DNA提取試劑盒操作步驟提取基因組DNA，用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測基因組DNA，然后用聚合酶鏈式反應(PCR)擴增26S rDNA的D1/D2區片段。PCR擴增的上游引物為：5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAA-GG-3′，下游引物為：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′。

PCR反應體系(50 μL)：DNA模板2 μL，PCR反應混合液25 μL，上下游引物各0.5 μL(10 μmol)，補加ddH2O到50 μL。PCR擴增條件：95 ℃預變性5 min；94 ℃變性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，共30個循環；72 ℃延伸5 min。

PCR擴增產物純化與測序：按照PCR純化試劑盒操作步驟純化PCR產物。PCR產物的測序委托上海生工生物工程技術服務有限公司完成。

序列比對及菌株的鑒定：輸入菌株26S rDNA的D1/D2區片段測序結果，在NCBI數據庫中進行同源性比對，鑒定菌株的種屬。

1.3.2 菌株固態發酵

按麩皮與稻草稈質量比6∶4在250 mL三角瓶中裝料10 g干基質，加入2% 硫酸銨、10 mL水，30 ℃培養24 h后扣瓶，繼續發酵培養2 d后，取出發酵產物，40 ℃過夜烘干。

通過單因素實驗和正交實驗探討碳源、氮源、無機鹽、料水比、培養溫度、培養時間對菌株固態發酵產纖維素酶的影響。

1.3.3 纖維素酶酶活的測定

葡萄糖標準曲線繪制：先用檸檬酸鹽緩沖液配制10 mg·mL-1的葡萄糖標準溶液，再稀釋成0.2 mg·mL-1、0.4 mg·mL-1、0.8 mg·mL-1、1.2 mg·mL-1、1.6 mg·mL-1、1.8 mg·mL-1、2.0 mg·mL-1系列葡萄糖標準溶液。分別吸取上述標準溶液各2.00 mL(2組平行)于刻度試管中，再分別加入2 mL水和2 mL DNS試劑，沸水浴5 min。自來水冷卻至室溫，用水定容至25 mL，測定540 nm處吸光度。以吸光度為橫坐標、對應葡萄糖標準溶液含葡萄糖的毫克數為縱坐標繪制標準曲線，擬合得到線性回歸方程：y=2.867x+0.080，R2=0.9980。

纖維素酶酶活測定：發酵結束，取樣，烘干，按NY/T 912-2004[8]測定發酵產物中纖維素酶酶活。

酶活力單位定義：將37 ℃、pH值為5.5下，4 mg·mL-1羧甲基纖維素鈉溶液每分鐘降解釋放1 μmol還原糖所需要的酶量定義為一個酶活力單位(U)。

2 結果與討論

2.1 產纖維素酶菌株的鑒定

從青儲飼料中分離得到一株產纖維素酶能力較強的絲狀真菌，其在PDA平板上生長3 d的形態如圖1所示。

菌落形態 菌絲及孢子形態(×200)

圖1 菌株在PDA平板上的生長形態

Fig.1 Morphological images of the strain on PDA plate

由圖1可知，菌株在PDA平板上呈擴散狀生長，菌絲為疏松網狀的長菌絲，在氣生菌絲的頂部形成分枝鏈，分生孢子呈橘黃色，成熟的孢子呈串珠狀排列(圖1b)。這些形態特征與魏景超[9]的《真菌鑒定手冊》和張妍妍等[10]描述的粗糙脈孢菌(Neurosporacrassa)形態相吻合。

將PCR擴增26S rDNA的 D1/D2區片段測序結果與NCBI數據庫中序列進行BLAST比對分析，發現該菌株與數據庫中的NeurosporacrassaEFB06相似度達100%。結合形態特征與26S rDNA分子鑒定，初步確認該菌株屬粗糙脈孢菌，將其命名為NCL。

2.2 固態發酵產纖維素酶工藝優化

2.2.1 碳源對產酶的影響

纖維素酶是一種誘導酶，在以農作物秸稈為培養基基質的發酵過程中，農作物秸稈既是纖維素酶生長的碳源同時又是纖維素酶產生的誘導物。4種不同碳源對菌株產酶的影響如表1所示。

表1 4種不同碳源對菌株產酶的影響/(U·g-1)

Tab.1 Effect of four different carbon sources on enzyme-production/(U·g-1)

碳源稻草稈麩皮玉米稈玉米芯酶活201.56220.75138.9437.58

由表1可知，以稻草稈或麩皮為碳源時，粗糙脈孢菌NCL的產酶效果較好。

進一步考察兩者質量比對菌株產酶的影響，結果見圖2。

圖2 麩皮與稻草稈的質量比對菌株產酶的影響

由圖2可知，最適麩皮與稻草稈質量比為6∶4。麩皮比例適當可以促進產酶，當比例超過60%后酶活反而有所降低。這可能是因為，麩皮比例過高時，其含有的可溶性糖較高反而抑制了纖維素酶的產生[11]。

2.2.2 料水比對產酶的影響

確定培養基麩皮與稻草稈質量比為6∶4后，考察不同料水比(g∶mL，下同)對菌株產酶的影響。結果發現，當料水比為1∶1、1∶1.5和1∶2時，菌株產纖維素酶酶活分別為229.11 U·g-1、237.72 U·g-1和219.43 U·g-1，在料水比為1∶1.5時酶活最高，但三者之間差異不顯著，表明粗糙脈孢菌NCL能在一個比較寬泛的料水比環境中產纖維素酶。因此，選擇最適料水比為1∶1.5。

2.2.3 氮源對產酶的影響

采用L9(34)正交實驗考察酵母膏、蛋白胨和硫酸銨3種氮源對菌株產酶的影響，結果見表2。進一步對實驗數據進行方差分析，結果見表3。

由表2可知，發酵培養基的合適氮源組合為：1%酵母膏，2%蛋白胨，3%硫酸銨。從表3可看出，3種氮源對產酶的影響程度為：硫酸銨>蛋白胨>酵母膏，其中硫酸銨的影響程度遠大于蛋白胨和酵母膏?？紤]到顯著性大小和實際生產成本，選取硫酸銨作為唯一氮源進行后續實驗。

2.2.4 無機鹽對產酶的影響

采用L9(34)正交實驗考察(NH4)2SO4、KH2PO4和MgSO4對菌株產酶的影響，結果見表4。

由表4可知，KH2PO4和MgSO4的極差(R)與空白極差相近，表明培養基中添加KH2PO4和MgSO4對產酶影響不大；培養基中添加3%或4%的(NH4)2SO4對產酶影響十分接近。因此，粗糙脈孢菌NCL在 3%(NH4)2SO4作唯一氮源的培養基中能獲得較好的產酶效果。

表2 氮源對產酶影響的正交實驗結果

Tab.2 Results of orthogonal experiment for the effect of nitrogen source on enzyme-production

編號酵母膏%蛋白胨%硫酸銨%空白列酶活U·g-11001-186.682012-204.603023-217.744102-212.165113-214.956121-206.197203-212.968211-194.249222-217.74k1203.01203.93195.70206.46k2211.10204.60211.50207.92k3208.31213.89215.22208.05R8.099.9619.521.59

表3 方差分析

Tab.3 Variance analysis of orthogonal experiment

因素偏差平方和自由度F比顯著性酵母膏101.43221.69*蛋白胨185.94239.76*硫酸銨644.122137.72**誤差4.682

注:F0.05(2,2)=19.00，F0.01(2，2)=99.00；*表示具有顯著性；**表示具有極顯著性。

2.2.5 培養溫度對產酶的影響(表5)

表5 培養溫度對產酶的影響

Tab.5 Effect of culture temperature on enzyme-production

溫度/℃263034酶活/(U·g-1)211.36242.17243.88

由表5可知，26 ℃培養時酶活最低，30 ℃和34 ℃培養時酶活較為接近。因此，選擇最適培養溫度為30 ℃。

2.2.6 培養時間對產酶的影響

按麩皮與稻草稈質量比6∶4裝料10 g干基質，加入3%(NH4)2SO4、15 mL水，在30 ℃下考察培養時間對菌株產酶的影響，結果見圖3。

由圖3可知，前24 h，酶活一直處于較低水平；24～36 h，酶活呈指數急速上升，這是因為，一方面菌絲體開始旺盛生長，另一方面是培養12 h后扣瓶使得發酵物的通氣情況得到改善；60 h后，酶活趨于穩定。因此，選擇最適培養時間為60 h。

表4 無機鹽對產酶影響的正交實驗結果

Tab.4 Results of orthogonal experiment for the effect of inorganic salt on enzyme-production

圖3 培養時間對產酶的影響

2.3 菌株最適產酶工藝驗證

在最適產酶工藝[麩皮與稻草稈質量比為6∶4、250 mL三角瓶裝料10 g干基質、加入3%(NH4)2SO4作為氮源、添加15 mL水使料水比為1∶1.5、30 ℃培養60 h]下進行5批次粗糙脈孢菌NCL固態發酵產酶驗證實驗，發酵產物纖維素酶酶活都穩定在251.27 U·g-1以上。表明，本實驗所得最適產酶工藝可行。

3 結論

經形態學和26S rDNA D1/D2區序列比對分析，確認從青儲飼料中分離得到的一株產纖維素酶能力較強的絲狀真菌屬粗糙脈孢菌(Neurosporacrassa)。該菌產纖維素酶的最適工藝為：碳源麩皮與稻草稈質量比6∶4，氮源3%(NH4)2SO4、料水比1∶1.5(g∶mL)、培養溫度30 ℃、培養時間60 h，在此工藝下，菌株產纖維素酶酶活達251.27 U·g-1以上。

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Optimization on Cellulase Production with Neurospora crassa by Solid-State Fermentation

ZHOU Zheng-dong，LI Xue-ru

(SchoolofLifeScienceandEngineering,SouthwestJiaotongUniversity,Chengdu610031,China)

A mycelial fungus with strong ability of producing cellulase was screened from ensilage and identified asNeurosporacrassaby the analysis of morphology and 26S rDNA D1/D2 sequence alignment.The effects of factors on producing cellulase withNeurosporacrassaby solid-state fermentation were investigated by a single factor experiment and an orthogonal experiment.The optimal fermentation conditions were as follows:the mass ratio of wheat bran to rice straw was 6∶4,nitrogen source was 3%(NH4)2SO4,material-water ratio was 1∶1.5(g∶mL),culture temperature was 30 ℃,culture time was 60 h,inorganic salt KH2PO4and MgSO4had no significant effect on cellulase production.The enzyme activity of produced cellulase reached up to above 251.27 U·g-1under above optimal conditions.

Neurosporacrassa;cellulase;solid-state fermentation

四川省科技支撐計劃資助項目(2012FZ0048)

2016-06-22

周正東(1993-)，男，湖南龍山人，碩士研究生，研究方向：微生物技術，E-mail：1016992297@qq.com；通訊作者：李學如，教授，E-mail：xueruli@sina.com。

10.3969/j.issn.1672-5425.2016.12.008

周正東，李學如.粗糙脈孢菌固態發酵產纖維素酶工藝優化[J].化學與生物工程，2016，33(12)：38-41，47.

TQ 352.78 TQ 920.1

A

1672-5425(2016)12-0038-04