單核苷酸多態性在人類基因組學發展中的應用

蔣刈戴樸韓東一

1中國人民解放軍總醫院耳鼻咽喉頭頸外科（北京100853）

2福建醫科大學省立臨床醫學系、福建省立醫院耳鼻咽喉科（福州350001）

·綜述·

單核苷酸多態性在人類基因組學發展中的應用

蔣刈1，2戴樸1韓東一1

1中國人民解放軍總醫院耳鼻咽喉頭頸外科（北京100853）

2福建醫科大學省立臨床醫學系、福建省立醫院耳鼻咽喉科（福州350001）

第三代基因組遺傳標記的單核苷酸多態性（SNP）目前是與分子標記有關領域研究的焦點。通過連鎖分析或關聯研究方法，單核苷酸多態性應用于生物的起源、進化及遷移等群體遺傳學研究、疾病相關致病或易感基因研究和個體化藥物治療等諸多領域。隨著檢測和分析技術的進一步發展，SNPs作為生物信息學研究的一個熱點，將成為人類基因組研究計劃走向實際應用的重要步驟。

單核苷酸多態性；基因組學；連鎖分析；關聯分析

Thiswork was supported by National Key Research and Development Program of China(2016YFC1000700,2016YFC1000704), State Key Program of NationalNatural Science Foundation of China(81230020),Fujian Medical Innovation Project(2016-CX-5).

Theauthorshave declared thatno competing interestsexist.

1 SNPs基本特性

SNPs作為第三代遺傳標記，被廣泛應用于生物的起源、進化及遷移等群體遺傳學研究、疾病相關致病或易感基因研究和個體化藥物治療等諸多領域，成為與分子標記有關的各領域研究焦點，與其基本特性密切相關：

1.1高密度：人類基因組中平均每500～1000個堿基對中存在1個SNP，截至2016年11月07日，db?SNP數據庫已列出人類的4,578,850個單核苷酸多態性位點，其廣泛存在能夠為任何一種待研究的目的基因提供一系列標記以進行分析[11，12]。

1.2高保守：與STRs等多態性標記相比，SNPs具有更高的遺傳穩定性。STR的突變率為10-3[13]，特別是帶有較長重復結構的STR更不穩定，SNPs的突變率很低，大約是10-8[14]，遠低于STR的突變率。按照基因中SNPs的位置，可分為基因編碼區SNPs（Coding-region SNPs，cSNPs）、基因周邊SNPs（Peri?genic SNPs，pSNPs）以及基因間SNPs（Intergenic SNPs，iSNPs）等三類。大多數SNPs對個體的表型沒有影響：比如位于基因組非編碼區的SNPs；或者有些SNPs雖然位于基因組編碼區，但是其堿基改變并不影響翻譯后氨基酸的表達和蛋白結構。部分SNPs對個體有不同程度影響：比如位于基因啟動子中的SNPs，其堿基改變會導致基因轉錄活性的改變，增加或者減少蛋白表達量，從而影響其生物學活性；部分位于蛋白質編碼區的SNPs，翻譯后改變關鍵功能區域的氨基酸序列，從而影響蛋白質的空間結構和功能，最終導致特定環境或條件下疾病的發生[15]。

1.3易分型：SNPs是二等位基因（biallelic），一般只由兩種堿基組成。SNPs表現的單個堿基的變異可由單個堿基的轉換（transition）或顛換（transversion）引起，通常不包括堿基的插入和缺失[16]。在基因組篩選中SNP往往只需+/-的分析，易于基因分型及等位基因頻率計算，同時也利于自動化快速檢測。

2 SNPs遺傳分析方法

遺傳學統計方法中最常用方法有兩種：連鎖分析和關聯研究[17]，兩者均是以分析致病基因與相鄰堿基變異共分離為目的，通過在同一條染色體上設計系列SNPs作為待檢測標記，研究潛在致病基因與系列SNPs之間的關系，來判斷系列SNPs是否一起與潛在致病基因由父代遺傳給子代。在一條染色體區域中，系列相關聯的SNPs集合形成一個單倍型（Haplotype）。

2.1連鎖分析

在各方的努力下，水科學方面的工作在中國漸見雛形。這主要得益于一批德高望重的科學家的支持，我很感動。由于這是很前沿的研究，發達國家都還沒有重大計劃，所以我們無法參照，缺乏可借鑒的經驗，需要自己一步步探索。水科學對中國的意義又特別重大，因此早晚會成為一個主流科學，這已成為這個領域更多研究者的共識。

連鎖分析（Linkage analysis）方法：是家系遺傳學研究的一種方法，以連鎖原理為基礎，通過鑒定一個家系中經多代傳遞后仍存在的同一染色體上系列遺傳標記（SNPs），檢測在這個家系中系列遺傳標記與疾病的傳遞是否相關。連鎖分析特別適合于單基因疾病的遺傳研究，應用于復雜疾病的研究還有很大局限性。

2.2關聯研究

關聯研究（Association analysis）方法：是群體遺傳學分析方法的一種，以重組和連鎖不平衡為基礎，用于檢測無親緣關系群體中，某種疾病和待檢測標記（SNP）的相關性的研究方法[18]。理論上，在隨機交配的群體中，疾病基因的相關基因片段區域非常小，通過多代的傳遞，重組可能使突變與最初單倍型中的SNPs分離開，部分SNPs與突變組成新的單倍型傳遞很多代，這種SNPs與突變形成的非隨機關聯就是連鎖不平衡。連鎖不平衡相對于連鎖分析更易檢出相對風險率小于5.0%的微效基因，相比于單基因遺傳模式更適合于多基因遺傳模式遺傳研究。為了避免人群混雜和基因重組對統計分析的影響，關聯研究需要在正確的群體分層的條件下，選取與目的基因距離1CM遺傳單位內一定等位基因頻率的系列SNPs，進行顯著性差異的統計學分析。SNPs與疾病關聯的原因有兩種：一是致病基因與SNPs存在很強的連鎖不平衡；另一原因是SNPs本身與疾病的發生有關。

3 SNPs檢測方法

SNPs的檢測技術主要劃分為傳統經典檢測時代和高通量檢測時代[19]。傳統經典檢測技術主要是基于單鏈或者雙鏈結構構象改變進行凝膠電泳檢測的技術，包括限制性酶切片段長度多態性分析(RFLP)、等位基因特異聚合酶鏈反應分析(AS-PCR)、單鏈構象多態性分析(SSCP)、變性梯度凝膠電泳分析(DGGE)等，這些技術不能進行自動化檢測，只能進行小規模的SNP分型測試，目前已不作為常規檢測方法。高通量SNP分型技術已廣泛運用于臨床及科研[20-23]，按其技術原理可分為：基于熒光共振能量轉移(Fluorescence resonance energy trans?fer,FRET)（例如Taqman），基于DNA聚合酶的微測序引物延伸法（例如SNaPshot、Mass Array），基于核酸雜交（例如基因芯片、高分辨率熔解曲線分析（HRM）法），基于結構構象（例如HRM）等。以下對這些技術特點進行分別描述：

3.1實時熒光PCR分析法（TaqMan探針法）

針對染色體上的不同SNP位點設計相應PCR引物和熒光TaqMan探針，探針的5’-端和3’-端分別標記一個報告熒光基團和一個淬滅熒光基團。在PCR擴增中，與靶序列完全匹配的探針被核酸外切酶切割，從探針上切割下來5’-端報告基團遠離淬滅基團，釋放熒光信號，利用多通道熒光PCR儀進行檢測，可以判讀SNP的基因型。通常用于少量SNP位點分析，因設計探針捕獲已知SNP，不能同時發現未知位點信息。

3.2 SNaPshot法

該技術基于單堿基延伸原理。設計5’-端堿基緊挨SNPs位點的引物，通過多重PCR反應體系擴增獲得帶有SNPs位點的PCR產物，在DNA聚合酶、四種熒光標記標記ddNTP和PCR產物模板的反應體系中，進行單個堿基延伸。通過單堿基延伸擴增后產生帶有熒光標記的產物，經測序儀檢測后，根據熒光的顏色可判讀SNPs堿基種類，確定其基因型。通常用于10-30個SNPs位點分析。

3.3飛行時間質譜（MALDI-TOF）和MassArray法

質譜分析法主要是通過對樣品的離子質荷比進行分析從而實現對樣品定性和定量的檢測方法。飛行時間質譜（MALDI-TOF）技術是在真空管中對待測樣本與芯片基質共結晶體進行瞬時納秒(10-9s)強激光激發，待測樣本的核酸分子解吸附成為單電荷離子，其在電場中飛行時間與離子質量成反比，通過檢測核酸分子在真空管中的飛行時間可以獲得待測樣本精確分子量，該檢測方法檢測通量大、周期短、靈活性強，性價比高。

MassArray分子量陣列技術將基質輔助激光吸收/離子飛行時間(MALDI-TOF)質譜分析與單堿基延伸技術相結合，首先通過PCR擴增出含有SNPs位點的一段DNA序列，用SAP酶純化，單堿基延伸引物延伸，探針在SNPs位點處僅延伸一個堿基。同時用基質輔助激光解析電離飛行時間質譜(MALDI-TOFMS)檢測延伸產物與未延伸引物間的分子量差異，確定該點處堿基?；贛assArray平臺的技術可以設計最高達40重的PCR反應，可以根據需求個性化設計SNPs位點，完成批量樣本的同時檢測，實驗設計靈活，基因型檢測結果準確性高。

3.4高分辨率熔解曲線分析（HRM）法

基于每條DNA序列都有其特定的熔解曲線和熔解溫度原理，實時監測升溫過程中雙鏈DNA解鏈成單鏈DNA分子、熒光染料與雙鏈DNA脫離時檢測體系內的熒光信號。熒光信號值隨著溫度變化形成由強到弱的溶解曲線。不同片段大小及堿基序列的DNA形成獨特的熔解曲線外形。SNP位點的雜合狀態或者甲基化程度等都會影響熔解溫度和溶解曲線，能夠有效區分不同SNP位點基因型。同時該檢測方法無需設計特異性探針，在PCR結束后直接運行HRM完成樣品基因型的分析，操作簡便、快速，成本低，結果準確，并且因真正的閉管操作避免污染，能同時檢測擴增區域已知和未知的SNP。但是這類技術需要特殊檢測儀器和染料，檢測條件優化過程復雜。

3.5基因芯片

基因芯片是基于核酸分子雜交原理，在小面積固相載體內按照位置預設核酸分子所組成的微點陣列。在一定條件下，標記后的樣品核酸片段與固相載體上預設的核酸分子雜交，能在專用的芯片閱讀儀上檢測到雜交信號?；蛐酒饕晒押塑账嵝酒蚦DNA芯片兩大類組成。目前用于分析單核苷酸多態性研究的基因芯片多是基于特異性寡核苷酸雜交設計的芯片，根據需求將數十萬甚至上百萬個特異性寡核苷酸探針原位合成固定于芯片基片上，將PCR擴增并標識的待檢測目標DNA混合物與探針雜交，可同時完成檢測。比如Illumina公司的Infinium全基因組SNP芯片[24]包括4種產品：Human1M-Duo、Hu?man660W-Quad、HumanCytoSNP-12和HumanEx?on510S-Duo。它們分別包含了1.1M、658K、300K和510K個標簽SNP。Human1M-duo芯片包含超過110萬個標簽SNP并且可以同時檢測兩個樣品，平均檢出率和重復性超過99%。HumanCytoSNP-12芯片能同時檢測12個樣品。Affymetrix公司設計的全基因組SNPArray6.0[25]，在一張芯片上可以分析一個樣品的906,600個SNPs，同時含946,000個CNV探針?；蛐酒哂懈咄?、高效性，但是此類芯片適用于全基因組SNP掃描，價格昂貴，不適用于單基因SNP檢測。

4 SNPs檢測用途

4.1 SNPs與疾病

SNPs與疾病研究的方式主要有兩種，一種主要通過比對健康和患病人群或者比較高危與低發人群SNPs發生頻率的差異，發現疾病相關基因。比如，全基因組關聯研究（Genome-Wide Association Studies，GWAS）[26-27]，通過應用全基因組范圍高密度遺傳標記（SNP或CNV）檢測芯片對大規模人群樣本DNA進行分型檢測,用關聯分析的方法來定位一系列疾病的主要致病基因與SNPs之間的相關性，已在癌癥、糖尿病、高血壓、傳染性疾?。ò滩?，麻風病，肝炎等）、自身免疫病、神經精神病、憂郁癥和哮喘等疾病中找到多個疾病相關易感基因[28-34]。另一種是通過研究SNP與疾病預后相關位點的關聯性，特別是影響腫瘤發生轉移的代謝通路、信號通路等中某些關鍵基因的相關性，來研究疾病或腫瘤預后。通過基因易感性的分析，對疾病的預后進行評估，為個體化治療提供理論支持[35-38]。

SNPs的疾病研究方法也運用在耳聾研究中，早期的研究主要集中在常見耳聾基因熱點突變始祖效應研究[38-42]，近年來文獻報道主要集中在通過高通量檢測技術發現老年聾、突發性耳聾和噪聲性耳聾等疾病的遺傳危險因素[43-47]：可以通過GWAS進行人群分層檢測發現特異性SNPs，如Hoffmann等運用GWAS對非西班牙裔白人、拉丁美洲人、東亞和非洲裔美國人四組人群的老年聾患者與正常對照人群研究，發現與非西班牙裔白人人群中老年性耳聾特異性的SNPs位點，可能與其老年聾發生相關[43]；也可以通過設計已知基因的關聯SNPs發現可能的致病基因，如Ryosuke等人設計了192個基因的相關SNPs檢測192例突發性耳聾患者，分析發現日本突發性耳聾的可能關聯的SNP為SOD1 rs4998557[44]?？傊?，SNPs檢測廣泛運用在耳聾基因定位、相關致病基因關聯性和遺傳危險因素的研究中[45-46]。

4.2 SNPs與藥物代謝

藥物代謝酶（Drug metabolizing enzymes, DMEs）和藥物作用靶點基因特性的變化可影響藥物的體內濃度和靶組織對藥物的敏感性，導致個體對藥物反應性（包括藥物的療效和不良反應發生）存在差異。目前，個體化用藥分子檢測項目包括藥物代謝酶與轉運體基因遺傳多態性檢測、藥物作用靶點基因遺傳變異檢測、其他基因變異檢測和藥物作用靶點基因mRNA表達檢測四種類型。其中，藥物基因組生物標志物的檢測，比如SNPs，將有助于了解在不同遺傳變異個體中的藥物（代謝）動力學差異，是臨床實施個體化藥物治療的前提。細胞色素P450(Cytochrome P450,CYP)是人體中最重要的藥物代謝酶，CYP2D6和CYP2C19與藥物代謝的個體差異關聯性最大。目前國家衛計委認可的藥物代謝酶多態性檢測項目包括CYP2D6、CYP2C19、CYP2C9、ADCB1等15個基因[48-51]。

4.3 SNPs與生殖醫學

因SNPs在世代中的數量及遺傳穩定，對表型沒有影響的SNPs在全基因組關聯研究中也仍然有用。在胚胎植入前遺傳學診斷（Preimplantation ge?netic diagnosis，PGD）中設定與致病基因緊密連鎖的SNPs，通過分析親代和子代連鎖的SNPs可追蹤染色體的親本來源，可最大限度地監測并消除擴增過程中位點丟失（Allelic drop-out，ADO）對診斷的影響，同一染色體上的系列SNP位點和致病基因位點同時發生ADO的概率比單一位點的ADO概率低得多[52]，也可用于單親源性二倍體的檢測。在PGD實踐中，也可以運用微陣列單核苷酸多態技術（SN?Parray），全面檢測染色體組的數目異常和結構異常，除了已知的染色體CNVs外，還能檢測出更小片段的缺失和重復[53-54]。

4.4 SNPs與遺傳分析

在群體進化研究及親緣關系的法醫學檢測中，STRs檢測被認為是金標準[55]。雖然SNPs突變率遠低于STRs，同樣適用于連鎖分析的親緣關系鑒定和關聯分析的群體遺傳學。然而，單個SNP提供的遺傳信息尚不能滿足分析的需要，在批量樣品檢測中，對3-4個SNPs結果綜合分析相當于1個STR基因座檢測結果，需要設計50-60個互不連鎖的SNPs進行聯合分析，以提高單次檢測的信息量和個體識別能力，滿足檢驗鑒定要求[56-57]。因此SNPs多用作STRs檢測的補充[55]。

5 SNPs數據庫

SNPs公共數據庫主要有美國的NCBI數據庫(dbSNP)(Database of Single Nuleotide Polymor?phisms)[58]、歐洲SNP數據庫(HGVbase)(Human Ge?nome Variation Database)[59]、美國麻省理工MIT數據庫[60]和日本JST數據庫（The Union of Japanese Sci?ence and Technology Corporation）[61]，這些數據庫主要收集文獻報道的SNPs的研究數據，均可以通過網站查詢使用說明。然而既往關于中國SNPs的大部分研究，均存在檢測樣本量小或者SNPs位點少的短板，不能全面地反映中國人群基因組變異的情況，國際公共數據庫中與中國人相關SNPs信息亦不全面，隨著人類基因組單倍體型圖（Haplotype map,Hapmap）計劃網站的停用，主要的中國人群SNPs信息來源于NCBI數據庫的千人基因組[62]，其中包括206名中國北京人和216名中國南方人群數據。然而這些樣本的全基因組數據沒有對納入檢測人群進行分層研究。新加坡科學家和中國安徽醫科大學科學家合作通過地域分層，在全基因組范圍設計350,000個SNPs位點，對8,200例漢族人群進行檢測，發現南方漢族和北方漢族源于同一祖先然而存在3%的基因差異，豐富了中國人群基因組SNPs數據信息[63]。然而，對于某種疾病的中國不同地域的SNPs差異仍缺乏大樣本系統的研究。

SNP是個體基因組中最常見的變異，除了作為遺傳學分子標記物用于疾病和基因的關聯研究尋找疾病相關基因，還在藥物基因組學以及人類進化史方面也都有著很重要的意義。隨著檢測和分析技術的進一步發展，SNPs作為生物信息學研究的一個熱點，將成為人類基因組研究計劃走向實際應用的重要步驟。

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Single nucleotide polymorphism in the development of human genom ics

JIANGYi1,2,DAIPu1,HANDongyi1
1DepartmentofOtolaryngology Head and Neck Surgery,ChinesePLAGeneralHospital,Beijing 100853,China
2Departmentof ProvincialClinicalMedicine,Fujian ProvincialHospitalDepartmentofOtolaryngology, Fujian MedicalUniversity,Fuzhou 350001,China

HANDongyi Email:hdy301@263.net

Singlenucleotidepolymorphism(SNP)labeling comprises the third generation of geneticmarkers.Used in linkageand association analyses,ithasbeen applied in various fields in theareaofbiologicalorigin research,including evolution andmigration ofpopulation genetics,pathogenic ordisease related susceptiblegenes,individualized drug therapy.SNPsand related studieshavebecome the focusof the research aboutmolecularmarkers.With furtherdevelopmentof detection and analysis technologies,SNP research w ill acclerate progress of bioinformatics,and become an important step towardspracticalapplication of thehumangenomicsproject.

Singlenucleotidepolymorphism；Genomics；Linkageanalysis；Association analysis

R764

A

1672-2922（2017）02-239-6

2016-12-26審核人：袁永一）

10.3969/j.issn.1672-2922.2017.02.019

國家重點研發計劃2016YFC1000700、2016YFC1000704；國家自然科學基金重點項目81230020；福建省衛生計生委醫學創新課題項目編號2016-CX-5

蔣刈，在職博士，副主任醫師，主要研究方向：耳科學及耳聾基因

韓東一，Email：hdy301@263.net