血紅素加氧酶1在斑馬魚低氧應激中的保護作用研究

李艷麗徐功玉肖金文李 志趙浩斌周青春桂建芳鐘雪萍

(1. 華中師范大學生命科學學院, 湖北省遺傳調控與整合生物學重點實驗室, 武漢 430079;

2. 中國科學院水生生物研究所淡水生態與生物技術國家重點實驗室, 武漢 430072)

血紅素加氧酶1在斑馬魚低氧應激中的保護作用研究

李艷麗1徐功玉1肖金文1李 志2趙浩斌1周青春1桂建芳2鐘雪萍1

(1. 華中師范大學生命科學學院, 湖北省遺傳調控與整合生物學重點實驗室, 武漢 430079;

2. 中國科學院水生生物研究所淡水生態與生物技術國家重點實驗室, 武漢 430072)

實驗探討了低氧條件下血紅素加氧酶1(Ho1)對斑馬魚的保護作用。Real-time PCR結果顯示, 低氧條件下斑馬魚ho1 mRNA水平在斑馬魚胚胎和離體培養細胞ZF4中顯著增加, 而在成魚的不同組織中呈現不同的反應。低氧處理24h后, 斑馬魚腦、鰓和肝臟中ho1 mRNA表達量明顯上升, 而在心臟和腎臟中ho1 mRNA表達量顯著降低。用鋅原卟啉IX(ZnPPIX)抑制ZF4細胞ho1的表達, 采用CCK8試劑盒檢測細胞存活率, 結果顯示抑制ho1表達可導致低氧條件下ZF4細胞存活率明顯降低。利用Hoechst染色和caspase 3活性檢測發現, 在低氧條件下抑制ho1表達后ZF4細胞的凋亡率較對照組顯著增加, 而Ho1的誘導劑可顯著降低低氧條件下抑制組的細胞凋亡率。這些結果表明斑馬魚Ho1可能通過抗細胞凋亡發揮低氧保護作用。

斑馬魚; 血紅素加氧酶1; 低氧; 細胞活力; 細胞凋亡

血紅素加氧酶1(Ho1)是催化血紅素降解形成膽綠素、一氧化碳(CO)和游離鐵(Fe2+)的起始酶和限速酶, 其催化產物膽綠素又可被膽綠素還原酶還原生成膽紅素。Ho1亦稱熱休克蛋白32(Hsp32), 可被血紅素、重金屬、氧化應激、紫外照射、炎癥介質和某些生長因子等誘導表達[1,2]。人和脊椎動物的血紅素加氧酶1及其催化產物可通過抗氧化、抗炎、抗細胞凋亡等方式對組織細胞起保護作用。有研究表明, 敲除血紅素加氧酶1基因的人胚胎纖維原細胞對高鐵血紅素和過氧化氫暴露導致的氧化損傷高度敏感, 細胞存活率顯著降低[3]。在人肺上皮細胞中超表達小鼠血紅素加氧酶1, 人肺上皮細胞細胞生長停滯, 抗氧化損傷能力明顯增強[4]。血紅素加氧酶1轉基因小鼠在肺部特異性超表達血紅素加氧酶1, 可保護肺器官免于低氧暴露導致的高血壓和炎性反應[5]。近年來, 研究發現血紅素加氧酶1參與多種生理和病理過程中細胞對低氧的適應性調節作用。在人類多種腫瘤細胞中血紅素加氧酶1表達量較高, 且其表達量與實體腫瘤的生長密切相關。此外, 血紅素加氧酶1的誘導表達可顯著降低低氧/復氧、低氧缺血、缺血/再灌注對人和小鼠腦、腎、肝、肺和心臟等器官造成的損傷[6—8]。但是, 目前血紅素加氧酶1在魚類低氧應激中的生物學功能尚不清楚。

水體低氧是指在池塘、水庫、湖泊、河口及近海季節性發生的、水中溶解氧低于2 mg/L的一種自然現象。水體富營養化可導致低氧現象頻繁發生。低氧環境影響魚類的生存、生長和繁殖[9,10]。某些耐低氧魚類在長期的進化中獲得了一些低氧適應機制, 可通過低氧誘導因子(Hypoxia inducible factor, HIF)信號途徑調節大量低氧應答基因的轉錄, 從而調節機體對低氧的生理反應, 增強細胞或組織對于缺氧的耐受性[11,12]。有研究表明斑馬魚胚胎在缺氧狀態下能夠存活24h[13]。斑馬魚成魚在極端低氧長時間處理后出現鰓片數目減少、表面積增加以利于氧的攝取[14]。斑馬魚的胚胎和成魚在低氧狀態下基因和蛋白質的表達都會發生變化,以調整體內代謝適應低氧環境[14,15]。因此, 利用斑馬魚這一理想的發育、遺傳和毒理研究模型, 可系統地分析ho1基因在魚類低氧應激中的生物學功能。在本文中我們研究了斑馬魚ho1基因在低氧條件下的表達特征, 然后初步探討了Ho1在斑馬魚低氧應激中的功能。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

斑馬魚由本實驗室飼養。取健康、性成熟的斑馬魚, 于飼養系統關燈前將雌雄按1∶2的比例放入產卵缸內。次日給光后拿掉擋板, 讓其完成交配和產卵。收集、挑選正常發育的胚胎進行培養, 培養溫度為28℃, 光周期為明14h∶暗10h。斑馬魚胚胎成纖維細胞(Zebrafish embryonic fibroblasts, ZF4)由中國科學院水生生物研究所崔宗斌研究員惠贈, 用輔加10%胎牛血清的DMEM/F12(1∶1)培養基于28℃細胞培養箱中培養, 每3—4天按1∶1.5的比例傳代一次。

1.2 實驗方法

低氧處理將斑馬魚ZF4細胞或處于不同發育階段的胚胎置于低氧培養箱中用1%或5% O2處理不同的時間。向裝有曝氣水的廣口瓶中沖入高純氮氣, 至水中溶解氧濃度為1.5 mg/L, 然后將斑馬魚成魚置于瓶中培養。在完成低氧處理后, 收取樣品, 液氮速凍, 儲存于-80℃冰箱備用。

Real-time PCR檢測ho1基因的表達收集經低氧處理的ZF4細胞、斑馬魚胚胎或各組織, 用Trizol法提取總RNA, 具體步驟按照試劑盒說明書進行。用DNaseⅠ酶解可能殘余的基因組DNA。用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定所提取的RNA的完整性。紫外分光光度法測定RNA樣品的濃度和純度。取各種RNA用逆轉錄酶Powerscrit和oligo (dT)合成第一鏈模板cDNA, 然后以cDNA作為模板進行Realtime PCR。以斑馬魚β-actin基因作為參照。ho1基因Real-time RCR反應體系為: SYBR Green Mix 10 μL, DEPC H2O 1 μL, 上、下游引物(F、R)(10 mol/L)各0.5 μL, 模板cDNA 8 μL, 總體積為20 μL。PCR反應條件為: 95℃預變性3min; 95℃ 10s, 58℃ 30s, 72℃30s, 35個循環。在每一個循環最后要設一個讀板溫度, 這一般根據目的基因情況而定。每一個樣品重復3次, 每個基因的表達量以β-actin為參照用2-??Ct方法[16,17]進行數據處理及分析。

細胞活力檢測將ZF4細胞以1×104cells/well的濃度接種在96孔板上, 待細胞長到一定密度, 換用無血清培養基培養。實驗共設置了10組, 其中5組用于鋅原卟啉IX (ZnPPIX)抑制實驗: 在無血清培養基中加入Ho1的抑制劑ZnPPIX使其終濃度為0、5、10、15、20 μmol/L, 每組設定4個重復。待細胞在無血清培養基中培養2h后用1% O2低氧處理36h, 然后利用CCK8試劑盒測定其細胞活力。另外5組用于Hemin回復實驗: 各組細胞先用10 μmol/L的ZnPPIX溶液預處理1h, 然后在無血清培養基中加入Ho1的誘導劑血紅素(Hemin)使其終濃度為0、5、10、20 μmol/L, 每組設定4個重復。待細胞在無血清培養基中培養1h后用1% O2低氧處理36h, 然后利用CCK8試劑盒測定各組細胞的細胞活力。

Hochest染色實驗共設置了4組, 常氧組、低氧組、ZnPPIX+低氧組、ZnPPIX+Hemin+低氧組。ZnPPIX和Hemin的濃度均為10 μmol/L。在六孔板中鋪上無菌蓋玻片, 然后種入細胞, 待細胞貼壁后換用無血清培養基并加藥。藥物處理2h后, 除常氧組外, 其余各組均低氧處理48h。吸去培養基,然后加入500 μL固定液, 室溫固定15min。緩慢吸盡固定液, 加入1 mL PBS輕輕搖晃洗滌2次, 每次3min。加入500 μL Hoechst33258染色液染色5min。吸去染色液, 用PBS洗滌2次。在潔凈的載玻片中央滴一滴抗熒光淬滅封片液, 從六孔板中取出貼有細胞的蓋玻片, 蓋在封片液上, 盡量避免氣泡, 在熒光顯微鏡下(激發光波長350 nm, 發射光波長460 nm)觀察細胞的形態特征。

Caspase3活性檢測用試劑盒提供的pNA配制標準品稀釋液, 制定pNA標準曲線。胰酶消化貼壁細胞, 離心(12000 r/min, 4℃, 5min)、收集細胞沉淀。細胞沉淀用PBS洗滌2次。加入適量細胞裂解液, 震蕩混勻, 于冰浴中裂解15min。取10 μL細胞裂解液, 采用Bradford法檢測細胞裂解液中的總蛋白濃度。取50 μL檢測緩沖液, 加入40 μL細胞裂解液, 約30 μg蛋白, 適當混勻, 隨后加入10 μL人工合成的caspase 3特異底物Ac-DEVD-pNA (2 mmol/L),總體積為100 μL。充分混勻后, 37℃培養箱中孵育60—120min。發現顏色變化較明顯時迅速用酶標儀測定A405。顏色變化不明顯時, 孵育時間可適當延長。樣品中caspase 3催化生成的pNA產生的吸光度為待測樣品A405減去空白對照A405。一個酶活力單位定義為當底物飽和時, 在37℃一個小時內可以剪切1 nmol Ac-DEVD-pNA產生1 nmol pNA的caspase 3的酶量。計算出樣品中所含有的caspase 3酶活力單位。

統計分析 Real-time PCR數據用Origin6.1軟件中T-test方法來分析差異顯著性。當P＜0.05時認為差異性顯著, 當P＜0.01時認為差異性極顯著。

2 結果

2.1 低氧對斑馬魚ZF4細胞ho1基因表達的影響

用低氧(1% O2)處理ZF4細胞24h、48h和72h,然后利用Real-time PCR檢測ZF4細胞ho1 mRNA的表達水平。結果如圖 1所示, 低氧可顯著誘導ho1基因的轉錄, ho1 mRNA的相對表達量在低氧處理24h后顯著升高。

圖 1 Real-time PCR檢測低氧條件下斑馬魚ZF4細胞ho1基因的表達(*代表P＜0.05)Fig. 1 The effect of hypoxia on ho1 gene expression in ZF4 cells

2.2 低氧對斑馬魚胚胎和成魚ho1基因表達的影響

用低氧(5% O2)處理斑馬魚胚胎, 在低氧處理不同時間后進行取樣, 然后Real-time PCR的方法檢測低氧處理前后斑馬魚胚胎ho1 mRNA的表達水平。結果如圖 2a所示, 低氧處理后斑馬魚胚胎ho1基因的表達量均有不同程度的增加, 從低氧處理24h開始常氧組和低氧組差異顯著。用低氧處理斑馬魚成魚, 檢測低氧處理前后ho1 mRNA在組織中的表達變化。結果表明(圖 2b), 經低氧處理后,斑馬魚ho1基因在腦、肝、鰓、腸、肌肉等組織中表達量顯著增加, 而在心臟和腎臟中表達量顯著降低, 在性腺中表達量的變化不顯著。

2.3 低氧條件下抑制ho1表達對斑馬魚ZF4細胞活力的影響

用不同濃度的ho1抑制劑ZnPPIX抑制ZF4細胞ho1的表達, 然后檢測低氧條件下ZF4細胞的活力。結果如圖 3所示, ZnPPIX處理可顯著降低低氧條件下ZF4細胞的生存活力, 并且這種作用具有濃度依賴性, 隨著ZnPPIX濃度的升高, ZF4細胞的生存活力逐漸下降。與對照組(0 ZnPPIX)比較, 5、10、15、20 μmol/L ZnPPIX處理組ZF4細胞的細胞活力依次為對照組的93.75%、77.92%、62.5%和45.83%。

用不同濃度的Ho1誘導劑血紅素(Hemin)誘導抑制組ZF4細胞ho1的表達, 然后檢測低氧條件下ZF4細胞的活力。結果如圖 4所示, 10和20 μmol/L的Hemin可以部分回復10 μmol/L ZnPPIX抑制ho1表達后低氧對ZF4造成的活力損傷。Hemin的這種回復作用存在明顯的劑量效應關系。在低氧條件下, 當10 μmol/L ZnPPIX單獨作用時, ZF4細胞的細胞活力僅為對照組的79.59%。當Hemin濃度為5 μmol/L時, ZF4細胞的細胞活力為對照組的82.28%, 并未觀察到明顯的回復作用。當Hemin濃度達到10 μmol/L時, 細胞活力上升到對照組的96.94%, 與ZnPPIX單獨處理組相比具有顯著差異。當Hemin濃度為20 μmol/L時, 細胞活力回復到對照組水平。

2.4 低氧條件下抑制ho1表達對斑馬魚ZF4細胞凋亡的影響

圖 2 ho1 mRNA在低氧處理斑馬魚胚胎(a)和成魚組織(b)中的表達圖式(*代表P＜0.05)Fig. 2 Effects of hypoxia on ho1 mRNA level in zebrafish embryos (a) and various tissues of zebrafish adult (b)

將ZF4細胞隨機分成4組, 常氧組、低氧組、ZnPPIX+低氧組、ZnPPIX+Hemin+低氧組。除常氧組外, 其余3組均用低氧處理48h, 然后利用光學顯微鏡觀察各組的細胞形態。結果如圖 5a所示, 常氧組ZF4細胞生長狀態良好, 細胞大小形態一致, 密度均一, 呈長梭形, 貼壁緊密。低氧組細胞逐漸變圓, 密度明顯下降, 少數細胞漂浮死亡。ZnPPIX+低氧組在低氧處理后, 細胞密度急劇下降, 大片脫落, 結團、破碎。而ZnPPIX+Hemin+低氧組, 無論是在細胞數目還是在細胞形態上都得到了顯著回復。結果表明, 在低氧條件下抑制ho1的表達會誘導ZF4細胞的大量死亡, Ho1對低氧條件下的ZF4細胞具有保護作用。

用Hoechst染色法檢測各組的細胞凋亡情況,結果如圖 5a所示, 常氧組細胞核形態完整, 呈橢圓形, 顏色均一, 為深藍色。低氧處理組部分細胞出現凋亡特征。而ZnPPIX+低氧處理組, 大部分細胞都呈現凋亡狀態, 細胞核致密濃染, 或者破碎呈凋亡小體。ZnPPIX+Hemin+低氧處理組細胞出現凋亡特征的數量較ZnPPIX+低氧處理組顯著減少。用試劑盒檢測caspase 3活性, 結果如圖 5b所示, ZnPPIX+低氧組的caspase 3活性顯著高于其他各組, 在添加Hemin之后, caspase 3活性得到一定程度的回復。這些結果表明Ho1可通過抗細胞凋亡來增強ZF4細胞的低氧耐受力。

圖 3 不同濃度ZnPPIX誘導下ZF4細胞在低氧處理后的細胞活力(*代表P＜0.05, **代表P＜0.01)Fig. 3 Viability of ZF4 cells after exposure to hypoxia with different doses of ZnPPIX

圖 4 ZnPPIX和Hemin共同作用對低氧條件下ZF4細胞活力的影響(**代表P＜0.01)Fig. 4 Coeffect of ZnPPIX and Hemin on the viability of ZF4 cells under hypoxia

圖 5 低氧條件下抑制ho1表達后斑馬魚ZF4細胞的凋亡情況Fig. 5 Detection of apoptosis in ZF4 cells treated with Ho1 inhibitor under hypoxiaA. Hoechst染色; B. Caspase 3 活性檢測A. Hoechst staining; B. Detection of caspase 3 activity

3 討論

已有的研究表明, 斑馬魚Ho1可參與一系列氧化應激反應。多種重金屬和持續有機污染物存在的情況下成年斑馬魚Ho1的活性明顯增強[18,19]。斑馬魚早期胚胎ho1基因也對多種化合物表現出高度的敏感性[19,20]。用乙酰氨基酚誘導斑馬魚肝損傷后, ho1的表達量會急劇上升[21]。因此Ho1被認為可以作為指示水體污染程度的生物標志物。但目前尚未見到斑馬魚Ho1參與低氧應答的研究。本研究首先采用Real-time PCR技術分析了ho1基因在斑馬魚低氧應答中的表達特征, 然后探討了ho1基因在斑馬魚低氧應答中的保護作用。研究發現, 斑馬魚ho1在低氧條件下表達量顯著上升, 可通過抗細胞凋亡發揮低氧保護作用。

3.1 斑馬魚ho1在低氧條件下的表達特征分析

人和脊椎動物的血紅素加氧酶1對低氧的應答具有細胞特異性和種間差異。研究發現, 低氧處理后人臍靜脈上皮細胞、人星形膠質細胞和人冠狀動脈上皮細胞血紅素加氧酶1 mRNA的表達水平顯著降低, 而人肺A549細胞、人真皮纖維原細胞血紅素加氧酶1 mRNA的表達水平顯著升高[22,23]。用低氧處理離體培養的人滋養細胞, 細胞滋養層細胞的血紅素加氧酶1蛋白表達較常氧無顯著變化, 而合體滋養層細胞的血紅素加氧酶1蛋白水平在處理12h后較常氧組顯著降低[24]。而在小鼠中, 無論是活體的心臟、肝臟, 還是離體培養細胞, 低氧處理均可誘導其血紅素加氧酶1的表達[25]。而且小鼠心臟和肝臟中的血紅素加氧酶1 mRNA含量在低氧處理期間呈現動態的變化。小鼠心臟中的血紅素加氧酶1 mRNA含量在低氧處理5d后顯著增加, 在28d達到最高水平。小鼠肝中的血紅素加氧酶1 mRNA水平在低氧處理1d后顯著增加, 在第5天的時候回復到正常水平, 在21d的時候達到最大值[26]。在本研究中, 低氧處理后斑馬魚離體培養細胞和胚胎中ho1 mRNA的水平顯著增加, 并且隨著暴露時間的延長也呈現動態的變化。而斑馬魚成魚中ho1 mRNA表達的變化與器官類型有關。在低氧處理24h后, 斑馬魚腦、鰓和肝臟中ho1 mRNA表達量明顯上升, 而在心臟和腎臟中ho1 mRNA表達量顯著降低。這些結果表明, 低氧可能通過不同的方式影響不同類型的細胞, 斑馬魚Ho1對低氧的應答依賴于細胞/器官類型和暴露時間。

3.2 斑馬魚ho1在低氧應答過程中的功能分析

進一步對斑馬魚Ho1在低氧應答中的功能進行分析, 發現抑制ho1表達使在低氧條件下培養的斑馬魚細胞生活力顯著降低, 而ho1的誘導劑則可以回復低氧條件下因ho1表達抑制所增強的細胞損傷,這一結果表明斑馬魚Ho1可發揮低氧保護作用。這與相關的研究結果相一致。在低溫低氧條件下, 金魚Ho1在鰓化學感應神經上皮細胞(NECs)中的表達量增加、酶活性增強, 從而調節金魚在低氧條件下的呼吸頻率[27]。低氧可誘導鯽魚囊胚細胞ho1 mRNA的大量表達, 穩定轉染ho1的鯽囊胚細胞對低氧的耐受力顯著增加[28,29]。高溫低氧和低溫低氧均可誘導人肝細胞中血紅素加氧酶1的表達, 從而保護細胞, 避免產生炎性反應[30]。人血紅素加氧酶1通過PI3K/Akt/Nrf2信號途徑保護H9c2心肌細胞、C6神經膠質細胞免受缺氧/復氧誘導的細胞凋亡[31—33]。小鼠惡性腫瘤T細胞血紅素加氧酶1大量表達, 保護細胞免受低氧誘導的細胞壓力[34]。小鼠血紅素加氧酶1也可以通過抗氧化和抗凋亡作用減輕小鼠缺血/再灌注造成的腎損傷, 增加超氧化物歧化酶的水平, 降低細胞凋亡率[35]。

關于低氧條件下血紅素加氧酶1的作用機制,目前研究發現血紅素加氧酶1可以通過降解血紅素所獲得的產物發揮細胞保護作用。低氧處理后人肝細胞的血紅素加氧酶1蛋白水平和酶活性上升,膽紅素含量增加[30], 而膽紅素可作為抗氧化劑有效清除缺氧條件下產生的氧自由基, 防止細胞脂質層過氧化。此外, 低氧處理的小鼠, 無論是活體還是離體培養的心肌細胞, 其一氧化碳(CO)的含量均較對照組顯著增加。機體內源性CO主要由血紅素加氧酶降解血紅素生成。低氧處理期間小鼠動脈血中CO的含量變化與血紅素加氧酶1在肝中含量的變化相吻合[28,29]。而血紅素降解產生的CO可通過環鳥苷酸(cGMP)發揮信號傳導、舒張血管、抗炎和抗細胞凋亡作用。另有研究發現, 小鼠血紅素加氧酶1在低氧條件下還可發生核轉位現象, 激活AP-2、Brn3和CBF等轉錄因子的表達, 繼而增強細胞的抗氧化能力[36]。在本研究中, 抑制ho1表達使斑馬魚在低氧條件下離體培養細胞的凋亡率顯著升高, 表明斑馬魚Ho1也可以通過抑制細胞凋亡來增強細胞的低氧耐受力, 其具體作用機制還有待進一步研究。

總之, 斑馬魚ho1是一個低氧誘導基因, 可通過抑制細胞凋亡來增強細胞的低氧耐受能力。但目前ho1在斑馬魚低氧適應中的作用機制尚不清楚。本研究為進一步探討ho1影響斑馬魚低氧耐受能力的分子機制奠定了基礎。

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STUDIES ON THE PROTECTIVE ROLE OF ZEBRAFISH HO1 IN RESPONSE TO HYPOXIA

LI Yan-Li1, XU Gong-Yu1, XIAO Jin-Wen1, LI Zhi2, ZHAO Hao-Bin1, ZHOU Qin-Chun1, GUI Jian-Fang2and ZHONG Xue-Ping1
(1. Hubei Key Laboratory of Genetic Regulation and Integrative Biology, School of Life Sciences, Huazhong Normal University, Wuhan 430079, China; 2. State Key Laboratory of Freshwater Ecology and Biotechnology, Institute of Hydrobiology, Chinese Academy of Sciences, Wuhan 430072, China)

Heme oxygenase 1 (Ho1) is the rate-limiting enzyme in the degradation of heme into biliverdin, carbon monoxide and free divalent iron. Abnormal expression of ho1 gene is associated with the development and progression of various human diseases, while functions of zebrafish Ho1 under hypoxia stress remain largely unknown. This study explored the protection role of zebrafish Ho1 during hypoxia exposure. The results showed that hypoxia significantly induced zebrafish ho1 mRNA in ZF4 cells, embryos, brain, gill, and liver but significantly decreased it in heart and kidney after 24h hypoxic exposure. Ho1 inhibition by ZnPPIX decreased ZF4 cell viability under hypoxia stress, enhanced Ho1 activity protected ZF4 cell from hypoxia stress-induced cell death. These results showed that Ho1 may protect zebrafish from hypoxia-induced cell apoptosis.

Zebrafish; Heme oxygenase 1; Hypoxia; Cell viability; Cell apoptosis

Q344+.1

A

1000-3207(2017)01-0043-07

10.7541/2017.6

2016-01-16;

2016-04-21

國家自然科學基金項目(30972254); 淡水生態與生物技術國家重點實驗室開放課題(2013FB03)資助 [Supported by the National Natural Science Foundation of China (30972254); the State Key Laboratory of Freshwater Ecology and Biotechnology (2013FB03)]

李艷麗(1987—), 女, 湖北宜昌人; 碩士研究生; 研究方向為遺傳學。E-mail: lylccnu@163.com

鐘雪萍, E-mail: zhongxueping@mail.ccnu.edu.cn