洪湖碘泡蟲PCR檢測方法的建立與初步應用

李 丹，柳 陽，翟艷花，顧澤茂

(1.華中農業大學水產學院，武漢 430070；2.淡水水產健康養殖湖北省協同創新中心，武漢 430070；3.農業部淡水生物繁育重點實驗室, 武漢 430070)

洪湖碘泡蟲PCR檢測方法的建立與初步應用

李 丹1, 2, 3，柳 陽1, 2, 3，翟艷花1, 2, 3，顧澤茂1, 2, 3

(1.華中農業大學水產學院，武漢 430070；2.淡水水產健康養殖湖北省協同創新中心，武漢 430070；3.農業部淡水生物繁育重點實驗室, 武漢 430070)

為建立一種靈敏、特異的快速檢測異育銀鯽寄生洪湖碘泡蟲(Myxobolushonghuensis)的方法，本研究根據洪湖碘泡蟲ITS-5.8S rDNA基因序列篩選出一對特異性引物MhF/R，建立PCR檢測方法，對反應條件進行優化，并通過特異性試驗、靈敏性試驗與臨床檢測驗證其可行性。結果顯示，建立的PCR檢測方法能特異性擴增洪湖碘泡蟲相應的基因片段，長度為479 bp，而對試驗中其他9種粘孢子蟲的擴增結果均為陰性；最低能檢測0.1 pg的蟲體基因組DNA。通過臨床樣品檢測，PCR方法比顯微鏡檢測的檢出率提高了19.5%。結果表明，該PCR方法特異、靈敏，適用于洪湖碘泡蟲的快速檢測。

洪湖碘泡蟲(Myxobolushonghuensis)；ITS-5.8S rDNA；PCR檢測；顯微鏡檢測

異育銀鯽(CarassiusauratusgibelioBloch)自上世紀80年代被成功篩選培育，具有生長快、易飼養、抗逆性強等特點，是我國重要的鯽魚養殖品種。隨著異育銀鯽養殖規模的不斷擴大，病害問題日趨嚴重，尤其是粘孢子蟲病，嚴重威脅著異育銀鯽的苗種培育和成魚養殖，已成為制約異育銀鯽產業健康發展的瓶頸因素[1-2]。目前，超過50種粘孢子蟲種類寄生于異育銀鯽[3-7]，危害最嚴重的為異育銀鯽“喉孢子蟲病”的病原體—洪湖碘泡蟲(Myxobolushonghuensis)[5]?；疾◆~體主要表現為喉部紅腫發炎，不食而消瘦，游動遲緩，眼球外凸，鰓絲腫脹，鰓蓋外鼓而無法閉合，易缺氧等。洪湖碘泡蟲病的流行季節為每年5-10月，5-7月為病害高發期，主要流行于湖北、江蘇、沈陽等多個地區，感染率可達60%，死亡率最高可達100%。目前洪湖碘泡蟲的檢測主要以顯微鏡下可見成熟孢子、肉眼可見孢囊為依據，而一旦粘孢子蟲在魚體內形成成熟的孢子或孢囊，藥物很難滲入成熟孢子堅硬的幾丁質外殼。因此，有必要建立一種簡單快速的早期檢測方法，在其營養體階段進行藥物防治，為診斷和預防洪湖碘泡蟲病提供技術支持。

目前，洪湖碘泡蟲的檢測方法主要有三種：(1)以顯微鏡觀察成熟孢子為基礎的形態學檢測方法，雖然操作簡便，但存在檢測滯后、費時費力、效率低、易于漏檢等問題[8]；(2)以抗原與抗體反應為基礎的免疫學檢測方法，雖然具有靈敏性高、能進行早期檢測的特點，但由于粘孢子蟲生活史中存在期、屬特異性抗原以及共同抗原，交叉反應嚴重，增加了種特異性檢測的難度[9-12]；(3)以PCR技術為基礎的分子生物學檢測方法具有較高的特異性與靈敏性，運用最為廣泛[13-16]。賈洛[17]以洪湖碘泡蟲為抗原制備的抗體能與多種粘孢子蟲發生交叉反應；顧偉[18]根據洪湖碘泡蟲的18S rDNA基因建立了巢式PCR方法，靈敏性較高，然而該方法的特異性還有待檢驗。因此，亟需建立一種快速準確、靈敏性高、特異性強的檢測方法。核糖體DNA(rDNA)中的內轉錄間隔區ITS(包括ITS1與ITS2)屬于非編碼序列，所受的選擇壓力較小，進化速度快，具有可變性[19]，常與保守度較高的編碼序列5.8S rDNA共同作為靶標應用于相似物種的區別與鑒定中。本研究以洪湖碘泡蟲的ITS-5.8S rDNA為靶基因篩選了一對特異性引物，建立了針對洪湖碘泡蟲的特異性檢測方法，并初步應用于臨床檢測。

1 材料與方法

1.1 樣品采集與保存

本試驗中使用的洪湖碘泡蟲(M.honghuensis)、吳李碘泡蟲(M.wulii)、丑陋圓形碘泡蟲(M.turpisrotundus)、倪李碘泡蟲(M.nielii)、武漢單極蟲(Thelohanelluswuhanensis)、龜殼單極蟲(T.testudines)、多涅茨尾孢蟲(Henneguyadoneci)、吉陶單極蟲(T.kitauei)、山東碘泡蟲(M.shantungensis)、野鯉碘泡蟲(M.koi)等粘孢子蟲樣本均由本實驗室自行采集與保存。2015年7月從湖北省武漢市東西湖區養殖池塘隨機采集36尾異育銀鯽，體長為3.0～12.4 cm，實驗魚用撒網捕撈，將魚體放入充氧袋運回實驗室，暫養于水族箱中。

1.2 主要試劑

Marker DL2000、Loading Buffer 與PCR體系試劑(10×PCR Buffer(Mg2+free)、Mg2+、dNTP Mixture、Taq DNA聚合酶)均購于寶生物工程有限公司；動物組織基因組DNA提取試劑盒購自康為世紀生物科技有限公司；DNA回收試劑盒購自Omega公司；TA克隆試劑盒(載體pMD19-T)購自寶生物工程有限公司。

1.3 基因組DNA的提取

蟲體基因組DNA的提?。簩嶒炇冶４嬗谝掖贾械膸в姓虫咦酉x孢囊樣品取出，剪取小塊置于干凈的載玻片中，去除多余的宿主組織，室溫放置15-20 min或放入烘箱3-5 min，使乙醇揮發。將組織樣品或孢囊剪碎移入EP管中，充分研磨，再用蒸餾水沖洗、離心，反復幾次得到均勻組織或孢囊溶液備用。將待檢測的樣品移入500 μL細胞裂解液中(100 mol/L氯化鈉，10 mol/L Tris，10 mol/L EDTA，0.2% SDS，1 mg·mL-1蛋白酶K)，55 ℃水浴過夜，使用通用型動物組織DNA提取試劑盒提取蟲體的基因組DNA，具體步驟按照試劑盒的說明書進行，提取后的DNA置于-20 ℃冰箱保存備用。

檢測樣品基因組DNA的提?。悍謩e剪取每尾異育銀鯽的皮膚、鰓、咽及肝胰臟的部分組織，共約50 mg，混合在一起，置于研缽中，剪碎并加入液氮充分研磨，然后采用動物組織基因組DNA提取試劑盒提取樣品的總DNA，提取后的DNA置于-20 ℃冰箱保存備用。

1.4 引物篩選

通過比對與分析各粘孢子蟲的ITS1-5.8S-ITS2基因序列，利用Primer 5.0軟件根據洪湖碘泡蟲的ITS1與ITS2基因的差異序列分別設計上游與下游引物，其中，上游引物MhF：5’-TGATCATTGTGTGTTCATCAAGTC-3’，下游引物MhR：5’-TCGTAAAAATGACCTCTACTTTATAC-3’，擴增目的片段長度為479 bp。引物由武漢奧科鼎盛生物科技有限公司合成。

1.5 PCR反應條件優化

1.5.1 退火溫度的優化

以洪湖碘泡蟲蟲體基因組DNA為模板進行溫度梯度試驗，設定溫度梯度為：55 ℃、56 ℃、57 ℃、58 ℃、59 ℃、60 ℃，分別進行PCR擴增，確定引物的最佳退火溫度。

1.5.2 Mg2+濃度的優化

以洪湖碘泡蟲蟲體基因組DNA為模板進行Mg2+濃度梯度試驗，設定Mg2+終濃度為：0.5 mol/L、1.0 mol/L、1.5 mol/L、2.0 mol/L、2.5 mol/L、3.0 mol/L、3.5 mol/L、4.0 mol/L，分別進行PCR擴增，確定Mg2+的最佳濃度。

1.5.3 循環數的優化

以洪湖碘泡蟲蟲體基因組DNA為模板進行PCR循環數梯度試驗，設定PCR循環數為：25循環、30循環、35循環、40循環，分別進行PCR擴增，確定反應最佳循環數。

1.6 特異性試驗

根據優化后的反應體系與條件，以洪湖碘泡蟲、吳李碘泡蟲、丑陋圓形碘泡蟲、倪李碘泡蟲、武漢單極蟲、龜殼單極蟲、多涅茨尾孢蟲、吉陶單極蟲、山東碘泡蟲、野鯉碘泡蟲及健康異育銀鯽的DNA作為模板，同時以滅菌ddH2O為模板作為空白對照進行PCR擴增，檢測該方法的特異性。

1.7 靈敏性試驗

將洪湖碘泡蟲的蟲體DNA經10倍倍比稀釋，分別得到8個不同濃度的DNA(10、1、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6ng/μL)，每個反應同時加入100 ng宿主DNA，以稀釋后的不同濃度的粘孢子蟲DNA與宿主DNA的混合物作為模板，以滅菌ddH2O為模板作為空白對照，用篩選的引物進行PCR擴增，檢測該方法的靈敏性。

1.8 臨床樣品檢測

利用顯微鏡鏡檢法與PCR方法同時對36份樣品進行洪湖碘泡蟲的檢測。顯微鏡檢測：刮取魚體皮膚粘液，提取魚體鰓、咽、肝臟部分組織進行壓片觀察，計算洪湖碘泡蟲成熟孢子的檢出率。PCR檢測：按照優化后的PCR反應體系與條件對樣品進行PCR檢測，根據目的條帶大小判定結果；擴增之后，隨機抽取三個陽性樣品，切膠回收，純化PCR產物，參照pMD19-T克隆試劑盒的操作步驟對目的DNA片段進行連接與轉化。經過PCR篩選得到陽性克隆，將陽性克隆菌液送往武漢奧科鼎盛生物科技有限公司進行測序。測定的序列經人工校對、拼接并確認無誤之后，在NCBI網站中進行序列比對，進一步驗證檢測結果。

2 結果與分析

2.1 PCR反應優化結果

PCR反應的優化結果見圖1。退火溫度在55～60 ℃范圍內，PCR擴增產物的條帶都比較亮，無明顯差異，而引物的退火溫度為57 ℃，因此選擇57 ℃為最佳退火溫度(圖1)。Mg2+濃度在1.0～2.5 mol/L范圍內，擴增條帶較亮，綜合考慮擴增效果與試劑成本，最終選擇1.5 mol/L為最佳Mg2+濃度(圖2)。循環數為30、35、40時，擴增條帶清晰明亮，綜合考慮擴增效果與試驗時間，最終選擇35次作為最佳循環數(圖3)。綜上，優化后的PCR反應體系為：DNA擴增模板50 ng，10×PCR Buffer 2.5 μL，Mg2+1.5 mol/L，dNTPs 1.0 mol/L，TaqDNA聚合酶1 U，Mh F/R各200 nM，滅菌ddH2O補足至25 μL；反應條件為：95 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，35個循環；72 ℃延伸7 min，4 ℃保存。

圖1 退火溫度優化Fig.1 Optimization of annealing temperatureM: DNA分子質量標準; 1～6: 退火溫度依次為55 ℃, 56 ℃, 57 ℃, 58 ℃, 59 ℃, 60 ℃; 7: 空白對照.

圖2 鎂離子濃度優化Fig.2 Optimization of MgCl2 concentrationM: DNA分子質量標準; 1～8: 鎂離子濃度依次為0.5 mol/L,1.0 mol/L, 1.5 mol/L, 2.0 mol/L, 2.5 mol/L, 3.0 mol/L, 3.5 mol/L, 4.0 mol/L; 9: 空白對照.

圖3 循環數優化Fig.3 Optimization of cycle numberM:DNA分子質量標準;1～5:循環數依次為20, 25, 30, 35, 40次;6:空白對照.

2.2 特異性試驗

瓊脂糖凝膠電泳結果顯示，只有以洪湖碘泡蟲DNA為模板才能擴增出單一的目的條帶，而其他的粘孢子蟲均無條帶擴增(圖4)，說明建立的洪湖碘泡蟲PCR檢測方法特異性良好。

圖4 PCR特異性試驗Fig.4 The specificity test of PCRM: DNA分子質量標準;1: 洪湖碘泡蟲;2: 吳李碘泡蟲;3: 丑陋圓形碘泡蟲;4: 倪李碘泡蟲;5: 武漢單極蟲;6: 龜殼單極蟲;7: 多涅茨尾孢蟲;8: 吉陶單極蟲;9: 山東碘泡蟲;10: 野李碘泡蟲;11: 健康鯽魚;12: 空白對照.

2.3 試驗的靈敏性

瓊脂糖凝膠電泳結果顯示，在宿主DNA干擾的情況下，洪湖碘泡蟲模板濃度為10-4ng(0.1 pg)時仍能擴增出條帶，因此，確定建立的PCR方法對洪湖碘泡蟲最低檢測限為0.1 pg，靈敏性試驗結果見圖5。

圖5 PCR靈敏性試驗Fig.5 The sensitivity test of PCRM: DNA分子質量標準; 1～8分別為10, 1, 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5, 10-6 ng洪湖碘泡蟲DNA + 100 ng宿主DNA; 9: 空白對照.

2.4 臨床初步應用

利用顯微鏡鏡檢法與PCR方法同時對采集的36份樣品進行洪湖碘泡蟲的臨床檢測，結果顯示顯微鏡鏡檢法檢測洪湖碘泡蟲成熟孢子(圖6)的陽性檢出率為22.2 %(8/36)，PCR方法檢測洪湖碘泡蟲的陽性檢出率為41.7%(15/36)，比鏡檢法的高19.5個百分點。隨機抽取的三個陽性擴增產物與洪湖碘泡蟲的ITS-5.8S rDNA基因序列的相似度為99.6%～99.9%，表明建立的PCR檢測方法實用性強，可用于異育銀鯽寄生洪湖碘泡蟲的臨床檢測。

圖6 洪湖碘泡蟲成熟孢子, 標尺=10 μm.Fig.6 Photomicrograph of mature spores of M. honghuensis, scale bar =10 μm.

3 討論

在粘孢子蟲的早期分子檢測中，18S rDNA是運用最為廣泛的分子標記[20-23]，然而，18S rDNA序列比較保守，在同屬近緣種類間相似度較高，難以區分。其中，洪湖碘泡蟲與吳李碘泡蟲的18S rDNA相似度就高達93%，差異堿基分布分散，難以根據其18S rDNA基因進行區別鑒定，因此迫切需要尋找其他合適的分子靶標。ITS是介于核糖體DNA上18S、5.8S、28S 基因之間的一段高度可變區域，具有種間變異與種內穩定的特點[24]，已作為一種有效的分子標記被廣泛運用于寄生蟲近緣物種的分子檢測中，但在粘孢子蟲檢測方面運用較少，目前只有Woo 等[25]利用ITS基因對感染鯉腸道的單極蟲T.kitauei與T.hovorkai進行了有效的區別與鑒定。通過序列比對與分析，發現洪湖碘泡蟲的ITS包含較多的差異序列，因此，本研究選擇洪湖碘泡蟲的ITS為靶基因建立了PCR檢測方法。

在建立PCR檢測方法的過程中，引物的篩選至關重要。特異性試驗中只有洪湖碘泡蟲擴增出單一目的條帶，而其他粘孢子蟲種類的擴增結果呈陰性，證明篩選的引物特異性良好。靈敏性試驗中，在宿主DNA的干擾下，檢測靈敏度仍達到了pg級檢測水平，說明該方法的靈敏性較高。一般PCR方法的靈敏性試驗僅僅用寄生蟲的蟲體基因組DNA為模板檢測，而忽略了宿主DNA的干擾，是一種分析靈敏性試驗，而本研究在每個反應中加入一定量的宿主DNA，結果更接近實際的診斷靈敏性。許多研究表明，PCR檢測方法比傳統顯微鏡鏡檢方法的靈敏性更高[13, 14]，本研究以這兩種方法對實際樣品進行檢測與比較，結果發現PCR方法的陽性檢出率比鏡檢高19.5百分點，表明PCR的靈敏性更高。由于粘孢子蟲的營養體形態多種多樣，且易與魚體組織結構相混淆[11]，因此本研究以觀察到成熟孢子為標準計算檢出率，但檢測結果會低于實際的感染率。在顯微鏡檢測中，有1個樣品的檢測結果為陽性，能觀察到成熟的孢子，但數量較少，而對應的PCR檢測呈陰性，類似的現象在國外粘孢子蟲的檢測中也有過相關的報道[22]。另外，三個隨機樣品的測序結果表明該方法的準確性高，適用于洪湖碘泡蟲的臨床診斷。

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(責任編輯：張瀟峮)

Development and preliminary application of PCR method for the detection of Myxobolus honghuensis (Myxosporea: Bivalvulida)

LI Dan1,2,3, LIU Yang1,2,3, ZHAI Yan-hua1,2,3, GU Ze-mao1,2,3

( 1.DepartmentofAquaticAnimalMedicine,CollegeofFisheries,HuazhongAgriculturalUniversity,Wuhan430070,China;2.FreshwaterAquacultureCollaborativeInnovationCenterofHubeiProvince,Wuhan430070,China; 3.KeyLabofFreshwaterAnimalBreeding,MinistryofAgriculture,Wuhan430070,China)

To establish a sensitive, specific and rapid method for detection ofMyxobolushonghuensisinfecting allogynogenetic gibel carpCarassiusauratusgibelio(Bloch), a single PCR method was developed with primers MhF/R targeting on its ITS-5.8S rDNA gene. After optimizating the reaction condition and system, a series of experiments on specificity and sensitivity were conducted. Additionally, 36 field samples were tested by the established PCR and microscopic examination. The results showed that the developed PCR method was specific to amplify a 479 bp fragment using genomic DNA fromM.honghuensiswith a detection limit of 0.1 pg, and no cross-reactions with other 9 myxosporean species tested. The clinical detection rate was 19.5% higher than that of microscopic examination. The results suggest that the present PCR method is an efficient approach for molecular detection ofM.honghuensisbecause of its specificity and sensitivity.

Myxobolushonghuensis; ITS-5.8S rDNA; PCR detection; microscopic examination

2016-05-22；

2016-09-21

國家自然科學基金項目(31572233)

李 丹(1991- )，女，碩士，專業方向為水生動物醫學。E-mail: liyidan1991@163.com

顧澤茂。E-mail: guzemao@mail.hzau.edu.cn

S917

A

1000-6907-(2017)01-0012-05