三角帆蚌熱休克蛋白70基因克隆及其表達分析

吳圣楠隗黎麗李海軍付建平劉 毅

(1. 江西師范大學生命科學學院, 南昌 330022; 2. 江西農業大學動物科學學院, 南昌 330045)

三角帆蚌熱休克蛋白70基因克隆及其表達分析

吳圣楠1隗黎麗2李海軍1付建平1劉 毅1

(1. 江西師范大學生命科學學院, 南昌 330022; 2. 江西農業大學動物科學學院, 南昌 330045)

對三角帆蚌HSP70基因序列進行全長克隆及其分子生物學分析, 并檢測其在不同水溫刺激下鰓組織中的表達變化。通過高通量轉錄組測序獲得三角帆蚌HSP70基因(HcHSP70)長片段, 采用3′ RACE對其進行了3′末端克隆, 經拼接得到HcHSP70 cDNA全長序列。采用多種分子生物學軟件對HcHSP70 cDNA全長序列進行了特征分析, 采用實時熒光定量PCR技術檢測了其組織分布, 并結合Western-blot技術檢測蚌鰓中該基因mRNA與蛋白經不同水溫刺激后的表達變化。結果顯示, HcHSP70 cDNA全長為2298 bp, 其中開放閱讀框為1974 bp, 編碼657個氨基酸。預測分子量大小為71.6 Ku, pH7.0時的理論等電點為5.61。氨基酸序列分析表明, HcHSP70氨基酸序列含HSP70家族的3個標簽序列(I9DLGTTYS16、I197FDLGGGTFDVSIL210和I336VLVGGSTRIPKVQK350), 與長牡蠣及泥蚶的HSP70同源性最高(91%)。實時熒光定量PCR檢測結果顯示, HcHSP70在鰓、性腺、肝胰腺、外套膜及肌肉等5種被檢組織中均有表達, 以肝胰腺中的表達水平最高。實時熒光定量PCR與Western-blot技術檢測皆表明, 蚌鰓組織中HcHSP70基因與蛋白的表達量在37℃時達到最高, 而在40℃水溫刺激下表達水平下調至正常值, 表明其在適應高溫刺激時發揮了重要作用。

三角帆蚌; 熱休克蛋白70; 序列分析; 基因表達; 水溫刺激

熱休克蛋白家族(Heat shock proteins, HSPs)是一類應激反應性蛋白, 通常作為危險信號以提高機體適應熱的能力及對抗多種壓力刺激。在感染、缺氧、饑餓和缺水等條件刺激下也能誘導出該蛋白, 故也稱之為熱應激蛋白[1]。HSPs結構高度保守,通常執行管家基因功能和保護功能, 包括細胞骨架保護、免疫調節、抑制細胞凋亡等多種功能[2,3]。根據相對分子量大小, HSPs成員分為4個主要家族: HSP90、HSP70、HSP60及小HSP家族[4]。研究表明, HSP70家族分子在幫助機體細胞應對各種不利環境中起關鍵作用[5,6]。HSP70具備分子伴侶功能, 可幫助細胞內多肽保持未折疊狀態, 保障其順利通過內質網或線粒體膜, 以實現蛋白質的正確組裝[7]。作為熱休克蛋白家族中最保守的蛋白, HSP70廣泛存在于各種生物體內, 迄今已從植物[8]、動物[9]及微生物[10]體內成功克隆出HSP70基因的全長。

無脊椎軟體動物缺少獲得性免疫系統, 其對外界感染的防御只能基于先天免疫系統來識別異己分子, 最終實現機體的自我保護[11,12]。為抵御外界不利環境脅迫, 軟體動物體內的HSP70分子所發揮的免疫保護作用十分關鍵。迄今已成功從合浦珠母貝(Pinctada martensii)[13]、南極帽貝(Laternula elliptica)[14]及福壽螺(Pomacea canaliculata)[9]等多種軟體動物中克隆出HSP70全長序列。

三角帆蚌(Hyriopsis cumingii)是我國最重要的淡水育珠蚌, 其培育的珍珠產量占淡水育珠產量的95%以上[15]。近年來由于病害影響, 給我國淡水育珠業造成了重大經濟損失。深入開展三角帆蚌HSPs分子的分子生物學研究, 將有助于其病害防治。在之前的工作中, 作者曾報道三角帆蚌熱休克蛋白60的相關研究[16]。本文將對三角帆蚌HSP70基因序列進行全長克隆及其分子生物學分析, 并檢測其在不同水溫刺激下鰓組織中的表達變化。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究所用三角帆蚌購自南昌市人民公園菜市場, 長度為(14.5±0.5) cm。洗凈后暫養于盛有曝氣自來水的水族箱(100 cm×60 cm×45 cm)中。使用充氣泵充氣飼養, 每天換水1次, 暫養1周確認蚌體健康無病后開始實驗。三角帆蚌飼養條件同文獻[16]。

1.2 總RNA的提取及cDNA第一鏈合成

使用Invitrogen公司的Trizol試劑盒提取總RNA, 操作過程中所用琉璃器皿及金屬器械經180℃高溫烘烤6h以上使RNase徹底失活, 使用Thermo公司的無RNase離心管及槍頭, 具體總RNA提取過程參考試劑盒的操作說明進行。

以提取的RNA為模板, 使用Oligo-dT為逆轉錄引物及Clontech公司Power-ScriptTMReverse Transcriptase合成cDNA第一鏈, cDNA合成按TaKaRa Prime-ScriptTMReverse Transcriptase Kit操作手冊進行。

1.3 HcHSP70 cDNA全長的獲得

由轉錄組高通量測序獲得始于HcHSP70 cDNA 5′末端的一段長序列(2298 bp), 轉錄組測序工作由北京貝瑞和康生物技術有限公司完成。根據此序列,采用SMARTerTMRACE cDNA Amplification Kit試劑盒(BD, Biosciences Clontech)獲得該基因的3′端序列。根據已知的局部HSP70 cDNA序列設計出兩條正向引物HSP70F1和HSP70F2 (表 1)。

首先使用逆轉錄酶SMARTScribeTMReverse Transcriptase和引物3′CDS primer A對總RNA進行逆轉錄合成cDNA, 使用試劑盒中的Long引物和Short引物, 按比例1∶3混合為通用引物UPM。使用引物HSP70-F1和UPM, 以上面合成的cDNA為模板進行第一輪PCR擴增; 將第一輪PCR擴增產物稀釋50倍, 然后用引物HSP70F2和UPM進行第二輪PCR擴增, 將第二輪PCR產物進行電泳并用Tiangen公司的瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收cDNA目的片段后對目的條帶進行切膠回收純化, 純化后的PCR產物連接到pMD18-T克隆載體上, 轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞, 經檢測后挑取陽性克隆測序,最后進行全長序列拼接, 得到HcHSP70 cDNA全長序列。用于HcHSP70基因擴增與表達的引物見表 1。

表 1 用于HcHSP70擴增和表達的引物Tab. 1 Primers used in amplification and expression of HcHSP70

1.4 HcHSP70基因序列分析與系統進化樹構建

使用NCBI上的BLAST (http://www.ncbi.nlm. gov/BLAST/)進行核苷酸及氨基酸序列分析。利用ExPASy (http://expasy.pku.edu.com)上軟件分析HcHSP70氨基酸序列與開放閱讀框(ORF); 采用NCBI BLASTp進行序列同源基因搜索。采用Clustal W 2.1和Mega 5.0軟件比較HcHSP70與其他物種HSP70氨基酸序列同源性, 使用鄰接法(N-J法)構建基于氨基酸序列的系統進化樹, 并采用自展法對其可靠性進行分析驗證(1000個假重復數)。用于氨基酸比對和進化樹構建的基因名稱及其 GenBank序列登錄號見表 2。

1.5 HcHSP70 mRNA在不同組織中的表達

從暫養蚌的水族箱中選取3個蚌, 取鰓(Gi)、性腺(Go)、肝胰腺(He)、外套膜(Ma)及肌肉(Mu)等5種組織, 用Trizol法提取總RNA, 用紫外分光儀(UV-5100)測定濃度并統一稀釋至100 ng/μL, 各取2 μL反轉錄成cDNA, 利用實時熒光定量PCR技術檢測室溫下(25℃) HcHSP70在三角帆蚌不同組織中的表達。

HcHSP70各個樣本的cDNA使用BIO-RAD CFX系統(Bio-Rad)進行實時熒光定量PCR擴增。根據已獲得的HcHSP70 cDNA全長, 設計出特異引物HSP70-F和HSP70-R(表 1), 用于擴增出HcHSP70基因3′端99 bp的片段。根據三角帆蚌β-actin基因(HM045420.1)設計出可得到129 bp的內參β-actin基因的引物β-actin F和β-actinR(表 1)。優化后的反應體系為: Real Master Mix SYBR Green 9 μL, 各引物0.5 μL, 50× ROX Reference Dye 0.5 μL, cDNA 1 μL,去離子水8.5 μL。擴增條件為: 95℃預變性3min, 95℃ 10s, 55℃ 20s, 72℃ 20s, 40個循環; 末次延伸72℃, 5s; 在每個循環的延伸階段同步多次采集熒光。PCR擴增結束后立即進行熔解曲線分析, 以驗證擴增的特異性。從65℃上升到95℃保持增長速度為0.5 ℃/s。各樣品均設置3次重復。

1.6 鰓組織HcHSP70在不同水溫刺激后的表達變化

實時熒光定量PCR將蚌分成6組(每組放置3個), 分別于25℃(對照組), 28℃、31℃、34℃、37℃及40℃水溫放置2h, 正常水溫下恢復1h后取其鰓組織。Trizol法提取各組織的總RNA, 利用實時熒光定量PCR法檢測HcHSP70基因水平在鰓組織中的表達變化, PCR擴增條件同1.5, 選擇三角帆蚌β-actin作為內參基因。所用引物見表 1。

Western blot利用Western blot技術檢測鰓組織中HcHSP70蛋白在不同水溫刺激后的表達變化。取-80℃凍存的鰓組織, 加入裂解緩沖液(1.0% NP-40 in 50 mmol/L Tris-HCl, 50 mmol/L EDTA, 1 mmol/L PMSF)冰上勻漿。勻漿后冰上靜置30min后4℃, 12000 r/min離心30min, 離心分離掉不溶性細胞碎片收集上清, 制得蛋白樣品。使用SDS-PAGE凝膠制備試劑盒(金斯瑞, 南京)采用10% SDS-PAGE凝膠體系將蛋白樣品電泳分離, 再將蛋白轉移至PVDF膜。然后使用5%脫脂奶粉封閉2h, 加入HSP70一抗(1∶1000, 金斯瑞) 4℃孵育過夜。HSP70一抗所用的免疫原為多肽, 肽與KLH的偶聯物, 序列為CHMKSTVEDQNLKDK。使用TBST (TBST: 0.1% Tween-20, 50 mmol/L Tris-HCl, 200 mmol/L NaCl)洗膜三次, 每次5—10min。然后加入羊抗兔HRP二抗(1∶5000, 金斯瑞)室溫孵育1h, TBST漂洗后, 使用NBT/BCIP避光顯色, 使用Chemi Doc XRS(BIO-RED, 美國)自動曝光采集Western雜交圖像。以β-actin蛋白作為內參蛋白, 實驗過程與HSP70相同。

1.7 數據分析

熒光定量實驗獲得的數據使用比較Ct方法, 根據熒光曲線的Ct值以及標準曲線使用SPSS 15.0進行單因素方差分析, P＜0.05 (*)。

2 結果

2.1 HcHSP70 cDNA全長及推導的氨基酸序列特征

通過3′RACE-PCR拼接得到三角帆蚌HSP70基因cDNA(GenBank登錄號: AHN82525.1)的全長為2298 bp, 其中5′端非翻譯區76 bp, 3′端末端248 bp,有典型的加尾信號(AATAAA)和PolyA尾巴。該基因開放閱讀框為1974 bp, 編碼657個氨基酸, 預測分子量大小為71.6 Ku, 當pH為7.0時的理論等電點為5.61。

HcHSP70氨基酸序列含有三個HSP70家族典型的標簽序列: 9—16 (IDLGTTYS), 197—210 (IF DLGGGTFDVSIL)以及336—350 (IVLVGGSTRIP KVQK)。并且具有ATP酶結構域131—137 (AEAY LGK)以及雙向核定位信號246—262 (KRKHKR DMKDNKRAVRR), 該信號位點可能涉及HcHSP70選擇性易位進入核仁中。同時發現縮氨酸結合位點299—305 (RARFEEL), 兩個糖基化位點360—363 (NKSI)和487—490 (NVSA), 以及其他典型的重復位點GGXP在 622—633的位置上。此外, 高保守的細胞質HSP70羧基末端保守區域EEVD位于654—657位氨基酸上。

多重比對結果證明HcHSP70符合HSP70s所有特征。使用SignalP 4.0預測HcHSP70無信號肽, TMHMM預測HcHSP70無跨膜區。

2.2 HcHSP70序列同源性及系統進化樹

通過BLAST同源搜索, 發現推導出的三角帆蚌HSP70的氨基酸序列與其他物種相應的序列顯示出較高的親緣性。從基因庫中選取13個物種的HSP70或HSC70氨基酸序列, 分別來自軟體動物:長牡蠣(Crassostrea gigas)、泥蚶(Tegillarca granosa)、海灣扇貝(Argopecten irradians)和櫛孔扇貝(Azumapecten farreri), 脊索動物: 草魚(Ctenopharyngodon idella)與銅魚(Coreius guichenoti), 節肢動物: 二化螟(Chilo suppressalis)、小地老虎(Agrotis ipsilon)與豆髯須夜蛾(Hypena tristalis), 哺乳動物:小家鼠(Mus musculus)、綿羊(Ovis aries)與人(Homo sapiens), 扁形動物: 三角渦蟲(Dugesia japonica)。比對結果顯示HcHSP70與長牡蠣和泥蚶同源性最高, 達到91%, 而與人的同一性最低, 僅為33%。通過鄰接法構建HcHSP70系統進化樹發現, HcHSP70與4種軟體動物(長牡蠣、泥蚶、海灣扇貝和櫛孔扇貝)聚為一支(圖 1)。

2.3 HcHSP70組織表達

使用實時熒光定量PCR分析HcHSP70 mRNA在不同組織間特異性地表達情況, 結果表明在室溫條件下HcHSP70 mRNA在全部5種被檢組織中均有表達, 以肝胰腺中的表達水平最高, 其次為性腺, 而在鰓、外套膜及肌肉等3種組織中相對較低(圖2)。

2.4 在不同水溫刺激下鰓HcHSP70 mRNA及其蛋白的表達變化

經不同水溫刺激2h后, 鰓HcHSP70基因表達量隨水溫上升出現上調, 相比對照組(25℃), 28℃、31℃、34℃水溫刺激后分別出現1.8倍、2.0倍及2.2倍上調(圖 3a)。而當刺激水溫為37℃時, HcHSP70基因表達量急劇上升, 為對照組的14.4倍, 顯著高于其他溫度。水溫為40℃時, 其表達量又急劇下降, 僅為對照組的2.3倍。

圖 1 HSP70基因系統進化樹Fig. 1 Phylogenetic tree based on HSP70 gene使用ClustalW 2.1軟件進行序列比對, MEGA 5.0按鄰接法構建系統進化樹, 結點處數值代表1000評估的自舉檢驗置信度Full-length amino acid sequences were aligned using ClustalW 2.1 and a phylogenetic tree was constructed using Neighbor-Joining algorithm with MEGA 5.0 (1000 bootstrap)

圖 2 HcHSP70在三角帆蚌不同組織中的表達Fig. 2 The expression of HcHSP70 in different tissues of H. cumingiiqRT-PCR法檢測HcHSP70在鰓(Gi)、性腺(Go)、肝胰腺(He)、外套膜(Ma)及肌肉(Mu)5種組織中的相對表達, 以β-actin作內參qRT-PCR was performed to detect the expression of HcHSP70 in 5 different tissues including gonad (Go), gill (Gi), hepatopancreas (He), mantle (Ma) and muscle (Mu). β-actin was used as an inner control to normalize the samples

Western blot檢測結果也顯示, 當刺激水溫為37℃時, HcHSP70蛋白表達量達到最高, 明顯高于其他水溫刺激后的表達量(圖 3b)。

3 討論

HSP70作為熱休克蛋白家族中最保守的蛋白廣泛存在于各種生物體內[17]。以貝類動物為例, 合浦珠母貝[13]、南極帽貝[14]、福壽螺[9]等物種HSP70分別編碼652、653和653個氨基酸。本研究克隆得到的三角帆蚌HSP70基因開放閱讀框為1974 bp, 編碼657個氨基酸, 與貝類其他物種十分接近。序列分析結果顯示, HcHSP70含有HSP70家族的典型標簽序列, 包括: 3個保守簽名序列(IDLGTTYS、IFD LGGGTFDVSIL、IVLVGGSTRIPKIQK)、ATPase功能域、底物肽結合結構域、C末端區域存在3個連續重復的4肽序列和EEVD序列以及其他HSP家族特征性功能結構域[18—20]。同源性分析表明, HcHSP70與其他軟體動物HSP70基因具有很高的同源性, 與泥蚶和長牡蠣同一性最高, 達91%, 而與人HSP70同一性僅為33%。在系統發育樹中, 脊椎動物、軟體動物及節肢動物HSP70s序列各自分開并形成可信度較高的簇, HcHSP70與其他4種軟體動物HSP70(長牡蠣、泥蚶、海灣扇貝和櫛孔扇貝)聚為一支, 可以確認本研究所獲序列為HSP70家族成員。

圖 3 三角帆蚌鰓組織中HcHSP70經不同水溫刺激后的表達變化Fig. 3 Expression of HcHSP70 under different water temperaturea. 實時熒光定量qRT-PCR方法檢測三角帆蚌鰓組織中Hc-HSP70經6種不同水溫刺激后的表達變化, 刺激水溫分別為25、28、31、34、37及40℃。以β-actin作為內參。星號(*)表示熱激后HcHSP70 mRNA相對表達量顯著高于對照組(25℃) (P＜0.05)(n=3); b. Western blot法檢測三角帆蚌鰓組織中Hc-HSP70蛋白經不同水溫刺激后的表達變化, 以β-actin蛋白作為內參a. qRT-PCR was performed to detect the expression of HcHSP70 in 6 different temperature of gill (Gi) from H. cumingii under 25, 28, 31, 34, 37 and 40℃. β-actin was used as an internal control to normalize the samples. The asterisks indicate the values which were significantly different from control (P＜0.05); b. Expression of the HcHSP70 protein in response to high temperature detected by Western blot. The intensities of HcHSP70 protein bands were normalized against the β-actin protein

盡管HSP70廣泛存在于各類生物體內, 但各物種HSP70的表達具有組織特異性。近江牡蠣HSP70在外套膜、鰓、消化腺、肌肉及心臟中均有表達,在肌肉中表達量最高[21]。褶紋冠蚌HSP70在鰓組織中的表達量較高, 其次是肌肉[22]。本研究發現HcHSP70在不同組織中也均有表達, 而以肝胰腺中的表達最高, 其次是性腺, 而在鰓、外套膜及肌肉中的表達量較低(圖 2)。此結果與縊蟶Hsc70的組織表達情況相似[23]。

作為一種應激蛋白, HSP70可幫助生物體迅速適應環境變化以抵御外界不良損害[4]。曲凌云等檢測到熱刺激可使櫛孔扇貝鰓組織中HSP70表達明顯升高, 而在肌肉、外套膜及性腺組織中未檢測到變化[24]。此外, 鰓組織因與水環境直接接觸, 對水溫變化較為敏感, 更容易發生熱休克反應[25]。本研究利用實時熒光定量PCR和Western-blot技術從mRNA和蛋白質水平分別檢測不同溫度刺激對三角帆蚌鰓組織中HSP70表達的影響。結果顯示, 鰓組織中HcHSP70表達量隨水溫上升而上調, 且當刺激水溫度到達37℃時, HcHSP70 mRNA和蛋白表達量皆急劇上升(圖 3)。此結果與其他研究類似, 雄性福壽螺PcHSP70也在39℃水溫刺激下表達量最高[26]。而牡蠣的鰓與外套膜組織中HSP70表達量在35℃時即達到最高[27]。

值得注意的是, 當刺激水溫達到40℃時, HcHSP70 mRNA和蛋白的表達量又急劇下降并恢復至正常水平。此結果與西伯利亞鱘[25]、福壽螺[26]和牡蠣[27]等物種HSP70的研究結果相似, 當刺激水溫不斷升高時HSP70表達量都出現先上升后下降的現象。推測較高水溫刺激下的三角帆蚌機體內與HcHSP70相關的免疫應答水平也受到極大的抑制,具體機制有待于進一步深入研究。

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CLONING AND EXPRESSION ANALYSIS OF HEAT SHOCK PROTEIN 70 GENE FROM HYRIOPSIS CUMINGII

WU Sheng-Nan1, WEI Li-Li2, LI Hai-Jun1, FU Jian-Ping1and LIU Yi1
(1. College of Life Sciences, Jiangxi Normal University, Nanchang 330022, China; 2. College of Animal Science and Technology, Jiangxi Agricultural University, Nanchang 330045, China)

In the present study, the cDNA sequence of Hyriopsis cumingii HSP70 (HcHSP70) was cloned by 3′rapid amplification of cDNA ends methods (3′-RACE) based on a long chain sequence of HcHSP70 and it was determined by high flux sequencing for transcriptome of H. cumingii blood cells, and its expression in the different tissues was detected with quantitative real time polymerase chain reaction (qRT-PCR). Results showed that the full-length of HcHSP70 cDNA was 2298 bp long including a 1974 bp open reading frame (ORF) encoding a polypeptide of 657 amino acids that estimated molecular mass of 71.6 Ku and an isoelectric point of 5.67. Sequence comparison indicated that HcHSP70 shares the highest identity (91%) with HSP70 of Tegillarca granosa and Crassostrea gigas. HcHSP70 mRNA expressed in all 5 detected tissues (hepatopancreas, gonad, gill, mantle, muscle) with the highest expression in hepatopancreas. Both mRNA and protein level of HcHSP70 in gill significantly up-regulated at 37℃ and rapidly reduced to normal level under 40℃.

Hyriopsis cumingii; Heat shock protein 70; Cloning; Gene expression; Thermal stress

Q344+.1; S917

A

1000-3207(2017)01-0050-06

10.7541/2017.7

2016-02-01;

2016-06-20

國家自然科學基金項目(31060359); 江西省自然科學基金(20122BAB204017)資助 [Supported by the National Natural Science Foundation of China (31060359); the Natural Science Foundation of Jiangxi Province (20122BAB204017)]

吳圣楠(1992—), 女, 江西鷹潭人; 碩士研究生; 主要從事分子免疫學研究。E-mail: wusn2013@163.com

劉毅, E-mail: yiliusan@sina.com