基于分子對接技術研究漆酶與介質間的結合模式與相互作用機制

陶國翔，李愛秀，封加棟，張 敏，戰 麗

(1.武警后勤學院基礎部藥物設計實驗室，天津 300309；2.武警后勤學院科研部，天津 300309；3.武警后勤學院訓練部，天津 300309)

基于分子對接技術研究漆酶與介質間的結合模式與相互作用機制

陶國翔1，李愛秀1，封加棟1，張 敏2，戰 麗3

(1.武警后勤學院基礎部藥物設計實驗室，天津 300309；2.武警后勤學院科研部，天津 300309；3.武警后勤學院訓練部，天津 300309)

為深入研究漆酶-介質體系中漆酶與介質間的相互作用，基于分子對接技術計算模擬了變色栓菌漆酶與5種典型介質之間的結合模式，并在分子水平闡明了漆酶與介質的相互作用機制。結果表明，漆酶活性位點的Leu164、Asn264、Phe265、Gly392、Ala393、Ile455等氨基酸殘基與介質發生疏水作用，Asp206與介質中的羥基發生氫鍵作用；漆酶與介質作用時His458遠離了T1Cu，對漆酶氧化電勢的提高具有較大貢獻。為漆酶與介質結構的進一步改造以及從天然資源中挖掘新介質提供了理論指導。

漆酶；介質；漆酶-介質體系；分子對接；結合模式；相互作用機制

漆酶(laccase，EC1.10.3.2)是一種多銅氧化酶，根據其來源不同可分為昆蟲漆酶、植物漆酶、細菌漆酶和真菌漆酶[1]。真菌是漆酶最重要的來源，來源于變色栓菌(Trametesversicolor)的真菌漆酶具有易得、產量高的優勢，因此變色栓菌一直被作為生產漆酶的真菌[2]。漆酶的特征底物為酚類和芳胺類，通過銅離子與底物之間的電子傳遞實現對底物的催化氧化作用，其催化氧化機制如圖1所示。

圖1 漆酶活性位點的催化氧化機制

由于漆酶在催化氧化過程中副產物只有水，所以具有極高的環保價值，被稱為“綠色催化劑”[3]。研究發現，在催化體系中加入一種小分子介質(mediator)，與漆酶共同構成漆酶-介質體系(laccase-mediator system，LMS)，漆酶的催化氧化能力會顯著提升[4]。在LMS中，介質主要通過間接提高漆酶的氧化電勢和減少漆酶與底物之間的空間阻礙等方式提高電子傳遞效率[5]。一是介質首先被漆酶氧化生成具有較高氧化電勢的介質中間體，介質中間體再與底物反應，這樣就間接提高了漆酶的氧化電勢；二是底物不必直接結合到漆酶的活性位點，而讓介質充當漆酶與底物之間的“電子梭”，克服了某些底物與漆酶活性位點空間匹配性不佳的問題。LMS的建立提高了催化效率、擴大了底物范圍、拓寬了應用領域。例如：LMS用于催化氧化木質素降解，為實現木質素的高值化利用邁出了重要一步[6]；LMS可有效催化降解工業廢水中的多環芳烴、酚類等有毒物質，降低工業廢水的化學耗氧量、生物耗氧量和色度等[7]；LMS還可降解土壤中的殘留農藥[8](如毒死蜱、滴滴涕等)和抗生素[9](如磺胺地托辛)等。由此可見，LMS的應用有利于循環經濟的開展和綠色化學的推廣，具有極高的社會和環保意義。但是由于目前常用的介質成本較高、穩定性較差以及具有一定毒性和刺激性等因素[10]，影響了LMS的進一步應用。作者基于分子對接技術，從已知變色栓菌漆酶復合物的晶體結構出發，從分子水平揭示漆酶與常見介質之間的結合模式和可能的相互作用機制，擬為新介質的發現和現有介質的合理改造奠定理論基礎。

1 實驗

1.1 技術平臺

所有計算均利用分子模擬與分子設計軟件包MOE 2009在計算機上完成。

1.2 漆酶和介質結構

實驗用漆酶是變色栓菌漆酶與2,5-二甲基苯胺的復合物，蛋白數據庫(PDB)編號為1KYA。文獻報道1KYA中漆酶活性位點由Phe162、Leu164、Asp206、Asn264、Phe265、Phe332、Phe337、Pro391、Gly392、Ala393、Ile455和His458等氨基酸組成[11]。

介質為文獻報道的3個天然介質和2個人工合成介質[5，12-13]，天然介質為丁香酸甲酯、乙酰丁香酮、乙酰香草酮，人工合成介質為N-羥基苯并三唑(HBT)和N-羥基乙酰苯胺(NHA)，其化學結構式如圖2所示。

圖2 介質的化學結構式

1.3 分子對接

分子對接是將小分子介質放置于漆酶活性位點處，并尋找合適的取向和構象，使介質與漆酶的形狀和相互作用匹配最佳。

1.3.1 分子對接模型的建立

為保證分子對接的可靠性，首先建立了分子對接模型。將1KYA中的配體(2,5-二甲基苯胺)抽提出來作為初始構象，嘗試不同的對接參數，再將2,5-二甲基苯胺對接回漆酶活性位點，根據對接前后2,5-二甲基苯胺在活性位點中的位置及其與氨基酸殘基的相互作用關系，判斷參數設置的合理性以及MOE 2009軟件包研究漆酶與介質相互作用的適用性。

將1KYA導入MOE 2009，刪除其雜原子、溶劑分子、2,5-二甲基苯胺等，保留漆酶A鏈，在Amber99力場下，利用Protonate 3D模塊，在pH=5.0、溫度300 K條件下對漆酶加氫加電荷。之后設置力場為MMFF94x，利用MOE-Dock模塊將介質與漆酶活性位點對接，參數設置如下：Placement：Triangle Mather；Rescoring1：London dG；Refinement:Forcefield。對接完成后，選取合適的介質和以漆酶活性位點為中心、半徑5 ?范圍內的氨基酸殘基，其余部分固定，在MMFF94x力場下進行能量優化[14]。

1.3.2 介質與漆酶的對接

介質結構首先由MOE 2009軟件包中Builder模塊繪制，然后以1KYA中配體2,5-二甲基苯胺的構象為模板，利用Flexible alignment模塊分別將5種介質與之疊合，選擇最佳的疊合構象作為介質對接的初始構象。采用已建立的分子對接模型將介質對接到漆酶活性位點。根據對接結果的評分大小、氫鍵作用和關鍵氨基酸殘基的疏水作用等確定最佳對接結果。

2 結果與討論

2.1 分子對接模型的建立與評價

2.1.1 1KYA中漆酶活性位點與2,5-二甲基苯胺的結合模式(圖3)

漆酶表面的Ⅰ型Cu(T1Cu)是電子的初級接受位點，在T1Cu中心形成一個由若干氨基酸殘基構成的活性位點。由圖3可知，在1KYA中2,5-二甲基苯胺占據了漆酶的活性空腔，2,5-二甲基苯胺的氨基與His458形成氫鍵，His458作為電子入口與T1Cu配位，把接受的電子傳遞給T1Cu。漆酶活性位點的Phe162、Leu164、Phe265、Pro391、Gly392與2,5-二甲基苯胺發生疏水作用[11]。

2.1.2 分子對接后1KYA中漆酶活性位點與2,5-二甲基苯胺的結合模式(圖4)

將1KYA中2,5-二甲基苯胺取出后，再對接回漆酶活性位點處，2,5-二甲基苯胺上的氨基與His458之間存在氫鍵作用，2,5-二甲基苯胺與Phe162、Leu164、Phe265、Pro391、Gly392存在疏水作用。對接結果從2,5-二甲基苯胺的結合位置氫鍵作用以及與關鍵氨基酸殘基的疏水作用等方面較好地重現了復合物中漆酶活性位點與2,5-二甲基苯胺的結合特點，表明利用以上參數在MOE-Dock模塊下建立的分子對接模型是可靠的。

圖3 1KYA中漆酶活性位點與2,5-二甲基苯胺的結合模式

圖4 分子對接后1KYA中漆酶活性位點與2,5-二甲基苯胺的結合模式

Fig.4 Binding mode of laccase active site and 2,5-dimethylaniline in 1KYA after molecular docking

2.2 介質與漆酶對接結果

2.2.1 漆酶活性位點與介質的結合模式

采用建立的分子對接模型，將介質與漆酶活性位點對接，得到漆酶活性位點與介質的結合模式，如圖5所示。

丁香酸甲酯 乙酰丁香酮 乙酰香草酮 HBT

NHA

圖5 漆酶活性位點與介質的結合模式

Fig.5 Binding mode of laccase active site and mediators

由圖5可知，4個loop環勾勒出活性位點的輪廓，5種介質均能較好地結合在漆酶活性位點，被疏水氨基酸殘基包圍，介質的羥基深入到了活性位點內部的極性區。

2.2.2 漆酶活性位點氨基酸殘基與介質相互作用的2D示意圖(圖6)

圖6 漆酶活性位點氨基酸殘基與介質相互作用的2D示意圖

由圖6可知，與介質發生相互作用的氨基酸包括1個酸性氨基酸Asp206、1個堿性氨基酸His458和若干中性氨基酸Leu164、Asn264、Phe265、Gly392、Ala393、Ile455。與介質發生疏水作用的氨基酸分別位于3個loop環上，分別為Leu164，Asn264、Phe265和Gly392、Ala393，其中Leu164和Gly392、Ala393分別位于活性位點兩側，構成進入活性位點的入口。酸性氨基酸Asp206與介質中的羥基發生氫鍵作用，Phe265的苯環與介質中的苯環平行，發生π-π相互作用，Asn264與丁香酸甲酯和乙酰丁香酮的甲氧基的氧原子發生氫鍵作用。

2.2.3 Asp206與羥基及His458與T1Cu的距離(表1)

表1 Asp206與羥基及His458與T1Cu的距離/?

Tab.1 Distance of Asp206-hydroxyl and His458-T1Cu/?

介質Asp206與羥基距離His458與T1Cu距離2,5二甲基苯胺-2.23丁香酸甲酯1.274.16乙酰丁香酮1.254.37乙酰香草酮1.334.68HBT1.274.47NHA1.284.52

注:1KYA晶體結構中2,5-二甲基苯胺的氨基與Asp206之間的距離為3.20 ?。

介質的羥基與1KYA中2,5-二甲基苯胺的氨基均可傳遞質子給Asp206。由表1可知，對接結果經能量優化后，介質中的羥基與Asp206的距離較1KYA中2,5-二甲基苯胺的氨基與Asp206的距離有顯著差異；此外，介質與漆酶活性位點對接結果中His458均遠離了T1Cu。

2.2.4 LMS質子轉移機制

以上結果與文獻報道的LMS中介質的質子轉移機制相符，即漆酶首先與介質反應，介質失去氫形成含氮氧自由基或苯氧自由基的活性中間體(圖7)，活性中間體從活性位點脫離再與底物反應，奪取底物的氫，從而引發一系列非酶促反應導致底物的降解[15-16]。

圖7 LMS質子轉移機制

據文獻報道，活性位點中的酸性氨基酸Asp206在真菌漆酶中高度保守，與漆酶底物的pH值依賴性有關，當pH值為弱酸性時，Asp206的羧基發生解離，活性位點帶上負電荷，有利于與含羥基或氨基取代基的底物結合[11]。Asp206作為質子受體可接受來自介質的質子，介質羥基與Asp206之間的氫鍵作用有利于質子的傳遞。在1KYA中2,5-二甲基苯胺的氨基與Asp206之間距離為3.20 ?，在介質與漆酶的對接結果中，氫鍵距離為1.25～1.33 ?，氫鍵距離的縮短有利于質子傳遞。

介質在傳遞質子的同時發生電子轉移，堿性氨基酸His458具有接受電子的能力，與Asp206通過質子與電子的接受保持體系pH值平衡。His458作為電子受體，將接受的電子再傳遞給T1Cu。His458與T1Cu的距離會對漆酶的氧化電勢產生影響，在對接結果中發現，漆酶活性位點與介質作用時，活性位點的氨基酸構象會發生改變，His458均不同程度遠離了T1Cu。當His458遠離T1Cu時，His458對T1Cu的電子貢獻降低，T1Cu表現出更多“缺電子特性”，導致氧化電勢升高。Leu164、Gly392、Ala393、Ile455與介質間的疏水作用使介質較好地結合在漆酶活性位點，Phe265與介質苯環之間的π-π相互作用、Asn264與甲氧基的氫鍵作用有利于介質構象的穩定。

3 結論

基于分子對接技術研究了漆酶活性位點與5種常見介質的結合模式，漆酶活性位點氨基酸與介質相互作用的關鍵在于酸性氨基酸Asp206與介質發生氫鍵作用，對介質中間體的生成有重要作用。酸性氨基酸Asp206可作為質子受體，介質將質子傳遞給Asp206形成介質中間體；His458作為電子受體，與Asp206共同維持體系pH值平衡。Leu164、Asn264、Phe265、Gly392、Ala393、Ile455與介質發生疏水作用，其中Phe265還會與介質中苯環發生π-π相互作用，達到穩定介質構象的目的。在漆酶與介質相互作用過程中，漆酶活性位點某些氨基酸構象發生變化，其中His458遠離T1Cu，導致漆酶的氧化電勢升高。本研究在分子水平深入闡明了漆酶與介質之間的相互作用機制，為新介質的發現和現有介質的合理改造提供了重要的理論依據。

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Binding Mode and Interaction Mechanism of Laccase and Mediator Based on Molecular Docking Technique

TAO Guo-xiang1,LI Ai-xiu1,FENG Jia-dong1,ZHANG Min2,ZHAN Li3

(1.DrugDesignLaboratoryoftheBasicScienceDepartment,LogisticsUniversityofChinesePeople′sArmedPoliceForce,Tianjin300309,China;2.ScientificResearchDepartment,LogisticsUniversityofChinesePeople′sArmedPoliceForce,Tianjin300309,China;3.TrainingDepartment,LogisticsUniversityofChinesePeople′sArmedPoliceForce,Tianjin300309,China)

To discuss and reveal the interaction between laccase and mediator in laccase-mediator system,the binding mode of laccase fromTrametesversicolorand 5 kinds of typical mediators was simulated based on a molecular docking technique,the interaction mechanism of laccase and mediators was explained at a molecular level.Results indicated that,amino acid residues Leu164,Asn264,Phe265,Gly392,Ala393,Ile455 were bound with the mediators at laccase active site by hydrophobic force,and Asp206 was bound with the hydroxyl of mediator by hydrogen bond.At the same time,amino acid residues His458 stood off T1Cu,and this might contribute to increase the oxidation potential of laccase.This study provides foundations for further structure design of laccase and mediator,and finding new mediators from natural resources.

laccase;mediator;laccase-mediator system;molecular docking;binding mode;interaction mechanism

武警后勤項目(WJHQ2012-14)，武警后勤學院重點項目(WHZ201201)

2016-07-04

陶國翔(1991-)，男，河北南宮人，碩士研究生，研究方向：計算機輔助藥物設計，E-mail：taoguoxiang91@126.com；通訊作者：李愛秀，教授，E-mail：liaixiu2006@126.com。

10.3969/j.issn.1672-5425.2016.12.009

陶國翔，李愛秀，封加棟，等.基于分子對接技術研究漆酶與介質間的結合模式與相互作用機制[J].化學與生物工程，2016，33(12)：42-47.

O 641 Q 814.9

A

1672-5425(2016)12-0042-06