斑馬魚IRF11基因的鑒定、亞細胞定位及表達特征

熊亞瑋張義兵桂建芳

(1. 中國科學院水生生物研究所, 淡水生態與生物技術國家重點實驗室, 武漢 430072; 2. 中國科學院大學, 北京 100049)

斑馬魚IRF11基因的鑒定、亞細胞定位及表達特征

熊亞瑋1,2張義兵1桂建芳1

(1. 中國科學院水生生物研究所, 淡水生態與生物技術國家重點實驗室, 武漢 430072; 2. 中國科學院大學, 北京 100049)

早期的研究表明IRF11是魚類特有的IRF家族成員。查詢最近解析的斑馬魚第九版基因組時, 發現斑馬魚IRF1和IRF11命名出現了混亂。通過對脊椎動物IRF1和IRF11基因位點進行同線型分析表明, IRF11與IRF1是兩個不同的基因, 不宜命名為IRF1b和IRF1a。系統進化樹分析發現, 在脊椎動物中IRF11基因比IRF1起源更早; 兩棲類以后的脊椎動物基因組只有IRF1, 沒有IRF11, 其中原因可能是因為基因丟失。斑馬魚IRF11與脊椎動物IRF1一樣, 其表達蛋白定位在細胞核中。缺失分析揭示斑馬魚IRF11的DBD有一個能引導蛋白定位進入細胞核的序列。表達分析發現poly (I:C)能誘導斑馬魚IRF11的表達, 但其表達水平低于IRF1。

斑馬魚; IRF11; 亞細胞定位; 表達

干擾素調節因子(Interferon regulatory factor, IRF)是一種轉錄因子[1]。脊椎動物有一個保守的IRF家族, 功能研究證實部分家族成員能直接調控干擾素基因的表達[2]。哺乳類IRF家族有9個成員(IRF1-9), 系統進化樹分析可以分為4個亞家族: IRF1亞家族(IRF1和IRF2)、IRF3亞家族(IRF3和IRF7)、IRF4亞家族(IRF4、IRF8、IRF9), 還有IRF5亞家族(IRF5和IRF6)[2]。所有的IRF蛋白都有兩個保守的結構域, N端的DBD(DNA-binding domain)和C端的IAD (IRF association domain)[3—6]。魚類基因組解析發現魚類不僅有保守的IRF1-9, 而且還有IRF10和IRF11[7]。IRF10在鳥類中也有發現, IRF11僅在魚類基因組中存在, 因此是魚類特有的IRF家族成員[7]。IRF蛋白定位與其功能有關[5,6]。如魚類IRF3/7與病毒誘導干擾素表達有關, 在正常細胞中, IRF3/7位于細胞質, 但是病毒感染能激活IRF3/7導致其從細胞質轉移到細胞核發揮轉錄因子功能[5]。魚類IRF1位于細胞核[4,6], 斑馬魚IRF1差異誘導不同干擾素基因的表達[6]。鑒于IRF1/3/7的功能, 魚類IRF1/3/7都是病毒或干擾素誘導表達基因[3—5]。然而, 斑馬魚基因組數據庫(version 9)顯示斑馬魚有兩個IRF1基因, 分別命名為IRF1a (ENSDARG000 00043492)和IRF1b (ENSDARG00000032768)。本文通過基因線性分析和系統進化樹分析證實斑馬魚IRF1a應該是IRF11, 而IRF1b則是IRF1。隨后研究了斑馬魚IRF11的亞細胞定位和表達特征。

1 材料與方法

1.1 細胞

斑馬魚肝臟細胞(Zebrafish liver cells, ZFL)和鯉上皮瘤細胞(Epithelioma papulosum cyprinid, EPC)分別用含有10%胎牛血清的F12培養基和含有10%胎牛血清的199培養基傳代培養[8,9]。

1.2 質粒構建

利用PCR方法擴增編碼不同長度斑馬魚IRF11氨基酸的cDNA, 插入到pEGFP-N3載體的多克隆位點(KpnⅠ/EcoR Ⅰ), 構建了6個融合GFP (Green fluorescent protein)蛋白的表達質粒: IRF11-GFP (包括IRF11全長氨基酸1-251)、N1-138、N1-114、N1-69、C115-251、M1-114。其中質粒M1-114的制備方法是通過序列突變質粒N1-114的氨基酸片段97RSIKK101(AGAAGCATCAAGAAA)中的R (Arginine)和兩個K (Lysine)成為A (Alanine)(GCCAGCATCGCAG CA)[4]。測序正確后提取質粒備用。

1.3 生物信息學分析

在Ensemble中查詢具有代表性物種的IRF1和IRF11基因, 并對IRF1和IRF11基因座位的上下游基因進行同線性分析。在NCBI和Ensemble中查找代表性物種的IRF蛋白氨基酸序列, 利用ClustalX進行多重序列比對分析。利用MEGA6軟件中的N-J法構建系統進化樹(表 1)。

1.4 細胞定位分析

細胞定位分析根據我們實驗室建立的方法進行[4,5]。EPC細胞在6孔板中的蓋玻片上培養過夜,然后利用轉染試劑lipofectamine 2000 (Invitrogen)轉染2 μg融合GFP報告基因的各種IRF11質粒。在轉染24h后, 細胞去除轉染液進行如下操作: PBS清洗3次后用多聚甲醛固定20min; 再次用PBS清洗3次, 然后用0.2% Triton X-100處理15min; 同樣在經PBS洗3次后, 用50 μg/mL DAPI染色10min, 最后在激光共聚焦顯微鏡下檢測照相(NOL-LSM 710)。

1.5 RNA提取和RT-PCR檢測

根據本實驗室建立的方法進行[5]。ZFL細胞傳代于一組25 cm2培養瓶中, 鋪滿單層過夜。在去除原培養基后, 細胞利用轉染試劑lipofectamine 2000 (Invitrogen)轉染2 μg的poly (I:C), 然后在不同轉染時間點收集細胞, 利用Trizol法提取細胞總RNA, 用M-MLV逆轉錄酶(Gibco BRL)反轉錄合成第一鏈cDNA。通過熒光定量RT-PCR方法分析斑馬魚IRF1、IRF3、IRF7、IRF11、IFN1、IFN2、IFN3、IFN4基因的表達水平, 采用2-??Ct法計算基因的表達水平, 每組設3個重復。本研究所用引物見表 2。

表 1 用于蛋白序列比較和系統進化樹分析的IRF信息Tab. 1 The accession numbers of IRFs used in this study

2 結果

2.1 IRF1和IRF11基因位點的同線型分析

通過分析3種哺乳動物(人H. sapiens、小鼠M. musculus、狗C. familiaris)、一種鳥類(雞G. gallus)、一種爬行類(安樂蜥A. carolinensis)以及12種魚類(斑馬魚D. rerio、亞馬遜花鳉P. Formosa、墨西哥麗脂鯉A. mexicanus、矛尾魚L. chalumnae、大西洋鱈G. morhua、紅鰭東方豚T. rubripes、青鳉O. latipes、眼斑雀鱔L. oculatus、三刺魚G.aculeatus、綠河豚T. nigroviridis、羅非魚O. niloticus、花斑劍尾魚X. maculates)的基因組數據發現,它們都具有IRF1基因。12種魚類基因組不僅有IRF1基因, 而且還有IRF11基因, 它們分別位于不同的染色體上(圖 1)。進一步分析IRF1基因位點的上下游基因發現: 在3種哺乳類物種中, IRF1的上下游基因相同, 而且排列位置一致; 鳥類和爬行類IRF1基因位點的上下游基因完全一致, 但排列位置稍有變化。魚類基因組數據不太完整, 就目前收集的數據可以看出, 已經鑒定的魚類IRF1基因位點的上下游基因與其他物種完全一致, 但是排列位置變化較大 (圖 1A)。利用同樣的分析方法, 發現魚類IRF11的基因位點同樣具有相對保守的同線型 (圖1B)。

表 2 本研究所用引物Tab. 2 Primers used in the study

2.2 脊椎動物IRF家族的進化樹分析

選取代表性物種的IRF家族成員進行系統進化樹分析。結果表明: 所有脊椎動物IRF1聚為一簇,表明所有脊椎動物IRF1為直向同源基因(Orthologous gene)。IRF2-10都具有與IRF1同樣的結果。IRF11只存在于魚類基因組中, 單獨聚為一簇。所有IRF成員可以分為明顯的4個亞家族, 其中IRF1、IRF11和IRF2同屬一個亞家族。從系統進化樹可以看出, IRF11與IRF1和IRF2二者具有相似的進化距離, 表明IRF11基因比IRF1和IRF2起源于更早時期(圖 2)。

2.3 魚類IRF1和IRF11的序列比較

鑒于斑馬魚IRF1和IRF11的命名混亂, 選擇12種魚類IRF1和IRF11蛋白序列進行了比較。鯽IRF1是我們早期在鯽培養細胞中鑒定的魚類IRF1[4], 也用于序列比對分析。結果如圖 3, IRF1和IRF11都具有保守的DBD結構域, 但是C端的IAD結構域的序列保守性較低。與IRF11蛋白相比較, IRF1蛋白的C端具有較高保守性。例如, 鯽IRF1和斑馬魚IRF1緊鄰DBD結構域即IAD的N端有一個與核定位信號相關的序列[4,6], 其他魚類IRF1對應區域也存在一個相對保守的富含R和L的序列(圖 3)。

2.4 斑馬魚IRF11的亞細胞定位

為了研究斑馬魚IRF11的亞細胞定位, 首先制備了融合GFP蛋白的各種斑馬魚IRF11質粒(圖 4A)。EPC細胞轉染野生型斑馬魚IRF11質粒(wtIRF11),利用激光共聚焦顯微鏡觀察, 發現綠色熒光信號全部位于細胞核(圖 4B)。當轉染對照GFP質粒時, 綠色信號均勻分布于整個細胞中。以上結果表明斑馬魚IRF11蛋白定位于細胞核。轉染包括N端DBD的質粒N1-138和N1-114時, 與轉染wtIRF11質粒的結果相同, 綠色熒光信號全部位于細胞核; 而轉染包括部分DBD的質粒N1-69時, 綠色信號均勻分布于整個細胞中, 與轉染對照GFP質粒的結果一致(圖4C)。因此, DBD的N70-115應該有一個核定位信號(Nuclear localization signal, NLS), 該NLS足以引導斑馬魚IRF11蛋白定位在細胞核中。

圖 1 不同物種IRF1 (A)和IRF11 (B)基因位點的同線型分析Fig. 1 Synteny analysis of IRF1 (A) and IRF11 (B) gene locus from different species查詢3種哺乳動物(人、小鼠、狗), 1種鳥類(雞), 1種爬行類(安樂蜥)以及12種魚類(斑馬魚、亞馬遜花鳉、墨西哥麗脂鯉、矛尾魚、大西洋鱈、紅鰭東方豚、青鳉、眼斑雀鱔、三刺魚、綠河豚、羅非魚、花斑劍尾魚)的基因組, 分析IRF1 (A)和IRF11 (B)基因及其上下游基因的組成。由于缺少上下游基因信息, 花斑劍尾魚IRF1、大西洋鱈和羅非魚IRF11所在基因組片段在圖 1A和圖 1B中沒有顯示By searching the genome data from human H. sapiens, mouse M. musculus, dog C. familiaris, chicken G. gallus, anole Lizard A. carolinensis, zebrafish D. rerio, amazon molly P. Formosa, cave fish A. mexicanus, Coelacanth L. chalumnae, cod G. morhua, fugu T. rubripes, medaka O. latipes, spotted gar L. oculatus, stickleback G. aculeatus, tetraodon T. nigroviridis, tilapia O. niloticus, and platfish X. maculates, the arrangement of genes upstream and downstream of IRF1 and IRF11 were analyzed. IRF1 of plat fish (scaffold JH559106.1) and IRF11s of cod (GeneScaffold_3537) and tilapia (scaffold GL831287.1) were not included in Fig. 1A or Fig. 1B due to lack of downstream or upstream genes in the current genome data

圖 2 脊椎動物IRF家族的進化樹分析Fig. 2 Phylogenetic tree of IRF family利用Mega6.0軟件對17種代表性物種的IRF家族成員運用NJ法構建系統進化樹; IRF序列信息來源請見表 1Phylogenetic tree was made with IRF family members from 17 representative species, by using neighbor-joining method within Mega6.0 program. The accession numbers of IRF genes are shown in Tab. 1

NLS是由富含精氨酸(R)和賴氨酸(K)組成的氨基酸片段[10]。序列分析發現N70-115之間共有9個R或K, 其中97RSIKK101集中有1個R和2個K。為了分析97RSIKK101是否具有NLS的功能, 將N1-114質粒中氨基酸片段97RSIKK101的R和K突變成中性氨基酸A, 即突變成97ASIAA101(質粒M1-114)(圖4A)。在接下來的實驗中, 轉染該質粒發現表達蛋白大部分位于細胞核, 少部分位于細胞質中(圖 4C),表明97RSIKK101在斑馬魚IRF11蛋白定位在細胞核中發揮作用。然而當表達缺失DBD的IRF11質粒(C115-251)時, 該質粒表達蛋白大部分仍位于細胞核, 只有少部分位于細胞質中(圖 4C)。因此, C端IAD中也有序列在引導斑馬魚IRF11蛋白的亞細胞定位中發揮功能。

2.5 斑馬魚IRF11的誘導表達分析

利用Real-time PCR方法檢測poly (I:C)誘導ZFL細胞IRF11基因的轉錄表達。結果顯示, poly (I:C)能誘導IRF11基因的表達, 但是低于同時間點斑馬魚IRF1、IRF3及IRF7的表達上調水平。如在轉染poly (I:C) 3h后, IRF1就被顯著誘導表達, 而IRF11在轉染12h才有明顯的誘導表達。與此同時,斑馬魚IRF家族的IRF3和IRF7也被顯著誘導表達。斑馬魚有4個IFN基因, poly (I:C)能顯著誘導IFN1的表達, 其次是IFN2和IFN3, IFN4只有微弱表達(圖5)。

3 討論

從斑馬魚第九版的基因組數據庫中可以查到兩個IRF1, 分別命名為IRF1a (ENSDARG000000 43492)和IRF1b (ENSDARG00000032768)。我們最近的研究發現IRF1b (ENSDARG00000032768)實際上是IRF1[6]。本文通過基因組同線性分析進一步證實, 只有魚類基因組中才有IRF11, 其上下游的相鄰基因與IRF1完全不同。系統進化樹分析進一步發現, 作為IRF1亞家族的一個分支, 魚類IRF11在進化上相對保守, 起源早于脊椎動物的IRF1和IRF2, 且IRF11與IRF1和IRF2的進化距離相似。由此可以推測, 在魚類和哺乳類共同祖先物種的基因組中, 不僅有IRF1和IRF2基因, 而且有IRF11基因。在進化過程中當物種分化進化產生兩棲類時, IRF11基因在兩棲類基因組中丟失, 由此導致兩棲類、以及后來的爬行類、鳥類和哺乳類的基因組都沒有IRF11基因, 只保留了IRF1等其他IRF家族基因。但是魚類祖先保留了IRF11基因, 因此現存魚類都具有IRF11基因。

表達分析發現polyI:C不僅能誘導斑馬魚IRF1/3/7的表達, 而且還能誘導斑馬魚IRF11的表達, 特別是在polyI:C誘導的細胞中, 4種斑馬魚IFN基因都有不同程度的表達?？紤]到斑馬魚IRF1/3/7能顯著誘導IFN基因表達[5,6], IRF11的這種表達特性表明其可能也在魚類IFN抗病毒免疫中發揮某種功能。

圖 3 魚類IRF1和IRF11蛋白序列比較Fig. 3 Multiple alignments of fish IRF1 and IRF11DBD區域和IAD區域用橫線標出, 保守的氨基酸序列用星號標出; IAD區域的核定位信號NLS用方框標出; IRF序列信息來源請見表 1The DNA-binding domain (DBD) and IRF association domain (IAD) are indicated by lines above the aligned sequences. Identical amino acid residues are highlighted with black shading. The accession numbers of IRF genes are shown in Tab. 1

圖 4 斑馬魚IRF11的亞細胞定位Fig. 4 Subcellular distribution of zebrafish IRF11 and different truncatesA.與GFP融合各種長度的IRF11質粒及亞細胞定位; B和C. 各種融合GFP的斑馬魚IRF11轉染EPC細胞, 24h后用激光共聚焦顯微鏡檢測A. Schematic diagram of zebrafish IRF11-GFP fusion proteins and their respective subcellular localization. B and C. EPC cells were transiently transfected with control GFP plasmid or different kinds of IRF11 plasmids that fused with GFP for 24h, and examined using confocal laser scanning microscope

圖 5 poly (I:C)誘導斑馬魚IRF11及其他相關基因表達分析Fig. 5 Inducible expression of zebrafish IRF11 and other related genes in poly (I:C)-transfected ZFL cellspoly I:C (2 mg/mL) 轉染ZFL細胞, 獲得不同時序細胞總RNA樣, real-time PCR方法檢測斑馬魚IFN1 (A)、IFN2 (B)、IFN3 (C)、IFN4 (D)、IRF1 (E)、IRF3 (F)、IRF7 (G)、IRF11 (H)的表達; ND. 未檢測到ZFL cells were transfected with poly (I:C) and were sampled for mRNA at 0, 3h, 6h, 12h, 24h, 48h, 72h. Real-time PCR was used to detect the expression of zebrafish IFN1 (A), IFN2 (B), IFN3 (C), IFN4 (D), IRF1 (E), IRF3 (F), IRF7 (G), IRF11 (H); ND. Not detected

IRF11與IRF1一樣, 其表達蛋白定位在細胞核。人IRF1的核定位信號緊鄰DBD結構域[1,11]。我們前期研究發現, 與人IRF1核定位信號區域相對應的鯽和斑馬魚IRF1蛋白的氨基酸片段也富含R和K, 能發揮引導IRF1蛋白進入細胞核的功能[4,6]。研究結果還表明, 除了緊鄰DBD結構域的核定位信號外, 鯽IRF1和斑馬魚IRF1的DBD結構域也有富含R、K的氨基酸片段, 缺失和突變研究發現它們也具有引導IRF1蛋白定位細胞核的作用[4,6]。本結果顯示, 斑馬魚IRF11的N端DBD具有核定位信號, 該核定位信號足以引導蛋白的核定位。序列缺失研究發現核定位信號應該位于斑馬魚IRF11氨基酸70—114, 進一步的氨基酸突變證實97RSIKK101在IRF11蛋白的核定位中發揮作用。但是當在細胞中過量表達用斑馬魚IRF11的C端部分構建的表達質粒時, 表達蛋白大部分位于細胞核, 少部分位于細胞質, 表明斑馬魚IRF的C端IAD也有核定位信號存在。由于DBD編碼蛋白全部位于細胞核, 因此與DBD中的核定位信號相比, C端IAD中的核定位信號可能僅在斑馬魚IRF11的核定位中發揮輔助定位功能。

[1]Miyamoto M, Fujita T, Kimura Y, et al. Regulated expression of a gene encoding a nuclear factor, IRF-1, that specifically binds to IFN-beta gene regulatory elements [J]. Cell, 1988, 54: 903—913

[2]Tamura T, Yanai H, Savitsky D, et al. The IRF family transcription factors in immunity and oncogenesis [J]. Annual Review Immunology, 2008, 26: 535—584

[3]Zhang Y, Hu C, Zhang J, et al. Molecular cloning and characterization of crucian carp (Carassius auratus L.) interferon regulatory factor 7 [J]. Fish Shellfish Immunology, 2003, 15: 453—466

[4]Shi Y, Zhang YB, Zhao Z, et al. Molecular characterization and subcellular localization of Carassius auratus interferon regulatory factor-1 [J]. Developmental and Comparative Immunology, 2008, 32: 134—146

[5]Sun F, Zhang YB, Liu TK, et al. Characterization of fish IRF3 as an IFN-inducible protein reveals evolving regulation of IFN response in vertebrates [J]. The Journal of Immunology, 2010, 185: 7573—7582

[6]Feng H, Zhang YB, Zhang QM, et al. Zebrafish IRF1 regulates IFN antiviral response through binding to IFN-varphi1 and IFNvarphi3 promoters downstream of MyD88 signaling [J]. The Journal of Immunology, 2015, 194: 1225—1238

[7]Stein C, Caccamo M, Laird G, et al. Conservation and divergence of gene families encoding components of innate immune response systems in zebrafish [J]. Genome Biology, 2007, 8: R251

[8]Liu Y, Zhang YB, Liu TK, et al. Lineage-specific expansion of IFIT gene family: an insight into coevolution with IFN gene family [J]. PLoS One, 2013, 8: e66859

[9]Liu T K, Zhang Y B, Liu Y, et al. Cooperative roles of fish protein kinase containing Z-DNA binding domains and double-stranded RNA-dependent protein kinase in interferon-mediated antiviral response [J]. Journal of Virology, 2011, 85: 12769—12780

[10]Barnes B J, Kellum M J, Field AE, et al. Multiple regulatory domains of IRF-5 control activation, cellular localization, and induction of chemokines that mediate recruitment of T lymphocytes [J]. Molecular and Cellular Biology, 2002, 22: 5721—5740

[11]Fujita T, Reis L F, Watanabe N, et al. Induction of the transcription factor IRF-1 and interferon-beta mRNAs by cytokines and activators of second-messenger pathways [J]. Proceedings of the National Academy Science USA, 1989, 86: 9936—9940

IDENTIFICATION, SUBCELLULAR LOCALIZATION AND EXPRESSION CHARACTERIZATION OF ZEBRAFISH IRF11

XIONG Ya-Wei1,2, ZHANG Yi-Bing1and GUI Jian-Fang1
(1. State Key Laboratory of Freshwater Ecology and Biotechnology, Institute of Hydrobiology, Chinese Academy of Sciences, Wuhan 430072, China; 2. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China)

Previous studies have shown that IRF11 is a fish-specific gene. There is confusion in nomenclature of IRF1 and IRF11 in the version 9 of the zebrafish genome. Herein, gene synteny of IRF1 and IRF11 was analyzed in some vertebrates, suggesting that IRF11 and IRF1 are two different genes and are not appropriate to name IRF1b and IRF1a, respectively. Phylogenetic tree analysis showed that fish IRF11 shows similar evolution distance to either IRF1 or IRF2, and that fish IRF11 occurred earlier in a vertebrate ancestor than did fish IRF1 and IRF2 likely due to gene loss in nonfish vertebrates during evolution. Like vertebrate IRF1, zebrafish IRF11 resided in nucleus, which was sufficiently directed by a nuclear localization sequence in N-terminal DNA binding domain. Expression analysis revealed that zebrafish IRF11 was transcriptionally induced by poly (I:C), although at a lower level than zebrafish IRF1.

Zebrafish; IRF11; Subcellular localization; Inducible expression

Q344+.1

A

1000-3207(2017)01-0001-08

10.7541/2017.1

2016-03-02;

2016-07-16

國家自然科學基金(31272690、31572646)資助 [Supported by the National Natural Science Foundation of China (31272690, 31572646)]

熊亞瑋(1990—), 女, 湖北襄陽人; 碩士研究生; 研究方向為魚類免疫遺傳學。E-mail: xiongyw1@126.com

張義兵, 博士, 研究員; E-mail: ybzhang@ihb.ac.cn