抑制婁地青霉乳酸菌的研究進展

(內蒙古農業大學乳品生物技術與工程教育部重點實驗室，呼和浩特010018)

抑制婁地青霉乳酸菌的研究進展

馬玉珠，陳永福

(內蒙古農業大學乳品生物技術與工程教育部重點實驗室，呼和浩特010018)

婁地青霉（Penicillium roqueforti）是青貯飼料和焙烤食品中常見的有害霉菌。本文簡述了婁地青霉對青貯飼料和焙烤食品的污染情況，針對可以抑制婁地青霉生長的乳酸菌種類、抑制機理和具體應用進行了論述。旨在為乳酸菌防治婁地青霉的研究提供參考。

婁地青霉；乳酸菌；毒素

0 引言

婁地青霉（Penicillium roqueforti）是一種耐酸、耐低氧和耐高濃度二氧化碳的真菌[1]，在青貯飼料中檢出率最高[2]，也會污染焙烤食品、肉制品和低溫保藏食品等[3]。婁地青霉能夠代謝生成毒素，如PR毒素（PR-toxin）、異煙棒曲霉素C（roquefortine C）、霉酚酸（mycophenolic acid）和酪青霉毒素（roquefortin）等，動物食用被污染的飼料后表現出食欲減退、腹瀉、酮病和腸胃炎等癥狀[4]。

利用生物防治方法防治霉菌具有更高的安全性，而乳酸菌是公認安全的微生物，因此利用乳酸菌防治青貯飼料或食品中的婁地青霉具有很好的前景，如植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）、瑞士乳桿菌（Lactoba?cillus helveticus）和干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）等。

本文綜述了婁地青霉的危害，抑制婁地青霉乳酸菌的種類、機理和具體應用，以期為婁地青霉的生物防治提供借鑒。

1 婁地青霉的危害

婁地青霉的生長導致飼料和食品的腐敗變質，并產生毒素，其代謝產物PR毒素毒性最強，霉酚酸和異煙棒曲霉素C分別具有抑制免疫力和毒害神經的作用。

1.1婁地青霉產生的毒素

婁地青霉在純培養時產生的常見毒素有PR毒素、異煙棒曲霉素C和霉酚酸等[5]。O'Brien等[6]報道了試驗中所用90%的婁地青霉在培養期間可以持續產生異煙棒曲霉素C，但不會持續產生PR毒素，所產生的霉酚酸較PR毒素多。其中PR毒素是婁地青霉代謝產生毒性較大的細胞毒素，異煙棒曲霉素C具有中等毒性，而其他大部分代謝產物低毒或無毒。

1.1.1 PR毒素

PR毒素是產毒婁地青霉菌株產生的一種具有肝毒性毒素，攝入牛體內會導致母牛流產，抑制DNA、RNA以及蛋白質的合成，在培養的細胞以及分離出來的大鼠肝臟細胞核中誘導DNA蛋白質交聯。高劑量的PR毒素會導致DNA單鏈斷裂并抑制DNA修復過程[7]，還具有致癌致突變作用[6]。

Chen等[8]通過對動物進行注射、口服PR毒素來研究其毒性，發現注射組的實驗動物在7 h內死亡，口服組在10 h后死亡。其研究還證明PR毒素是通過增加毛細血管通透性對動物產生急性毒害，導致動物劇烈脫水和血容量的減少，從而對肺、心臟、肝臟和腎臟產生直接損傷。此外，Rasmussen等[9]研究報道PR毒素能夠抑制腸細胞活性，對動物體具有急性毒性以及高細胞毒性，低濃度的PR毒素就能抑制DNA的合成以及肝細胞活性。

PR毒素在酸性條件下（pH＜3）不穩定，Gallo等[4]報道在胃液中加入PR毒素48 h后檢測不到PR毒素，這是由于PR毒素被瘤胃微生物降解為低毒物質，因此其危害并不大。

1.1.2 霉酚酸和異煙棒曲霉素C

胃液中接入霉酚酸和異煙棒曲霉素C 48 h后，可以檢測到40%以上的殘留率，說明這兩種毒素在瘤胃中不可被降解，最終會到達小腸中，通過對小腸微生物產生抑制作用而對動物產生危害[4]。霉酚酸具有抑制免疫力的作用，異煙棒曲霉素C具有毒害神經的作用，從而危害人和動物的健康。另一方面，也正是因為霉酚酸具有抑制免疫力的作用，霉酚酸及其衍生物霉酚酸酯、霉酚酸鈉可用作免疫抑制藥物，以減輕器官移植后所發生的排斥反應以及治療自身免疫疾病[10]。

1.2婁地青霉對食品和飼料的污染情況

1.2.1 藍紋干酪

婁地青霉可以用作藍紋干酪的二次發酵劑，在藍紋干酪成熟期間產生分解脂肪和蛋白質的酶，使其形成獨特的刺激風味[11]，而這種風味是由脂肪酸代謝所產生的甲基酮類物質提供的，特別是2-戊酮、2-庚酮和2-壬酮[12]。但是婁地青霉在干酪中也會產生毒素，Fontaine等[13]在86份藍紋干酪樣品中都檢測到了異煙棒曲霉素C，其中51.2%的樣品含有霉酚酸。由于干酪中存在氨基化合物，以及干酪內部的微需氧條件下，PR毒素不穩定，所以在藍紋干酪中的檢出率較小。

1.2.2 青貯飼料

婁地青霉是青貯飼料中的主要有害菌，張海彬等[14]通過檢測111份飼料樣品中的霉菌，發現玉米及牧草青貯飼料中，青霉的檢出率高達50%以上，其中婁地青霉的檢出率在30%以上。此外，Rao等[15]在檢測的飼料樣品中也發現了婁地青霉。

1.1.3 焙烤食品

婁地青霉還是污染焙烤食品的主要霉菌之一，Lund等[16]報道婁地青霉在黑面包中的檢出率達27%。焙烤食品中常用的化學防腐劑為丙酸鹽（抑制霉菌生長）和山梨酸鹽（抑制霉菌和酵母菌的生長）[17]。雖然目前認為低劑量化學防腐劑是安全的，但是其長期使用所造成的影響還存有爭論。為了減少化學防腐劑的使用，利用生物防治方法控制婁地青霉引起了人們的高度重視，使用人們公認安全的乳酸菌代替化學防腐劑在焙烤食品中的使用，可以大大提高食品的安全性。

2 乳酸菌對婁地青霉的抑制作用

具有抑制婁地青霉作用的乳酸菌包括植物乳桿菌（L.plantarum）、瑞士乳桿菌（L.helveticus）、干酪乳桿菌（L.casei）、棒狀乳桿菌（Lactobacillus.coryniformis）、淀粉乳桿菌（Lactobacillus.amylovorus）、混淆魏斯氏菌（Weissella confusa）和耐久腸球菌（Enterococcus durans）等。乳酸菌通過產生乳酸、乙酸和苯乳酸等有機酸以及肽類等物質來抑制婁地青霉的生長以及毒素的產生。

2.1具有抑制婁地青霉活性乳酸菌的種類

2.1.1 植物乳桿菌

植物乳桿菌是研究最廣泛的具有抑制婁地青霉活性的乳酸菌。本研究團隊的董艷[18]以內蒙古農業大學乳酸菌菌種資源庫中347株植物乳桿菌為研究對象，篩選得到248株對婁地青霉具有抑制作用的菌株，其中33株具有良好的抑制特性，并將植物乳桿菌IMAU80162、IMAU10585和IMAU20013應用于青貯飼料中，結果表明 MAU80162、IMAU10585和IMAU20013可以抑制青貯飼料中霉菌、酵母菌、大腸桿菌的生長。

Crowley等[19]報道94株具有廣譜抑菌（包括婁地青霉）活性乳酸菌中，87株為植物乳桿菌，3株為混淆魏斯氏菌，其余4株為戊糖片球菌。王應東[20]等也發現植物乳桿菌對婁地青霉有抑制作用。大量研究證明植物乳桿菌具有抑制婁地青霉的作用，如植物乳桿菌A1[21]，C21-41[22]，KCC-24[22]，IMAU10116[24]，IMAU80134[20]，1A7[25]等菌株對婁地青霉均具有良好的抑制作用。

2.1.2 其他

其他的一些乳酸菌種類，例如：混淆魏斯氏菌、戊糖片球菌[26]、干酪乳桿菌和瑞士乳桿菌[24]等也可以抑制婁地青霉的生長。目前已發現了很多對婁地青霉具有良好抑制作用的菌株，如耐久腸球菌A5-11[27]，棒狀乳桿菌Si3[28]，淀粉乳桿菌DSM 19280[29]和短乳桿菌AM7[30]等。

2.2乳酸菌對婁地青霉的抑制機理

2.2.1 有機酸

低pH值是乳酸菌產生抑菌作用的主要原因之一，乳酸菌通過產生有機酸降低pH值，從而抑制婁地青霉的生長。植物乳桿菌 KCC-24[23]，KCC-25，KCC-26，KCC-27，KCC-28[31]，短乳桿菌P68[32]和淀粉乳桿菌DSM 19280[29]等菌株的主要抑菌物質均為有機酸。

Vijayakumar等[23]和Ilavenil等[31]發現植物乳桿菌KCC-24，KCC-25，KCC-26，KCC-27和KCC-28對婁地青霉產生抑制作用的抑菌物質是有機酸，包括乳酸、乙酸和琥珀酸。苯乳酸也可以對婁地青霉產生抑制作用，Svanstr?m等[33]證明了乳酸菌的代謝產物苯乳酸可以抑制婁地青霉的生長及其孢子的形成。

Arasu等[32]報道短乳桿菌P68無菌上清液中的抑菌物質具有羥基、羰基、酸基和酚基，分子質量與對羥基苯甲酸相同。淀粉乳桿菌DSM 19280對婁地青霉、煙曲霉、黃色鐮孢菌等具有抑制作用，其發酵上清液中的抑菌物質除了乳酸和乙酸外還有15種活性物質，7種羧酸類物質：苯丙酸（3-phenylpropanoic acid）、3-苯基乳酸（3-phenyllactic acid）、水楊酸（salicylic acid）等；2種核苷類物質，胞嘧啶核苷（cytidine）和2’-脫氧胞苷（2’-deoxycytidine）；癸酸鈉（sodium decanoate）和5種環二肽（cyclic dipeptides）[29]。乳酸菌的抑菌作用是在多種物質的作用下完成的，并不是由有機酸單獨產生。

2.2.2 蛋白質類物質

乳酸菌的代謝產物中除了有機酸，蛋白類物質也具有抑菌作用，下面的一些研究證明了蛋白質類物質的作用。

陳沖等[34]發現植物乳桿菌IMAU80134和IMAU 80176對婁地青霉的抑制作用與乳酸和苯乳酸的含量沒有線性關系，說明起關鍵作用的抑菌物質并非乳酸或苯乳酸。Coda等[25]發現植物乳桿菌1A7所產生的抑菌活性物質是肽類，其抑菌物質經胰蛋白酶處理后活性完全消失，100℃處理5 min對抑菌活性沒有影響。另外，Wang等[24]和Magnusson[28]等的研究也有類似的結論，Wang等[24]對植物乳桿菌IMAU10116產生的代謝產物進行了進一步的分析，通過蛋白酶穩定性、pH穩定性和熱穩定性試驗，推測抑菌物質可能是一種肽。Magnusson等[28]報道了棒狀乳桿菌Si3所產生的抑菌物質具有熱穩定性，pH值在3.0～4.5之間抑菌活性穩定，但pH值在4.5～6.0時活性快速減小，pH值大于6.0后沒有抑制活性，但是將pH值調回最初值恢復抑菌活性；經蛋白酶K、胰蛋白酶、胃蛋白酶處理后喪失活性，并且不可逆轉，說明活性物質為蛋白質類小分子物質。Coda等[30]報道了短乳桿菌AM7的抑菌活性是在有機酸（特別是乳酸和乙酸）和多肽類共同作用下產生的，其代謝產物中的5種多肽具有抑菌活性。

2.3乳酸菌抑制婁地青霉的應用

將乳酸菌應用于實際的試驗也驗證了其可以延緩婁地青霉的萌發，延長食品貨架期，提高青貯飼料和食品安全性的作用。Wang等[24]在試驗中所用婁地青霉孢子懸液的濃度要高于自然環境中的濃度，實驗結果顯示植物乳桿菌IMAU10116對婁地青霉具有良好的抑制效果，說明IMAU10116可以用來預防食品和飼料的腐敗及消除婁地青霉產生毒素。

王應東等[20]將植物乳桿菌IMAU80134應用于饅頭的面團發酵過程中，證明了IMAU8013可以有效延緩婁地青霉孢子萌發。Ryan等[29]將淀粉乳桿菌DSM 19280添加到面包中發現，此菌株最多可以延長14 d的保質期，而丙酸鈣在相同試驗條件下最多延長12 d，淀粉乳桿菌DSM 19280有望可以替代丙酸鈣作為面團發酵劑，以延長面包保質期。Coda等[25]也做了類似試驗，發現經過植物乳桿菌1A7和異常威克漢姆酵母LCF1695共同發酵面團后，其防腐作用相當于添加0.3%的丙酸鈣，并且添加植物乳桿菌1A7和異常威克漢姆酵母LCF1695對面包的體積、柔軟度、彈性、色澤、口感都有加強作用，還可以延長面包的貨架期，在正常儲存條件下可以延遲真菌生長28 d。

Coda等[30]發現經過短乳桿菌AM7發酵面團的水溶性提取物可以顯著降低婁地青霉孢子萌發率，和菜豆水溶性提取物復配后，抑菌作用相當于添加0.3%丙酸鈣，這可以滿足人們對無化學添加劑的需求，同時還可以延長貨架期。

青貯飼料方面，董艷[18]將植物乳桿菌IMAU80162，IMAU10585和IMAU20013應用于青貯飼料中，發現這三株菌可以降低青貯飼料中霉菌、酵母菌和大腸桿菌的數量。這些研究證明了將乳酸菌應用于食品或飼料中可以提高食品及飼料的安全性。

3 展望

婁地青霉污染食品和青貯飼料，不僅造成了經濟損失，所產生的毒素也危害到人和動物的健康，但是目前防治婁地青霉的方法還只局限于利用化學防腐劑，使用生物防治方法控制婁地青霉已逐漸引起了人們的重視。將人們公認安全并且具有益生作用的乳酸菌應用于食品和青貯飼料中，以抑制婁地青霉的生長不僅可以降低化學添加劑的使用，還有益于人體和動物的健康，可以滿足人們對健康生活的追求，提高生活質量。

目前，已有一些優良乳酸菌菌株應用于面包的生產中，有效延長了面包貨架期，有望替代丙酸鹽和山梨酸鹽等添加劑，提高面包的安全性。在青貯飼料中的應用方面，乳酸菌可以作為促進性添加劑，通過抑制青貯飼料中的霉菌生長，提高青貯飼料的品質。

研發出更多具有廣譜抑菌活性的乳酸菌來降低婁地青霉等各種有害菌的危害，為開發應用新的可用于生物防治的菌株奠定基礎，并使其達到工業化生產，具有很好的發展潛力和應用前景。

[1]TANIWAKIM H,HOCKING A D,PITT JI,etal.Growth and my?cotoxin production by fungiin atmospheres containing 80%carbon di?oxide and 20%oxygen[J].International Journal of Food Microbiology, 2010,143(3):218-225.

[2]張海彬,陸承平.用改良高效液相色譜法測定飼料中酪青霉毒素.南京農業大學學報,2002,25(4):84-86.

[3]ROPARS J,LOPEZ-VILLAVICENCIO M,DUPONT J,et al.In?duction of sexualreproduction and genetic diversity in the cheese fun?gus Penicillium roqueforti[J].Evolutionary applications,2014,7(4): 433-441.

[4]GALLO A,GIUBERTI G,BERTUZZI T,et al.Study of the effects of PR toxin,mycophenolic acid and roquefortine C on in vitro gas production parameters and their stability in the rumen environment[J]. The Journalof AgriculturalScience,2014,153(01):163-176.

[5]BOURDICHON F,CASAREGOLA S,FARROKH C,et al.Food fermentations:microorganisms with technological beneficialuse[J].In?ternationalJournalof Food Microbiology,2012,154(3):87-97.

[6]O'BRIEN M,NIELSEN K F,O'KIELY P,et al.Mycotoxins and other secondary metabolites produced in vitro by Penicillium paneum Frisvad and Penicillium roqueforti Thom isolated from baled grass si?lage in Ireland[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry,2006, 54(24):9268-9276.

[7]LEE Y H W,FANG S C,WEIRD.The effectsof Penicillium roque?forti toxin on the activity ofrat hepatic DNA polymerases.[J].Toxicol?ogy,1984,33(1):43-57.

[8]CHEN F C,CHEN C F,WEI R D.Acute toxicity of PR toxin,a mycotoxin from Penicillium roqueforti[J].Toxicon Official Journal of the InternationalSociety on Toxinology,1982,20(2):433-441.

[9]RASMUSSEN R R,RASMUSSEN P H,LARSEN T O,et al.In vi?tro cytotoxicity of fungi spoiling maize silage[J].Food and Chemical Toxicology,2011,49(1):31-44.

[10]ISMAIEL A A,AHMED A S,EL-SAYED E L S R.Optimizationof submerged fermentation conditions for immunosuppressant myco?phenolic acid production by Penicillium roqueforti isolated from blue-molded cheeses:enhanced production by ultraviolet and gam?ma irradiation[J].World Journal of Microbiology&Biotechnology, 2014,30(10):2625-2638.

[11]劉雅楠.藍紋干酪加工與成熟的研究[D].天津科技大學,2008.

[12]CAO M,FONSECA L M,SCHOENFUSS T C,et al.Homogeniza?tion and lipase treatment of milk and resulting methyl ketone genera?tion in blue cheese[J].Journal of Agricultural&Food Chemistry, 2014,62(25):5726-33.

[13]FONTAINE K,PASSERóE,VALLONE L,et al.Occurrence of roquefortine C,mycophenolic acid and aflatoxin M1 mycotoxins in blue-veined cheeses[J].Food Control,2015,47:634-640.

[14]張海彬,陸承平.飼料中婁地青霉(P.roqueforti)的檢測[J].畜牧與獸醫,2003,35(1):3-5.

[15]RAO V K,SHILPA P,GIRISHAM S,et al.Incidence of mycotoxi?genic penicillia in feeds of Andhra Pradesh,India[J].International Journalof Biotechnology&Molecular Biology Research,2011.

[16]LUND F,FILTENBORY O,WESTALL S,et al.Associated myco?flora of rye bread[J].Letters in Applied Microbiology,1996,23(4): 213-217.

[17]SUHR K I,NIELSEN P V.Effect of weak acid preservatives on growth of bakery product spoilage fungi at different water activities and pH values[J].International Journal of Food Microbiology,2004, 95(1):67-78.

[18]董艷.具有抑制婁地青霉的植物乳桿菌的篩選及其在青貯飼料中的應用研究[D].內蒙古農業大學,2015.

[19]CROWLEY S,MAHONY J,VAN SINDEREN D.Broad-spec?trum antifungal-producing lactic acid bacteria and their application in fruit models[J].Folia Microbiologica,2013,58(4):291-299.

[20]王應東,陳沖,王海寬.抗真菌乳酸菌的篩選及其對饅頭和酸奶的防腐實驗[J].天津科技大學學報,2015,30(2):11-15.

[21]王海寬,陳沖,王應東.酸粥中抗真菌活性乳酸菌的篩選以及在酸奶中的應用[C].第五屆全國微生物資源學術暨國家微生物資源平臺運行服務研討會論文摘要集,2013,165-171.

[22]VALERIO F,FAVILLA M,DE BELLIS P,et al.Antifungal activity of strains of lactic acid bacteria isolated from a semolina ecosystem against Penicillium roqueforti,Aspergillus niger and Endomyces fibu?liger contaminating bakery products[J].Systematic and Applied Mi?crobiology,2009,32(6):438-448.

[23]VIJAYAKUMAR M,ILAVENIL S,KIM D A H,et al.In-vitro as?sessment of the probiotic potential of Lactobacillus plantarum KCC-24 isolated from Italian rye-grass(Lolium multiflorum)forage [J].Anaerobe,2015,32:90-97.

[24]WANG H,SHI J,ZHANG H,et al.A survey of some antifungal properties of lactic acid bacteria isolates from koumiss in China[J].In?ternationalJournalof Dairy Technology,2011,64(4):585–590.

[25]CODA R,CASSONE A,RIZZELLO C G,et al.Antifungalactivity of Wickerhamomyces anomalus and Lactobacillus plantarum during sourdough fermentation:identification of novel compounds and long-term effect during storage of wheat bread[J].Applied and Envi?ronmentalMicrobiology,2011,77(10):3484-3492.

[26]DALIéD K D,DESCHAMPS A M,RICHARD-FORGET F. Lactic acid bacteria– Potential for control of mould growth and mycotoxins:A review[J].Food Control,2010,21(4):370-380.

[27]BELGUESMIA Y,CHOISET Y,RABESONA H,et al.Antifungal properties of durancins isolated from Enterococcus durans A5-11 and of its synthetic fragments[J].Letters in Applied Microbiology, 2013,56(4):237-244.

[28]MAGNUSSON J,SCHNURER J.Lactobacillus coryniformis subsp. coryniformis strain Si3 produces a broad-spectrum proteinaceous an?tifungal compound.Applied and Environmental Microbiology,2001, 67(1):1-5.

[29]RYAN L A,ZANNINI E,DAL BELLO F,et al.Lactobacillus amy?lovorus DSM 19280 as a novel food-grade antifungal agent for bak?ery products[J].International Journal of Food Microbiology,2011, 146(3):276-283.

[30]CODA R,RIZZELLOC G,NIGRO F,et al.Long-term fungalin?hibitory activity of water-soluble extracts of Phaseolus vulgaris cv. Pinto and sourdough lactic acid bacteria during bread storage[J].Ap?plied and EnvironmentalMicrobiology,2008,74(23):7391-7398.

[31]ILAVENIL S,PARK H S,VIJAYAKUMAR M,et al.Probiotic po?tentialof Lactobacillus strains with antifungalactivity isolated from an?imalmanure[J].The Scientific World Journal,2015,2015:802570.

[32]ARASU M V,AL-DHABIN A,REJINIEMON T S,et al.Identifi?cation and Characterization of Lactobacillus brevis P68 with Antifun?gal,Antioxidant and Probiotic Functional Properties[J].Indian Jour?nalof Microbiology,2014,55(1):19-28.

[33]SVANSTR?M?,BOVERI S,BOSTR?M E,et al.The lactic acid bacteria metabolite phenyllactic acid inhibits both radial growth and sporulation of filamentous fungi[J].Bmc Research Notes,2013,6(6): 1-9.

[34]陳沖,王應東,王海寬.抗婁地青霉和黃曲霉差異植物乳桿菌的篩選[C].乳酸菌與生物工程:第八屆乳酸菌與健康國際研討會摘要匯編,2013,22-23.

Progress on the Lactic acid bacteria inhibit Penicillium roqueforti

MA Yuzhu,CHEN Yongfu
(Key Laboratory of Dairy Biotechnology and Engineering,Inner Mongolia Agricultural University,Hohhot 010018,China)

Penicillium roqueforti is the harmfulmold often found in silage and baked foods.Our study briefly sketch the contamination of Peni?cillium roqueforti in the silage and baked foods.And,the function mechanism and the specific applications ofthe Lacticacid bacteria with inhibito?ry to Penicillium roqueforti were sum up in the article.Aim to provide reference to the study of preventing the harm of Penicillium roqueforti by lacticacid bacteria.

Penicillium roqueforti；Lacticacid bacteria；toxin

Q939.11+7

B

1001-2230（2017）04-0030-04

2016-09-18

馬玉珠（1989-），女，碩士研究生，研究方向為乳品生物技術與工程。

陳永福