牛腸道病毒的病原學特征及檢測技術研究進展

莊金秋，梅建國，張 穎，劉吉山，沈志強

（山東省濱州畜牧獸醫研究院，濱州 256600）

綜述與專論

牛腸道病毒的病原學特征及檢測技術研究進展

莊金秋，梅建國，張 穎，劉吉山，沈志強

（山東省濱州畜牧獸醫研究院，濱州 256600）

牛腸道病毒（BEV）感染為國內近年來的新發傳染病，在牛群中普遍存在，且常與其他病原體發生混合感染和繼發感染，導致牛群出現較高的死亡率，給養牛業造成巨大的經濟損失。文章概述了牛腸道病毒的病原學特征及檢測技術研究進展，以期為預防和控制該疾病提供參考。

牛腸道病毒；病原學；檢測；進展

牛腸道病毒感染是由小RNA病毒科腸道病毒屬的牛腸道病毒（bovine enterovirus，BEV）引起的一種臨床上以發熱、咳嗽、呼吸困難、腹瀉和繁殖障礙為主要特征的傳染病。本病在我國為新發傳染病，在牛群中非常普遍，且常與其他病原體發生混合感染和繼發感染，導致牛群出現較高的死亡率，給養牛業造成巨大的經濟損失。因此，采取有效措施預防和控制BEV感染對于確保養牛業的健康發展非常重要。本文對牛腸道病毒的病原學特征及其檢測技術進行了概述，以期為預防和控制此病提供參考。

1 牛腸道病毒的由來和發現

Moll等［1］于 1959 年首次報道了牛腸道病毒（BEV），之后許多國家也陸續報道了本病的暴發與流行情況。2011年李英利等［2］從內蒙古發生腹瀉的犢牛體內分離出1株腸道病毒，經分析發現該毒株為F種腸道病毒，進而首次確定了我國存在F型牛腸道病毒感染。彭曉薇等［3］從北京發生嚴重腹瀉的泌乳奶牛中也分離獲得了F型腸道病毒。侯佩莉等［4］經過一系列病毒鑒定方法最終從泌乳奶牛的糞便中也分離出一株F型牛腸道病毒。邢澤黎等［5］從發病嚴重致死的肉牛體內分離得到E型腸道病毒。張海麗等［6］從山西發生嚴重腹瀉的泌乳奶牛中也分離獲得E型腸道病毒。BEV多從發生嚴重呼吸道癥狀、消化道癥狀和繁殖系統障礙的病牛體內分離獲得。該病在世界各國牛群中較為常見，感染率達17.6%～80.0%。感染此病毒可引起牛下痢和呼吸道癥狀，食欲下降，嚴重的還有便血，產奶量大幅下降，給養牛業造成了嚴重的經濟損失。近年來本病的發生與流行有逐漸升高的趨勢。

2 病毒的形態及分類地位

牛腸道病毒的病毒粒子外觀呈球形、正二十面體、無包膜、大小在25～30 nm之間，其基因組為不分節段的單股正鏈RNA，全長7.5 kb。根據最新病毒分類，牛腸道病毒與人脊髓灰質炎病毒、人柯薩奇病毒和豬腸道病毒等同屬小RNA病毒科腸道病毒屬中的成員。該屬病毒包括 A、B、C、D、E、F、G、H、J九個腸道病毒種及 A、B、C三個鼻病毒種，其中腸道病毒E和F種屬于牛腸道病毒。E 種包括 E1～E4，F 種包括 F1～F6。

3 病毒的流行病學特點

牛腸道病毒感染符合腸道病毒屬病毒感染的普遍規律：一種綜合征可由不同腸道病毒所引起，同一種（型）腸道病毒可以導致不同綜合征；感染腸道病毒后多數為亞臨床表現（有超過90%的感染牛無癥狀），不易被發現；普遍分布于世界各地，感染廣泛存在，并且常引起暴發；在環境中非常穩定，能在環境中存活很長時間。牛腸道病毒的病原性并不明顯，但由于其有時會侵犯其他器官而導致臨床上各種綜合征的出現。牛腸道病毒的感染宿主較廣，包括牛、羊、馬、犬、羊駝等動物。

4 病毒檢測技術研究進展

4.1 病毒的分離培養

病毒分離與鑒定是檢測BEV感染的金標準，實驗室常采用MDBK細胞進行病毒分離試驗。采集的樣品處理后，接種MDBK細胞培養，觀察是否出現細胞病變（CPE），并對其核酸進行測序比對，確定是否存在BEV感染。病毒分離與鑒定是BEV最可靠的檢測方法，但其費時長，操作繁瑣，技術人員也需要經過長時間的培訓。

4.2 血清學檢測技術

1989年Zhang等［7］建立了捕獲ELISA法來檢測血清中的BEV抗體。此法具有敏感性強、特異性高的特點，更重要的是比血清中和試驗（SN）更經濟。1990年Zhang等［8］又建立了阻斷ELISA法檢測牛血清中的BEV抗體，該方法與傳統SN法相比敏感性高，而且耗時短，可替代傳統SN法用于大規模牧場的抗體檢測。郭金玉等［9］利用北京某牛場BEV-2型分離毒株的VP1蛋白構建了檢測BEV抗體的間接ELISA方法，此法操作比較簡單、快速、使用價值比較高。朱彤等［10］通過擴增BEV的VP2基因并進行一系列的轉化、誘導表達、純化出重組蛋白，制備了較高效價的多克隆抗體，為BEV的血清學診斷方法的建立及亞單位疫苗的研制奠定了基礎。周萍萍［11］將純化好的3D蛋白作為包被抗原，建立了BEV-3D-ELISA方法，應用該方法對哈爾濱市送檢的425份奶牛血清進行了檢測，陽性率高達41.41%。蓋小春［12］應用表達純化的E種腸道病毒HY12 VP2重組蛋白作為包被抗原，建立了檢測E種腸道病毒抗體的間接ELISA方法，并對實驗感染小鼠抗體消長規律進行了研究，為本病的免疫機理和疫苗研制打下基礎。邢澤黎等［13］應用大腸桿菌表達純化的E種腸道病毒HY12的VP1和VP2重組蛋白制備了抗體，并建立了檢測BEV病原的雙抗體夾心ELISA方法，對吉林省不同地區的牛群感染BEV進行了病原流行病學調查，發現調查地區牛群的BEV感染率為8.16%～58.70%。雙抗體夾心ELISA法檢測糞便中的BEV抗原的方法，可以快速、有效地確定牛群是否存在BEV感染，將為新發生BEV感染牛的防控和牛群的凈化提供了有效的技術手段。

4.3 分子生物學檢測技術

4.3.1 RT-PCR 技術 Jimenez-Clavero等［14］針對 BEV 5′UTR基因建立了RT-PCR方法，并對西班牙多個地區的牛、綿羊、山羊、驢、馬以及地表水樣進行了檢測，結果表明，除了在驢的檢測樣本中未檢測到外，其余均有陽性樣本存在。Nathamon 等［15］也根據 5′UTR 基因設計引物建立了RT-PCR方法，并對泰國部分地區的本地牛、印度牛及山羊攜帶BEV的感染率進行了調查和分析，結果表明，以上幾種動物均有BEV的攜帶，其中本地牛攜帶率最高，為76%。吳丹等［16］根據口蹄疫病毒（FMDV）和BEV基因的5′UTR保守基因區域分別設計引物，首次建立了同時檢測FMDV和BEV的雙重RT-PCR快速檢測方法，對FMDV的最低檢出限為8 TCID50/0.1mL，對BEV的最低檢出限為2 TCID50/0.1mL。采用該方法檢測了852份臨床樣品，并與病毒分離方法比較，結果兩種方法檢測結果完全一致。侯佩莉等［17］針對BEV非結構蛋白3D基因設計引物建立了RT-PCR方法，敏感度高達10-1TCID50。侯佩莉等［18］根椐牛病毒性腹瀉病毒（BVDV）、牛冠狀病毒（BCoV）和BEV基因的保守序列，設計合成引物，在建立單一病毒RT-PCR檢測方法的基礎上，優化條件，建立了上述3種病毒的多重RT-PCR方法，對24份臨床腹瀉病料進行了檢測，與單項RTPCR的符合率100%。該多重RT-PCR鑒別診斷方法對牛腹瀉性疾病病因的確診、流行病學調查和防控具有重要意義。

4.3.2 實時熒光定量 RT-PCR技術 吳丹等［19］根據5′UTR基因設計引物建立了檢測BEV的TaqMan熒光定量RT-PCR方法，對BEV的最小檢測量為0.1 TCID50/0.1 mL。對北京周邊地區牛群采集的852份臨床樣本進行了檢測，且與分離病毒法進行了敏感性比較，結果表明，該方法檢出陽性樣本與病毒分離法檢出的一致，但敏感性比病毒分離法高10倍。朱彤等［20］根據BEV 3D基因設計引物建立了檢測BEV的SYBR Green I熒光定量RTPCR 方法，敏感度達 7.13×101拷貝/μL，是常規 RT-PCR的10倍。應用該方法檢測了3個規?；膛鏊蜋z的41份奶牛腹瀉樣本和3份氣溶膠樣本，腹瀉樣品陽性檢出率39.02%（16/41）；3份氣溶膠樣本均為陽性。說明SYBR Green I實時熒光定量RT-PCR檢測方法具有特異、穩定、高效的優點，既可以用于臨床檢測，又可對環境中的BEV進行動態監測，為BEV流行病學調查、診斷提供了有力的技術支持。

5 小結

BEV感染在世界范圍內流行，由于其所引起的臨床癥狀與其他病原體（如BVDV、BCoV等）所引起的疾病癥狀非常相似，僅從臨床上進行診斷很容易造成誤診，致使病情加重，甚至威脅到生命安全。能夠及早確診所感染的病毒及類型，對于及時撲滅疫情，控制疫病的傳播具有重要作用。目前，我國對牛腸道疾病的診斷和防治還很薄弱，完善該病的診斷技術及研發亞單位疫苗對我國奶牛養殖業具有重大意義。

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《中國草食動物科學》對優秀稿件實行數字優先出版通告

《中國草食動物科學》是由農業部主管、中國農業科學院蘭州畜牧與獸藥研究所主辦的國家級畜牧類學術期刊，其前身為《中國養羊》、《草與畜雜志》和《中國草食動物》。本刊2011年被《美國化學文摘》(CA)收錄，曾榮獲中國科技論文在線優秀期刊二等獎、第三屆和第四屆全國優秀農業學術期刊二等獎、第四屆全國畜牧獸醫優秀期刊二等獎，先后被評為全國中文核心期刊、中國農業核心期刊、中國科技核心期刊和RCCSE中國核心學術期刊?！吨袊菔硠游锟茖W》為中國科學引文數據庫（CSCD）、中國科技論文與引文數據庫、中國學術期刊綜合評價數據庫（CAJCED）和中國生物學文獻數據庫等的統計源期刊；是《中國核心期刊（遴選）數據庫》、《萬方數據－數字化期刊群》、《中國期刊全文數據庫(CJFD)》、《中國生物學文摘》、《中國生物學文獻數據庫》、臺灣《CEPS中文電子期刊》、中國科技論文在線來源期刊和收錄期刊。優先出版稿件的條件：①國家“973”、“863”項目資助論文；②國家級及省級科學基金項目資助論文；③海外聯合基金資助論文；④有重大臨床意義的病例報告；⑤創新研究結果的首報。

在作者簽署“中國知網優先出版授權書”后，本刊將于2個月內完成優質稿件的審稿、編輯加工、排版、數字優先出版（單篇），特別優秀的稿件將于1個月內實現數字優先出版。數字優先出版后，可在中國知網全文數據庫進行檢索和下載，并在本刊紙質期刊上以相同版式刊登。

Progress in the Pathogenic Characteristics of the Bovine Enterovirus and Its Detection Techniques

Zhuang Jinqiu，Mei Jianguo，Zhang Ying，et al
（Binzhou Academy of Animal Scienceamp;Veterinary Medicine，Binzhou 256600，Shandong，China）

Bovine enterovirus（BEV）infection is a new infectious disease.It has been prevalent in the herd in China in recent years，and often has mixed with other pathogens infection and secondary infection.It often results in high mortality of cattle，causes huge economic losses to the cattle industry.In this paper，the research progress in the pathogenic characteristics and detection techniques of bovine enterovirus was summarized in order to provide reference for its prevention and control.

bovine enterovirus；etiology；detection；progress

S852.653

A

2095-3887（2017）06-0049-03

10.3969/j.issn.2095-3887.2017.06.014

2017-06-30

山東省重點研發計劃項目（2015GSF121027）；山東省現代農業產業技術體系牛產業創新團隊項目（SDAIT-09-12）

莊金秋（1978-），女，副研究員，碩士，主要從事細胞培養和動物用病毒疫苗研制工作。