3種水稻分子標記輔助育種技術的應用概況

高美鳳 王曉峰 夏蓮紅 曹月琴 顧明飛 楊建芳（上海市閔行區農業技術服務中心 201109）

3種水稻分子標記輔助育種技術的應用概況

高美鳳*王曉峰 夏蓮紅 曹月琴 顧明飛 楊建芳（上海市閔行區農業技術服務中心 201109）

分子標記技術已成為水稻育種的重要輔助工具并已得到迅速發展。為提高水稻育種能力，加快水稻新品種的培育與研究進程，現重點介紹3種分子標記技術的原理、優勢，以及分子標記技術在水稻育種中的應用情況，如水稻遺傳圖譜的構建、圖位克隆與基因定位、輔助育種等，并對目前水稻分子標記輔助育種存在的問題及未來發展進行了分析和探討。

水稻；D N A分子標記技術；輔助育種

隨著耕地的銳減、人口的持續增長、經濟的快速發展，增加單位面積的稻米產量、用有限的土地資源滿足人們生存的需要變得越來越迫切。20世紀半矮化水稻、雜交水稻的成功培育使水稻產量獲得較大提升，在一定程度上緩解了糧食生產的巨大壓力。但傳統水稻育種是通過表型性狀對優良親本進行選擇，育種效率低，選擇周期長，通常一個新品種的選育需要幾年的時間，阻礙了水稻新品種的培育和研究。隨著分子生物技術的發展，將分子技術融入水稻育種中，通過DNA分子標記以及亞種間已知或未知的優良等位基因來直接篩選目標性狀，不僅彌補了傳統水稻育種的缺陷，而且給水稻育種帶來了革命性的影響，已成為優良水稻品種選育的新手段。為提高水稻育種能力，加快水稻新品種的培育與研究進程，筆者重點介紹了3種分子標記技術的原理、優勢，以及分子標記技術在水稻育種中的應用情況，并對目前水稻分子標記輔助育種存在的問題及未來發展進行了分析和探討，以供同行參考借鑒。

1 DNA分子標記技術

D N A分子標記是根據基因組中D N A片段的差異來定位、追蹤、觀察潛在的遺傳變異和個體間的差異。與形態標記、生化標記相比，DNA分子標記技術具有以下優點：（1）準確性高，表現穩定，不受環境條件和基因表達限制，無組織及發育階段特異性。（2）以DNA突變為基礎，直接反應核苷酸水平上的差異，多態性高，數量豐富，分布廣泛。（3）許多DNA標記多為共顯性遺傳，可用以鑒別純合體與雜合體等。

常用的DNA標記技術主要基于DNA雜交（Southern blotting）、DNA片段擴增（PCR）、限制性酶切等技術。目前DNA標記技術已在水稻遺傳圖譜構建、種質資源鑒定、遺傳多樣性分析、重要農藝性狀相關基因定位、分子輔助育種等方面被廣泛應用。

2 3種水稻分子標記輔助育種技術的原理

2.1 限制性片段長度多態性 (Restriction Fragment Length Polymorphism：RFLP)

RFLP是應用最早、最廣泛的DNA分子標記技術。它是基于DNA雜交發展起來的分子技術，通過利用限制性內切酶酶切不同個體的基因組DNA后進行Southern雜交來反映不同個體DNA酶切位點的差異和多態性。RFLP標記不受環境等影響、多為共顯性，具有典型的分子標記優勢。20世紀80年代首先被用于人類基因圖譜的構建，隨后被廣泛用于構建動植物遺傳圖譜及重要基因的標記。如1988年，McCouch等[1]以秈稻和爪哇稻雜交F2代群體作圖完成水稻第1張遺傳圖譜，該圖譜包含了135個RFLP標記，全長1 389 cM，覆蓋了水稻全基因組。雖然RFLP標記表現穩定、多為共顯性，但其所需DNA量大、周期長、成本高等因素限制了其的應用。

2.2 簡單重復序列（Simple Sequence Repeat：SSR）

SSR技術是一種基于PCR擴增和微衛星DNA特性的標記技術。在真核生物基因組中普遍存在著一類長度通常在200 bp以下的DNA串聯重復序列，其核心為由1～6個bp組成的基本序列，核心序列重復數目的差異導致不同等位基因和個體間遺傳的高度多態性，也成為SSR標記數目豐富的基礎。微衛星DNA的長度呈現高度變異，但其兩側的堿基序列卻高度保守，故可根據側翼的保守序列設計引物對微衛星DNA進行PCR擴增，通過擴增產物長度的多態性來揭示不同個體或品種間的遺傳差異。如Wu等[2]研究發現在水稻中富含微衛星DNA序列，平均每225 kb和480 kb出現1個GA、GT重復。SSR標記操作簡便、穩定性好，多為共顯性遺傳，數量豐富，分布廣泛，已成為理想的分子輔助標記技術。

2.3 擴增片段長度多態性（Amplified Fragment Length Polymorphism：AFLP）

AFLP是將限制性酶切技術與PCR擴增相結合創新發明的一種新的檢測標記技術。該技術通過酶切基因組DNA獲得長度不一的DNA片段，將酶切產物接上接頭，根據接頭序列和酶切位點設計引物進行特異性擴增，通過電泳條帶，對長度不一的擴增產物進行辨別。A F L P克服了R F L P對DNA需求量大、周期長、技術復雜的缺點，因其多態性強、穩定性高、操作簡單、分辨率高，已成為目前最有效的分子標記，被廣泛用于構建高密度遺傳圖譜。通過比較發現，水稻中存在大量AFLP標記，遠高于RFLP，適用于水稻精細圖譜的構建[3,4]；Xu[5]等獲得2個與水稻Sub1基因緊密連鎖遺傳距離僅0.2 cM 的AFLP標記，并發現水稻中AFLP遺傳多樣性高；陳亮[6]等通過對20個水稻品系遺傳多樣性分析發現，AFLP標記能更好地反映品系親緣和地理生態上的差異，更適合多樣性的研究。

3 3種水稻分子標記輔助育種技術的應用情況

3.1 水稻遺傳圖譜的構建

遺傳圖譜可表明某一物種相關性狀調控基因在染色體上的位置。分子標記技術是遺傳圖譜構建的關鍵工具，根據利用同目標基因緊密連鎖的分子標記，可將目標基因定位于兩個分子標記之間。水稻分子遺傳圖譜的構建為水稻后續的遺傳育種奠定了基礎，有利于育種材料的選擇與評估。1988年McCouch[1]等完成了水稻第1張遺傳圖譜，隨后Causse[7]等和Harushima[8]等分別構建了包含726個、2 275個RFLP標記的水稻高密度遺傳圖譜，遺傳密度分別提高到2、0.7 cM。2000年翁清妹[9]等利用秈稻“圭630/臺灣粳”的DH群體構建了包含1 7 5個R F L P標記位點的水稻連鎖圖譜。2002年王春明[10]等用“臺中65（粳稻）/ARC10313”（秈稻）的重組近交系（F10）構建了含113個RFLP標記、分布均勻的水稻遺傳圖譜。2001年Mccouch[11,12]等構建了包含2 740個SSR標記的水稻遺傳圖譜，平均每157 kb就有1個SSR位點。目前水稻高密度遺傳圖譜已經包含3267個RFLP標記，已公布的水稻SSR標記已有14 000多個，已基本覆蓋水稻整個基因組。

3.2 圖位克隆與基因定位

水稻由于基因組小、重復序列少、分子標記豐富，已成為單子葉植物分子標記應用與研究的代表。水稻精細遺傳圖譜的構建為水稻抗逆性及形態生理學重要基因的定位研究提供了重要的信息，尤其對QTLs位點的研究具有重要意義。圖位克隆根據覆蓋目標基因的遺傳圖譜，通過染色體步查逐漸逼近來獲取目標基因。1995年Song[13]等利用RFLP分子標記RG103首次成功定位并克隆到1個水稻抗白葉枯病基因——Xa21。Sakaguchi[14]通過圖位克隆將Xa1定位于水稻4號染色體上，隨后Yoshimura[15]等從水稻中分離到Xa1，并發現其編碼產物為富含亮氨酸重復序列的核酸結合蛋白（NBSLRR）。Yano[16]等利用 Nipponbare/Kasalath F2代群體和850多分子標記檢測到水稻抽穗期QTLs主效基因Hd1和Hd2及微效基因Hd3、Hd4和Hd5，通過RFLP將Hd1定位于6號染色體，并成功克隆了Hd1。Wang[17]等和Bryan[18]等分別成功從水稻中分離克隆到抗稻瘟基因Pib和Pi-ta。鄢寶[19]等利用重組自交系構建了含有156個SSR標記的遺傳圖譜，并將3個控制糙米蛋白質含量的QTLs分別定位于水稻4、6、8號染色體。目前，通過分子標記被定位的水稻重要基因已經有100多個，廣親和基因、耐脅迫基因、高產基因、口味品質相關基因等越來越多的QTLs已被研究和定位克隆。

3.3 分子標記輔助育種

分子標記在育種中的應用主要是通過與目標性狀緊密連鎖的分子標記，鑒定不同個體的基因型，結合表現型進行選擇育種。隨著大量水稻分子標記的開發，利用分子標記技術選育優質品種也取得了很大的發展?，F階段分子標記輔助育種改良的性狀主要涉及一些抗性基因，通常將一個或多個QTL基因導入或聚合到一個品種中，培育出具有廣譜抗性的新品種?？拱兹~枯病水稻新品種的培育是分子標記在水稻育種中應用最成功的例子。1997年Huang[20]等利用分子標記技術將Xa4、Xa5、Xa13、Xa21基因進行聚合，選育出具有廣譜抗白葉枯病的新品種。羅彥長[21]等將Xa21基因通過回交成功轉入到光敏核不育系中，培育了穩定的抗白葉枯病、同時保持原優良性狀的新不育系。朱玉君[22]等以抗稻瘟病品系為母本、抗白葉枯病品系為父本，利用分子標記技術選出4份兼具抗稻瘟病和抗白葉枯病、育性恢復力強的新恢復系。姜潔鋒[23]利用分子標記輔助選擇培育了一系列抗稻瘟病和抗白葉枯病性的光溫敏核不育系新材料。柳武革[24]等將Pi-1、Pi-2兩個抗稻瘟基因導入保持系中，并獲得抗稻瘟病表現良好的新組合。近年來，分子標記在水稻數量性狀的育種中也逐漸得以應用，如楊益善[25]等通過將高產QTL基因yld1.1和yld2.1導入優良恢復系中，獲得的新恢復系的產量得到了明顯改良；聶元元[26]等利用分子標記輔助技術對恢復系R255進行改良，獲得低直鏈淀粉含量的改良材料。

4 展 望

DN A分子標記技術因其特有的優勢，已成為作物育種的一個重要輔助工具，分子標記輔助育種提高了育種的準確性和育種效率，受到了世界各國農業組織的重視和關注，積極開展作物分子標記開發、鑒定及在育種領域的應用已成為未來各國農業發展的趨勢和重點。近年來，水稻分子標記輔助育種得到了迅速發展，然而目前分子標記技術的應用主要集中在一些單基因控制的質量性狀（抗病蟲害基因、耐脅迫基因），對于數量性狀（如產量和品質性狀）的選擇效果尚不能滿足目前的育種要求。隨著人們生活需求的提高，培育健康綠色、優質口感的稻米已成為未來育種的方向。因此，只有提高分子標記尤其是數量性狀相關輔助標記的選擇開發效率，突破復雜性狀遺傳改良的瓶頸，加快分子標記與傳統雜交育種技術相結合，減少與水稻育種過程中的盲目性，提高育種效率，才能解決未來的農業需求。

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2017-04-21

*為通訊作者