興國紅鯉ER基因克隆表達及EE2暴露對肝中ER表達的影響

宋明月單喜雙陳細華岳華梅葉 歡楊曉鴿李創舉

(1. 中國水產科學研究院長江水產研究所, 農業部淡水生物多樣性保護重點實驗室, 武漢 430223; 2. 上海海洋大學水產與生命學院, 上海 201306)

興國紅鯉ER基因克隆表達及EE2暴露對肝中ER表達的影響

宋明月1,2單喜雙1,2陳細華1岳華梅1葉 歡1楊曉鴿1李創舉1

(1. 中國水產科學研究院長江水產研究所, 農業部淡水生物多樣性保護重點實驗室, 武漢 430223; 2. 上海海洋大學水產與生命學院, 上海 201306)

為評估環境內分泌干擾物對魚類的影響, 研究克隆了興國紅鯉雌激素受體(Estrogen receptor, ER)4種亞型ERα、ERβ、ERβ1、ERβ2的全長cDNA序列, 氨基酸序列比對發現興國紅鯉ERs分別與3種鯉科魚類相應亞型具有較高的同源性。實時熒光定量PCR (qRT-PCR)檢測結果表明, 4種ER亞型mRNA在雌雄成體組織中呈現差異表達, 雌性個體中, 肝、卵巢和腸中4種ERs的表達量均較高; 在雄性個體中, ERα和ERβ主要在肝中表達, ERβ1、ERβ2分別在腸和精巢中的表達量最高。將150日齡的興國紅鯉幼魚分別暴露在0.01、0.1和1 nmol/L的17α-乙炔基雌二醇(EE2)中4周, 檢測了雌性幼魚肝中4種ER基因的表達變化情況。在EE2中暴露1—2周后, 興國紅鯉雌性幼魚肝中ERα基因的表達水平有極顯著的提升; 各濃度 EE2能持續顯著促進其肝中ERβ的表達; 在1—2周內各濃度EE2對 ERβ1表達有所抑制; 第1周EE2能夠抑制ERβ2基因mRNA的表達, 并在0.01 nmol/L時抑制作用達到了顯著的水平。上述研究結果表明, EE2暴露能誘導或抑制興國紅鯉雌性幼魚肝中ER亞型的表達, 相對于ERβ、ERβ1和ERβ2、ERα可作為EE2短期(1—2周)敏感性生物學標記。

雌激素受體; 興國紅鯉; EE2; 實時熒光定量PCR

雌激素主要通過雌激素受體(ER)發揮生理作用[1], ER屬于核受體超家族(Nuclear receptor super family)成員[2]。ER參與的雌激素信號轉導通路主要有兩種[3]: 一種是基因組水平的調控, 包括依賴雌激素反應原件(Estrogen response element, ERE)的經典信號通路和不依賴ERE介導的基因組ER信號通路; 另一種是非基因組水平上的調控, 包括ER信號與其他信號轉導連接的通路和非配體依賴的信號通路[4]。高等脊椎動物中雌激素受體有ERα和ERβ兩種亞型[5,6], 在大多數硬骨魚類中有ERα、ERβ1和ERβ2三種亞型[7,8], 虹鱒中存在4種亞型: ERα、ER alpha2、ERβ1和ERβ2[9]。

17α-乙炔基雌二醇(17-α ethinylestradiol, EE2)作為一種環境內分泌干擾物(Environmental Endocrine Disrupting Chemicals, EDCS)通過工業廢水、生活污水、農牧業排水進入自然界[10—12], 且不易降解。在自然界水體中[13,14]EE2的濃度范圍為0.05— 115 ng/L不等; 水體中的EE2進入生物有機體能夠模仿機體內源雌激素與ER結合或與機體內源雌激素競爭ER分子, 干擾機體正常的內分泌系統。研究表明, EE2暴露不僅能夠引起Vtg (Vitellogenin, 卵黃蛋白原)、ER等基因表達的變化[15—17], 而且對硬骨魚類的生殖方面有重要作用[18,19], 對魚類的生長、免疫等生理活動的調節也有一定的影響[20]。

興國紅鯉(Cyprinus carpio var singuonensis)是一種經濟魚類, 1—2年性成熟, 溫度適應范圍廣, 易于飼養, 產卵量大。一般用于環境內分泌干擾物風險評估的硬骨魚類主要是模式魚類如斑馬魚(Danio rerio)[21]、稀有鮈鯽(Gobiocypris rarus)[17,22]等, 但這些魚類并不能完全代表野生魚類的風險評估[23]。本研究通過RT-PCR和RACE (Rapid-amplification of cDNA ends)方法獲得興國紅鯉4種ER基因(ERα、ERβ、ERβ1、ERβ2)的全長cDNA序列, 并采用定量PCR (Quantitative real-time polymerase chainreaction, qRT-PCR)方法研究興國紅鯉成體4種ER基因的組織表達特征及EE2暴露對興國紅鯉雌性幼魚肝中ER mRNA表達的影響, 旨在探討ER mRNA是否可以作為EE2的評價標志物。

1 材料與方法

1.1 試驗動物和試劑

試驗魚取自中國水產科學研究院長江水產研究所窯灣試驗場。取1齡的興國紅鯉成魚(♀/♂)的肝、脾、心、性腺、腎、肌肉、腸、腦等組織, 用于組織總RNA提取。用于暴露的興國紅鯉幼魚為150日齡[(3.3±0.054) g]。暴露之前將EE2 (Sigma, CAS. No. 57-63-6)溶于二甲基亞砜(Dimethyl Sulfoxide, DMSO)(CAS. No. 67-68-5)溶液。

1.2 EE2暴露實驗

參考Liao等[16]和Wang等[17]的研究, 本研究設置3個濃度EE2處理組: 0.01、0.1和1 nmol/L, 對照組僅加入DMSO (體積分數＜0.01%), 每個處理組/對照組設置3個平行。暴露實驗所用水箱為80 L, 所盛曝氣自來水體積為60 L。實驗采用半靜水方式水生生物毒性實驗法進行實驗。每天換水一半, 并添加相應量的EE2母液(100 nmol/L)以保證各缸藥品的濃度不變。暴露時間為4周(28d), 實驗全天用充氣泵增氧并及時清除排泄物。實驗水溫(25±1)℃,光照周期為16h∶8h(白晝/黑暗)。暴露過程中無個體死亡。分別在暴露7d、14d、21d和28d四個時間點采樣, 每次采樣每缸隨機取3尾雌幼魚, 采集肝樣品后立即放入RNA Save (Biological Industries)中保存備用。

1.3 總RNA的提取、單鏈cDNA及SMART cDNA合成

總RNA提取方法參照SV Total RNA Isolation System (Promega, 美國)試劑盒說明書, 以興國紅鯉雌性成魚的肝和卵巢組織總RNA為模板, 按照Super SMART?PCR cDNA Synthesis Kit操作手冊的方法合成興國紅鯉肝和卵巢的SMART cDNA。幼魚肝的第一鏈cDNA用PrimeScript?RT reagent Kit with gDNA Eraser(TaKaRa, Japan)試劑盒合成。

1.4 ERs基因全長cDNA的克隆及序列分析

根據鯉(Cyprinus carpio) ER基因cDNA序列(鯉ERα、ERβ、ERβ1、ERβ2的GenBank登錄號分別為BAF99812.1、BAB91218.1、BAF99813.1、BAF99814.1)設計引物(表 1)分別擴增ERα、ERβ、ERβ1、ERβ2的保守區域片段。根據所得保守片段,分別設計特異引物(表 1)擴增四種亞型的5′端和3′端(以ERα為例: ERα-F和ERα-R擴增保守區域片段, ERα-R1和ERα-R2擴增5′端; ERα-F1和ERα-F2擴增3′端)。采用RT-PCR和RACE方法, 以肝cDNA為模板克隆ERα、ERβ和ERβ1全長cDNA序列, 以卵巢cDNA為模板克隆ERβ2全長cDNA序列, 擴增產物均純化后連入pMD19-T載體, 轉化大腸桿菌感受態細胞(DH5α)擴培, 通過M13引物進行菌液PCR檢測陽性克隆, 送上海生工生物工程技術服務有限公司測序。采用Clustal X 1.8軟件將推算的ER氨基酸序列和NCBI公布的氨基酸序列比對。利用Mega6軟件鄰接法(Neighbor-Joining, N-J)構建系統發生樹。

表 1 本研究所用的引物序列Tab. 1 Primers used in the present study

1.5 ERs mRNA的組織分布的檢測

根據所得到的興國紅鯉ERα、ERβ、ERβ1和ERβ2 cDNA序列設計定量引物: RT-ERαF和RTERαR等(表 1), 以興國紅鯉雌雄成體組織(心、肝、脾、鰓、腎、腦、性腺、肌肉、腸) cDNA為模板進行qRT-PCR擴增, 并以興國紅鯉β-actin特異性引物β-actin F和β-actin R (表 1)作為內參基因, PCR在Bio-Rad CFX96TM Real Time System儀上進行, 反應程序為95℃預變性10min, 95℃變性15s, 58℃退火15s, 72℃延伸15s, 循環數為40。

1.6 EE2暴露后ERs mRNA表達量的測定

用qRT-PCR方法檢測, 對照組及各處理組分別取3個樣品, 每個樣品采用3個平行, PCR反應體系為: SYBR Green PCR Master Mix 10 μL, 上下游引物(濃度為10 μmol/L)各1 μL, cDNA模板1 μL和雙蒸水2 μL。反應程序為95℃預變性10min, 95℃變性15s, 58℃退火15s, 72℃延伸15s, 循環數為40。

1.7 統計分析

ERs mRNA表達量用相對表達量=2-ΔΔCt的方法, ΔΔCt=(Ct目的基因-Ct參考基因)EE2處理組-(Ct目的基因-Ct參考基因)對照組[24], 實驗數據均為平均值±標準差(SD)。用SPSS軟件進行單因素方差分析比較處理組和溶劑對照組的差異, P＜0.05表明差異顯著, P＜0.01表明差異極顯著。

2 結果

2.1 興國紅鯉ERs基因全長序列克隆

本研究克隆得到了興國紅鯉4種ER亞型的全長cDNA序列(GenBank登錄號: ERα, KU205259; ERβ, KU205260; ERβ1, KU205261; ERβ2, KU205262)。ERα全長2109 bp, 包含189 bp的5′非翻譯區(Untranslated Regions, UTR)和237 bp的3′UTR, 開放閱讀框(Opening reading frame, ORF)為1683 bp, 編碼560個氨基酸; ERβ全長2147 bp, 包含330 bp的5′UTR、編碼559個氨基酸的1680 bp ORF和137 bp的3′UTR; ERβ1全長2300 bp, 包含364 bp的5′UTR、編碼585個氨基酸的1758 bp ORF和178 bp的3′UTR; ERβ2全長2007 bp, 包含156 bp的5′UTR、編碼544個氨基酸的1635 bp ORF和216 bp的3′UTR。

2.2 興國紅鯉ER氨基酸序列同源性及系統發生分析

興國紅鯉4種ER分別與鯉、鯽等鯉科魚類相應ER亞型的氨基酸序列具有較高的相似性: ERα與鯉、臺灣鏟頜魚(Onychostoma barbatulum)、稀有鮈鯽的序列相似性分別為99%、90%和92%; ERβ與鯉、銀鯽(Carassius auratus gibelio)、倒刺鲃(Spinibarbus denticulatus)的序列相似性分別為98%、92%和92%; ERβ1與鯉、臺灣鏟頜魚、彭澤鯽(Carassius auratus var. pengze)的序列相似性分別為97%、86%和87%; ERβ2與鯉、彭澤鯽、稀有鮈鯽的序列相似性分別為99%、89%和92%。

利用Clustal X和Mega 6.0分析軟件, 采用N-J法對興國紅鯉及其他脊椎動物的ERs進行系統發生分析, 如圖 1所示, ER聚為兩類, 魚類及更高等的脊椎動物ERα聚成一類, ERβ、ERβ1和ERβ2聚為一類;興國紅鯉的4種亞型分別與鯉的相應亞型親緣關系最近。

2.3 興國紅鯉ERs的組織表達

ERα、ERβ、ERβ1和ERβ2基因在興國紅鯉成體組織中廣泛表達(圖 2), 以各ER基因mRNA在雌性腦組織中的表達量作為對照, ERα在雌性興國紅鯉肝、腸和卵巢中的表達量比較高(圖 2A); ERβ主要在雌、雄興國紅鯉的肝、腸和雌魚的卵巢中表達(圖 2B); ERβ1主要在雌性興國紅鯉腸、肝、腦以及雄性興國紅鯉的腸和精巢中表達(圖 2C); ERβ2主要在雌雄興國紅鯉的肝, 性腺和腸中表達(圖2D)。

圖 1 興國紅鯉及其他脊椎動物雌激素受體系統進化樹Fig. 1 The phylogenetic tree of ER for Cyprinus carpio var singuonensis and other vertebrates

2.4 EE2暴露對興國紅鯉幼魚肝中四種ERs亞型表達影響

經過4周的EE2暴露試驗, 雌性興國紅鯉幼魚肝中ER各亞型的表達量均發生變化(圖 3), 在EE2暴露第1、2周, ERα基因mRNA的表達極顯著地升高,但第3周1 nmol/L的暴露組明顯降低(圖 3A)。3個EE2處理組ERβ的表達均有不同程度的升高, 并且隨著處理濃度的升高, 表達量也會相應地增加; 在第3周時, 0.1和1 nmol/L處理組ERβ的表達量達到了最高值, 到第4周有所下降(圖 3B)。ERβ1基因mRNA表達量第1、2周受到明顯抑制, 第3周以后0.1 nmol/L的暴露組有明顯的上升趨勢(圖 3C)。EE2處理第1周, ERβ2基因的表達受到明顯抑制, 處理濃度為0.01 nmol/L時抑制作用達到了顯著的水平; 處理第3周時0.1 nmol/L EE2抑制ERβ2基因表達的作用減弱(圖 3D)。

3 討論

在高等脊椎動物中雌激素受體只存在ERα和ERβ兩種亞型, 但硬骨魚類的雌激素受體類型比哺乳動物等復雜。鯉中存在4種ER亞型: ERα、ERβ、ERβ1和ERβ2, Watabe等在2002年克隆得到了鯉的ERβ亞型, Katsu等[25]在2008年克隆得到了鯉的3種亞型: ERα、ERβ1和ERβ2。本研究克隆得到興國紅鯉ERα、ERβ、ERβ1和ERβ2的全長cDNA序列, 這與先前的研究結果一致。魚類ERs氨基酸序列比對結果表明: 興國紅鯉的4種ERs與鯉的相應亞型氨基酸序列的一致性高達97%以上, 且與其他幾種鯉科魚類的一致性也在86%以上, 這要高于鳉科、慈鯛科等魚類, 并且在系統發育分析樹中也得到了同樣的結果。這些結果表明ERs在鯉科魚類中高度保守。

圖 2 熒光定量PCR檢測興國紅鯉成體組織中ERs mRNA的轉錄水平Fig. 2 The mRNA lever of ERs in various tissues of adult Cyprinus carpio var singuonensis by real-time qPCR

興國紅鯉四種亞型ERα、ERβ、ERβ1和ERβ2基因在雌魚肝中的表達均有較高水平, 與彭澤鯽[26]、大鱗副泥鰍(Paramisgurnus dabryanus anus)[27]和黑頭呆魚(Pimephales promelas)[28]肝中ERs的表達情況一致。研究表明, 雌魚肝中ERα、ERβ、ERβ1和ERβ2表達量均高于雄性, 雌激素E2 激活的ERα 能夠誘導肝中Vtg表達水平的升高[29], 進而影響魚類的性腺發育; 但加州鱸(Micropterus salmoides)[30]和斑馬魚[31]中的研究表明, ERβ1和ERβ2沒有參與此過程。在本研究中, 雌魚中ERβ、ERβ1和ERβ2的表達量高于雄魚, 可能是由于所選試驗魚種類與發育程度的差別導致靶基因表達的不同[32]。ERα在雌性興國紅鯉肝、腸和卵巢中的表達量比較高, 該結果與稀有鮈鯽(Gobiocypri srarus)[17]的結果一致; ERα和ERβ在精巢中的表達量高于卵巢, 說明ERs在性腺中的表達具有差異性。ERs各亞型在雄性興國紅鯉精巢中的表達量也有較高的水平, 說明雌激素早已不是傳統意義上只對雌魚產生作用, 同時ERs各亞型在其他組織中不同程度的表達也說明雌激素受體在興國紅鯉中具有廣泛的生理功能。

圖 3 熒光定量PCR檢測EE2暴露4周興國紅鯉幼魚肝中ERs mRNA的轉錄水平Fig. 3 The effect of EE2 on the expression of ERs in liver of juveniles Cyprinus carpio var singuonensis

不同濃度(0.01、0.1和1 nmol/L)的EE2暴露處理對興國紅鯉雌性幼魚肝中ERs的表達產生了抑制或促進作用。暴露試驗中, 第1周和第2周ERα mRNA表達量明顯增大, 與大鱗副泥鰍[27]和斑馬魚[31]的結果一致, 第3周1 nmol/L的暴露組明顯降低, 說明ERα基因對1 nmol/L EE2短期(1—2周)反應的敏感性。3個EE2處理組ERβ的表達均有不同程度的升高, 且其表達量與處理濃度呈正相關; 但隨著暴露時間的延長, 在暴露第4周, ERβ的表達量呈下降趨勢, 這可能是受毒性作用影響的結果。ERβ1 mRNA表達量在暴露第1、2周受到明顯抑制, 在彭澤鯽[26]中也得出同樣的結果。ERβ2基因的表達在處理第1周受到抑制, 第3周時0.01 nmol/L EE2抑制ERβ2基因表達的作用減弱, 可能說明隨著暴露時間的推移,魚類肝對低濃度(0.01 nmol/L)的EE2產生了耐受作用。上述研究表明, 經EE2暴露4周, 興國紅鯉雌性幼魚肝中4個ER的表達量均有變化; 其中ERα可以作為環境EE2的短期(1—2周)敏感性生物學標志物;同時, 本研究也為EE2對興國紅鯉肝中ERs表達影響的研究提供了一定的分子依據。

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CLONE AND EXPRESSION OF ER GENES IN XINGGUO RED CARP AND THEIR EXPRESSION IN LIVER UPON EE2 EXPOSURE IN JUVENILES

SONG Ming-Yue1,2, SHAN Xi-Shuang1,2, CHEN Xi-Hua1, YUE Hua-Mei1, YE Huan1, YANG Xiao-Ge1and LI Chuang-Ju1
(1. Key Laboratory of Freshwater Biodiversity Conservation, Ministry of Agriculture of China, Yangtze River Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Wuhan 430223, China; 2. College of Fisheries and Life, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China)

The full-length cDNAs of estrogen receptors, ERα, ERβ, ERβ1 and ERβ2, were cloned from Xingguo red carp (Cyprinus carpio var singuonensis, Cs). The amino acid sequence of Cs ERs shared the highest identity with their counterparts of three cyprinid species. The ERs highly expressed in the liver, ovary and intestines of female Cs. In male Cs, ERα and ERβ mRNAs were mainly expressed in liver, and ERβ1 and ERβ2 mainly observed in intestine and testis, respectively. The mRNA level of ERα mRNAs was significantly up-regulated in in liver of Juveniles (150 dph) exposed to different concentrations (0.01, 0.1 and 1 nmol/L) of 17α-ethinylestradiol (EE2) for 1 and 2 weeks. The hepatic ERβ mRNA expression was dramatically increased by EE2 exposure, and ERβ1 mRNA expression was suppressed by EE2 for 1 and 2 weeks. The expression of ERβ2 mRNA was suppressed in the 1-week group with the highest suppression at 0.01 nmol/L of EE2. This study showed that EE2 differently regulated the expression of four ERs genes in liver. Compared to ERβ, ERβ1 and ERβ2, ERα is a more sensitive biomarker for short-term (1—2 week) EE2 exposure.

Estrogen receptor; Cyprinus carpio var singuonensis; 17α-Ethinylestradiol; Quantitative real-time PCR

Q344+.1

A

1000-3207(2017)01-0026-07

10.7541/2017.4

2016-01-08;

2016-05-17

國家高技術研究發展計劃項目(2011AA100401)資助 [Supported by the National High Technology Research and Development Program of China (2011AA100401)]

宋明月(1990—), 女, 河南新鄉人; 碩士研究生; 主要研究方向為魚類分子遺傳。E-mail: mysong90@163.com

李創舉, 博士, 副研究員, 碩士研究生導師, E-mail: lcj@yfi.ac.cn