脂肪酸影響草魚肝細胞脂質蓄積狀態及誘導其凋亡的離體研究

李雪賢 孫 健 吉 紅 陳昊杰

(西北農林科技大學動物科技學院, 楊凌 712100)

脂肪酸影響草魚肝細胞脂質蓄積狀態及誘導其凋亡的離體研究

李雪賢 孫 健 吉 紅 陳昊杰

(西北農林科技大學動物科技學院, 楊凌 712100)

為探究外源脂肪酸對草魚肝細胞脂質代謝及健康狀況的影響及其機理, 體外培養草魚肝細胞, 并采用不同濃度(0—1 mmol/L)油酸(Oleic acid)進行細胞孵育, 噻唑蘭比色法(Methyl thiazolte trazoliu, MTT)和油紅O染色提取法檢測肝細胞活力及脂質蓄積狀況, BODIBY和DAPI染色法觀察肝細胞脂滴及細胞核情況, 流式細胞術檢測肝細胞凋亡率變化, Real-time qPCR檢測脂質合成標志基因過氧化物酶體增殖物激活受體γ (Peroxidase proliferation activated receptor, PPARγ)和CCAAT/增強子結合蛋白α (CCAAT/enhancer binding protein alpha, C/EBPα)、凋亡相關基因Caspase家族等的表達情況。結果顯示, 隨著油酸處理濃度的增加, 肝細胞活力和細胞內脂質積累呈現先上升后下降的趨勢, 分別在0.4和0.6 mmol/L時達到最大值(P＜0.05); 肝細胞凋亡率則先下降后上升, 在0.4 mmol/L油酸處理時最低, 1 mmol/L油酸處理時最高(P＜0.05); 此外, 0.4 mmol/L油酸處理抑制了肝細胞Caspase-3b和Caspase-9基因的表達, 上調Bcl-2/Bax mRNA比值(P＜0.05), 而0.8 mmol/L油酸處理顯著促進Caspase-3b、Caspase-8、Caspase-9及凋亡誘導因子(Apoptosis inducing factor, AIF)基因的表達, 下調Bcl-2/Bax的mRNA比值(P＜0.05)。研究表明, 一定濃度的脂肪酸可增強草魚肝細胞活力, 促進胞內脂質積累, 抑制細胞凋亡, 而脂肪酸濃度過高則抑制肝細胞活力并誘導肝細胞凋亡, 其作用與脂肪酸影響脂質代謝及凋亡基因的表達有關。

脂肪酸; 肝細胞; 凋亡; 草魚

脂肪酸作為重要的營養物質和信號分子, 對魚類的生長、發育和繁殖具有多方面的作用[1]。機體內的游離脂肪酸(FFA)一方面經吸收、轉運至貯存場所, 形成甘油三酯(TAG), 另一方面可以分解、代謝供應機體的能量需求[2]。肝臟是魚體內最主要的代謝器官, 參與體內的消化、代謝、解毒及免疫等多種功能, 也是魚類脂肪合成的主要場所, 其在魚類脂代謝過程中起著重要的調節作用[3,4]。肝臟是脂質代謝的主要場所, 當肝臟內積聚的FFA超過合成和分解代謝需要時, 細胞內FFA動態平衡被打破, TAG在肝細胞內大量儲存, 導致肝細胞脂肪變性, 使肝臟對炎癥反應和各種損傷因素的敏感性增高[5—7]。過量的脂質沉積還會導致細胞線粒體功能障礙, 造成脂毒性, 致使細胞的損傷和凋亡[8—10]。已有研究發現, 脂肪肝病變的大黃魚肝臟中FFA含量顯著上升, 說明過量的FFA進入肝臟, 造成大黃魚肝臟脂質積累[11]。這種因能量攝入過多導致肝細胞內過量蓄積脂質的肝病稱為魚類營養性脂肪肝[12]。盡管已有較多報道探討了脂質對魚類肝臟脂質代謝及健康狀況的影響[13—16], 但直接研究脂肪酸對肝細胞凋亡作用的報道還比較有限, 相關研究有待進一步深入。

為了深入系統地探討脂肪酸對草魚肝細胞脂質代謝及凋亡特性的影響及其作用機制, 本研究在離體條件下, 以油酸為代表, 研究不同濃度脂肪酸處理情況下草魚肝細胞活力、脂質蓄積和細胞凋亡的狀況, 為魚類營養性脂肪肝的發病機制及防控對策的研究提供參考資料。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

胎牛血清、M199培養基及無脂肪酸牛血清白蛋白購自Gibco公司, 油紅O、MTT、BODIPY、DAPI和油酸均購自Sigma公司, 碳酸氫鈉、無水乙醇等化學試劑均為國產分析純。Trizol、反轉錄試劑盒及熒光定量試劑盒購自TaKaRa公司, Annexin V-FITC/PI試劑盒購自北京全式金生物公司。油酸用無水乙醇配制成0.1 mol/L貯存液, 保存于-20℃,使用前用2%無脂肪酸牛血清白蛋白的M199培養基將脂肪酸稀釋成0.01 mol/L。

1.2 草魚肝細胞的培養

草魚肝細胞(L8824)購自中國典型培養物保藏中心(China Center for Type Culture Collection, CCTCC)。將肝細胞置于10%胎牛血清的M199培養液中, 并于28℃、5% CO2飽和濕度培養箱中培養。隔天換液, 待細胞生長至匯合后, 設置處理組和對照組。對照組使用10%胎牛血清的M199培養液培養, 處理組使用含不同濃度油酸的培養液培養。

1.3 MTT檢測不同濃度油酸對肝細胞活力影響

草魚肝細胞均勻接種于96孔板, 使用含不同濃度油酸(0、0.2、0.4、0.6、0.8和1 mmol/L)的培養液培養肝細胞24h后, 每孔加入20 μL的MTT (5 mg/mL),于28℃、5% CO2條件下繼續培養4h, 吸棄培養液后, 用PBS洗1次后, 每孔加入150 μL二甲基亞砜(Dimethyl sulfoxide, DMSO), 28℃孵育10min, 溶解細胞中的甲臢。使用酶標儀于490 nm波長處測定吸光度值, 每組6個重復。

1.4 油紅O染色提取法測定脂質含量

草魚肝細胞均勻接種于96孔板, 使用上述不同濃度油酸培養細胞24h后, 棄去培養基, 每孔用PBS洗2次, 加入濃度為10%的甲醛固定液固定30min, PBS洗2次, 加入新鮮配制的油紅O染液浸染15min, PBS清洗2次, 于倒置顯微鏡下觀察細胞內脂滴的染色情況, 并拍照記錄。隨后向每孔加入150 μL的異丙醇萃取, 于490 nm波長處測定吸光度值, 每組6個重復。

1.5 BODIPY染色法和DAPI染色法觀察肝細胞內脂滴和細胞核變化

草魚肝細胞均勻接種于48孔板, 給予上述不同濃度油酸處理24h。棄去培養基, 每孔加入0.5 mL固定液, 固定30min。吸棄固定液, PBS洗兩次, 同時加入BODIPY染色液和DAPI染色液染色15min。吸棄染色液, PBS洗兩次, 每次5min。加入少量PBS (防止過干細胞皺縮), 熒光顯微鏡下觀察并照相。

1.6 流式細胞術檢測不同濃度油酸對肝細胞凋亡的影響

草魚肝細胞均勻接種于25 cm2培養瓶中, 使用含不同濃度油酸的培養基處理細胞24h, 收集細胞,用預冷的PBS洗滌細胞, 并以100 μL冷結合緩沖液懸浮細胞, 加入10 μL Annexin V-FITC染液和10 μL PI染液混勻室溫孵育15min, 再加入400 μL結合緩沖液, 流式細胞儀檢測細胞凋亡情況, 每組3個重復,根據陰性對照設定適當的直線門。

1.7 Real-time PCR檢測相關基因的mRNA的表達

草魚肝細胞均勻接種于24孔板, 分別使用含0.4和0.8 mmol/L油酸培養基處理細胞24h后, 棄去培養基, PBS清洗2次, 提取總RNA, 并反轉錄。采用CFX-96實時定量PCR檢測系統(Bio-Rad, USA)檢測相關基因的mRNA表達水平。20 μL反應體系,包括: 上下游引物(10 mmol/μL)各0.6 μL、cDNA 1 μL、2×SYBR Premix Ex TaqTMII 10 μL、滅菌雙蒸水加至20 μL。反應條件: 95℃, 10s; 95℃, 15s, 57℃, 15s; 40個循環。根據擴增曲線得到的Ct值, 計算出目標基因與內參基因 β-actin 的比值2-ΔΔCt, 并以此計算出試驗組目標基因相對于對照組目標基因的表達倍數2-ΔΔCt, 從而制作相對定量的圖表, 每組3個重復?；驒z測實時定量引物見表 1。

1.8 統計分析

所有數據均以平均值±標準差(Mean±SD)表示。采用SPSS18.0軟件中的單因素方差分析(One-way ANOVA)以及鄧肯(Duncan)多重比較對所得數據進行顯著性檢驗分析。當P＜0.05, 認為差異顯著。

2 結果

2.1 油酸處理對草魚肝細胞活力的影響

從圖 1可以看出, 隨著油酸處理濃度的升高, 肝細胞活力先升高后降低(P＜0.05), 且油酸處理濃度為0.6 mmol/L時, 肝細胞活力最高(P＜0.05), 但是當油酸濃度上升至0.8 mmol/L時, 肝細胞活力顯著下降, 但相比于對照組仍有促進作用(P＜0.05), 而當油酸濃度達到1 mmol/L時, 肝細胞活力被抑制(P＜0.05)。

表 1 實時定量檢測引物列表Tab. 1 Primer used for quantitative real-time PCR

圖 1 不同濃度油酸對草魚肝細胞活力的影響(n=6Fig. 1 Viability of Ctenopharyngodon idellus hepatocytes cells after exposure to various doses of oleic acid (n=6,

2.2 油酸處理對草魚肝細胞脂質蓄積的影響

油紅O染色及脂質提取結果 對照組(圖 2A)細胞邊緣清晰, 呈多角形排列, 細胞間結合緊密, 無縫隙。油紅O染色顯示細胞內少見紅色脂滴。而分別使用0.2、0.4和0.6 mmol/L濃度油酸處理后, 肝細胞多變為圓形或橢圓形, 脂滴成環狀位于細胞膜內側, 將細胞核擠向一側(分別為圖 2B-D), 但是當油酸處理濃度上升至0.8和1 mmol/L后, 肝細胞間結合不再緊密, 棱角不清, 細胞數量減少(圖 2E, 2F)。油紅O染色提取比色法(以OD值表示)定量分析細胞內TAG的含量, 結果表明, 隨著油酸處理濃度的增加, 肝細胞TAG含量逐漸增加(P＜0.05), 且在油酸濃度達到0.4 mmol/L時, 肝細胞TAG含量達到最大值(P＜0.05)。在此之后隨油酸的濃度的升高, 肝細胞TAG含量顯著降低(P＜0.05)(圖 3)。

BODIPY和DAPI染色相比于對照組(圖 4A),隨著油酸處理濃度的升高(0.2—0.6 mmol/L), 肝細胞數量逐漸增加, 脂滴增多變大, 肝細胞核為圓形或橢圓形, 呈現均勻的藍色(分別為圖 4B-D)。而當油酸濃度達到0.8和1 mmol/L時, 肝細胞數量下降,細胞內脂滴減少, 細胞核變小, 染色質凝集而呈現致密濃染, 甚至出現碎塊狀, 出現明顯的凋亡特征(圖 4E, 4F, 如圖中箭頭所示)。

2.3 油酸處理對草魚肝細胞凋亡率的影響

相比于對照組(圖 5A), 0.4 mmol/L濃度油酸處理的草魚肝細胞凋亡率顯著降低(圖 5C), 但在此之后, 隨著油酸處理濃度的增加, 肝細胞凋亡率顯著上升(P＜0.05)。

2.4 油酸處理對草魚肝細胞脂質生成基因和凋亡相關基因表達的影響

圖 2 油紅O染色觀察油酸誘導24h后草魚肝細胞中的脂質積累和細胞形態變化Fig. 2 Oil red O staining analysis of the accumulation of lipid droplets and morphological changes in C. idellus hepatocytes after 24 hours treatment with oleic acidA. 0 (×100); B. 0.2 mmol/L (×100); C. 0.4 mmol/L (×100); D. 0.6 mmol/L (×100); E. 0.8 mmol/L (×100); F. 1 mmol/L (×100)

根據以上試驗結果選擇0.4和0.8 mmol/L濃度的油酸培養草魚肝細胞, 進行相關基因mRNA水平的檢測。如圖 6所示, 兩種油酸濃度處理肝細胞24h后, PPARγ和C/EBPα基因的mRNA表達量均顯著上升(P＜0.05)。凋亡相關基因mRNA水平的檢測發現, 與對照組相比, 0.4 mmol/L油酸抑制Caspase-3b和Caspase-9的mRNA表達(P＜0.05), 但對Caspase-8和AIF的mRNA表達并無影響。而當0.8 mmol/L油酸處理肝細胞時, Caspase-3b、Caspase-8、Caspase-9和AIF的mRNA表達均顯著上升(P＜0.05)。計算Bcl-2/Bax mRNA比值, 發現0.4 mmol/L油酸處理組的Bcl-2/Bax比值顯著高于對照組, 而0.8 mmol/L油酸處理組Bcl-2/Bax比值顯著低于對照組(P＜0.05)。

圖 3 不同濃度油酸處理后草魚肝細胞中甘油三酯含量(n = 6,±SD)Fig. 3 Triglyceride content in oleic acid -treated C. idellus hepatocytes (n=6,±SD)

3 討論

魚類營養性脂肪肝是一種由于高能日糧的攝入, 肝細胞中TAG合成量超過機體需要量, 而在肝細胞內過量蓄積脂質為特征的營養性疾病[12], 體內循環的FFA在肝脂肪變性過程中起到了至關重要的作用[17]。正常生理狀態時, 肝細胞內脂肪酸首先在線粒體中進行β氧化為機體提供能量, 多余的脂肪酸在內質網中合成脂蛋白或構成細胞的結構脂肪; 當脂肪酸過量輸送至肝臟時, 超過了肝細胞的處理能力, 導致脂肪酸的β氧化和脂蛋白合成障礙, TAG在肝細胞內大量蓄積進而導致細胞的脂肪變性[18, 19]。

目前, 對魚類營養性脂肪肝的研究最常采用的是動物模型, 鮮有采用細胞模型進行研究的報道[20—22]。本研究采用不同濃度的油酸處理草魚肝細胞, 研究外源脂肪酸對草魚肝細胞活力, 脂質蓄積和凋亡的影響。研究發現, 隨著油酸處理濃度的增加, 肝細胞活力和脂質含量均呈現先上升后下降的趨勢。已有研究指出, 油酸能夠促進小鼠原代肝細胞內TAG富集及脂滴的積累, 但對細胞凋亡的影響甚小[23]。Vinciguerra等[24]發現油酸的處理濃度在0.1 mmol/L以下時, 并不能影響HepG2的活性, 反而促進細胞的增殖; 當油酸濃度升高到0.2 mmol/L時, 細胞的活力顯著下降, Caspase-3酶活性增加。但也有研究表明, 0.2 mmol/L油酸并無細胞毒性, 也不會誘導細胞凋亡[25]。Gomez-Lechon等[26]等用油酸處理人原代肝細胞, 發現當油酸濃度上升至2 mmol/L時對細胞活性仍沒有顯著影響。Maestre等[27]研究顯示, 油酸濃度超過0.5 mmol/L時, Ins-1細胞有一半以上發生凋亡。而Ariel等[28]發現, 使用1 mmol/L的油酸和棕櫚酸混合物處理HepG2細胞可以刺激TNF-α的表達, 促進肝細胞脂毒性, 誘導細胞的凋亡。本研究發現, 油酸濃度在0.6 mmol/L以下時, 有促進細胞活力的作用; 而當濃度上升至0.8 mmol/L時, 細胞活力顯著降低(P＜0.05)。這可能是因為草魚肝細胞可以吸收利用一定水平的脂肪酸, 而且低濃度的油酸可能通過激活AKT通路促進細胞的增殖和TAG的累積; 而當油酸的濃度超過了機體所能承受的閾值,就會造成細胞的損傷和凋亡[29]。

圖 4 BODIPY和DAPI染色檢測油酸處理后草魚肝細胞脂滴和細胞核的變化(×200)Fig. 4 BODIPY和DAPI staining analysis of lipid droplets and nuclear change in C. idellus hepatocytes after treatment with oleic acid (×200)A. 0 (×200); B. 0.2 mmol/L (×200); C. 0.4 mmol/L (×200); D. 0.6 mmol/L (×200); E. 0.8 mmol/L (×200); F. 1 mmol/L (×200)

圖 5 Annexin V- FITC /PI流式細胞術檢測油酸誘導草魚肝細胞凋亡 (n=3,xˉ±SD)Fig. 5 Apoptosis of C. idellus hepatocytes were analyzed by flow cytometry with Annexin V-FITC and PI staining (n=3,xˉ±SD)四個象限：上左. 損傷及碎片；上右. 晚期凋亡細胞；下左. 正常細胞；下右. 早期凋亡細胞Four quadrants: UL. Injured cells; UR. Late apoptotic cells; LL. Viable cells; LR. Early apoptotic cells. A. 0; B. 0.2 mmol/L; C. 0.4 mmol/L; D. 0.6 mmol/L; E. 0.8 mmol/L; F. 1 mmol/L

眾所周知, 轉錄因子PPARγ在調節脂肪酸的攝取和貯存方面發揮著關鍵作用[30]。研究表明, 小鼠肝臟中特異性敲除PPARγ后, 可以免受肝臟脂肪變性的影響[31,32], 而過表達PPARγ后, 小鼠肝臟發生脂肪變性, 成脂基因和脂肪合成相關基因被激活[33]。C/EBPα被認為是調節脂肪細胞分化的關鍵轉錄因子[34], 但有研究發現C/EBP家族在非酒精性脂肪肝(NAFLD)的形成中也發揮著重要的作用[35]。Zhang等[36]研究發現C/EBPα的基因和蛋白表達在NAFLD的早中期升高, 而在后期降低。同時有研究證明NAFLD模型中PPARγ和C/EBPα的mRNA表達均顯著升高,說明PPARγ和C/EBPα對肝細胞脂質蓄積過程具有重要的作用[37]。在本試驗中, 0.4和0.8 mmol/L兩種濃度油酸處理時, PPARγ和C/EBPα的基因表達量都顯著上調, 表明外源性脂肪酸造成肝細胞脂質積累很可能是通過促進PPARγ和C/EBPα的表達實現的。

圖 6 Real-time PCR法測定油酸誘導后草魚肝細胞中相關基因的相對表達量(n=3,±SD)Fig. 6 The relative expression level of related genes in C. idellus hepatocytes after treatment with oleic acid were examined by Real-time PCR (n=3,±SD)

細胞凋亡是多基因嚴密調控的結果。目前認為, 細胞凋亡發生機制主要包括死亡受體信號轉導通路、線粒體信號通路和內質網途徑[38], 而在肝細胞凋亡中, 通常將內質網凋亡途徑包含在線粒體凋亡信號通路中[39]。Malhi等[40]發現過量的FFA能夠激活JNK依賴的線粒體凋亡途徑導致細胞色素C釋放和促凋亡蛋白Bcl-2激活, 誘發細胞凋亡。Feldstein等[41]認為油酸處理肝細胞會使溶酶體失去穩定性, 進而激活NF-κB依賴的TNF-α表達, 導致細胞的凋亡。在肝細胞凋亡過程中, Caspase家族也發揮著巨大的作用。本實驗室研究發現, 草魚的Caspase-3基因分為Caspase-3a (GenBank登錄號KP145001)和Caspase-3b (GenBank登錄號KP145002)兩種亞型,本試驗檢測了兩種不同濃度油酸處理草魚肝細胞時這兩種基因亞型的表達狀況, 發現Caspase-3a和Caspase-3b的表達模式完全不同。高低油酸濃度處理的肝細胞中, Caspase-3a的mRNA表達量都顯著下降; 而Caspase-3b的mRNA表達量在低濃度油酸處理時顯著下降, 在高濃度油酸處理時顯著上升(P＜0.05)。同一基因兩種基因型的不同表達, 說明在FFA誘導的草魚肝細胞凋亡中, Caspase-3b發揮主要作用。Caspase-8和Caspase-9是凋亡的啟動者, 二者活化后再激活下游的Caspase-3, 觸發凋亡的級聯反應, 導致細胞的凋亡[42]。凋亡誘導因子(AIF)可以引發不依賴于Caspase的細胞凋亡, 當細胞受到凋亡刺激后, AIF釋放, 引起細胞核內染色體凝聚、DNA片段化[43]。本研究發現, 當油酸處理濃度達到0.8 mmol/L時, 肝細胞內Caspase-8、Caspase-9和AIF基因的mRNA水平顯著上調(P＜0.05)。而0.4 mmol/L油酸處理組, Caspase-9的基因表達量甚至低于對照組, 說明0.8 mmol/L的油酸已經超過細胞對FFA的最大承受能力, 可能已造成細胞的損傷。細胞受到凋亡刺激時, 抗凋亡蛋白活性被抑制, 并激活促凋亡蛋白活性, 導致促凋亡因子釋放[44]。Bcl-2/Bax mRNA的比值被稱作凋亡開關, 當二者比值升高時,抑制細胞的凋亡; 比值降低時, 促進細胞的凋亡[45]。在本研究中, 0.4 mmol/L油酸處理肝細胞時, Bcl-2/Bax比值上升, 顯示抗凋亡因子占優勢, 細胞的凋亡被抑制; 當油酸濃度上升至0.8 mmol/L時, Bcl-2/Bax mRNA比值顯著下降, 說明促凋亡因子起主導作用, 細胞凋亡被激活。Shimabukuro等[46]也發現1 mmol/L的FFA混合物(油酸∶棕櫚酸2∶1)能抑制胰島B細胞Bcl-2的基因和蛋白表達, 而添加瘦素可以使其恢復正常。而Maestre等[27]的研究發現, 油酸孵育不僅使得INS-1細胞的Bcl-2蛋白表達下調, 同時還會增加細胞色素C和AIF的釋放量。提示FFA對細胞的毒性可能是通過損傷線粒體進行的[27]。

綜上所述, 本研究發現, 隨著油酸處理濃度的增加, 肝細胞脂質蓄積量呈現一個先增加后降低的趨勢, 脂質合成基因的表達呈現相同的趨勢。且低濃度的油酸并不會造成肝細胞的凋亡, 反而促進肝細胞增殖, 過高濃度的油酸則會導致細胞凋亡。這說明草魚肝細胞可耐受一定水平的外源脂肪酸, 但脂肪酸劑量過高時, 則會引起細胞功能紊亂, 導致細胞的凋亡, 這可能與過量的FFA促使草魚肝細胞中促凋亡因子Bcl-2和AIF被激活, 誘發Caspase家族的級聯反應, 同時抑制了抗凋亡因子Bax的活性密切相關。

[1]Watanabe T. Lipid nutrition in fish [J]. Comparative Biochemistry and Physiology Part B: Comparative Biochemistry, 1982, 73(1): 3—15

[2]Sheridan M A. Lipid dynamics in fish: aspects of absorption, transportation, deposition and mobilization [J]. Comparative Biochemistry and Physiology Part B: Comparative Biochemistry, 1988, 90(4): 679—690

[3]Guo X Z, Liang X F, Fang L, et al. Effects of non-protein energy sources on serum biochemical indices and histology of liver in grass carp, Ctenopharyngodon idellus [J]. Acta Hydrobiologica Sinica, 2014, 38(3): 582—587 [郭小澤, 梁旭方, 方劉, 等. 飼料中非蛋白能量源對草魚血清生化指標和肝臟組織的影響. 水生生物學報, 2014, 38(3): 582—587]

[4]Tocher D R. Metabolism and functions of lipids and fatty acids in teleost fish [J]. Reviews in Fisheries Science, 2003, 11(2): 107—184

[5]Trauner M, Arrese M, Wagner M. Fatty liver and lipotoxicity [J]. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Molecular and Cell Biology of Lipids, 2010, 1801(3): 299—310

[6]Bradbury M W. Lipid metabolism and liver inflammation. I. Hepatic fatty acid uptake: possible role in Steatosis [J]. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology, 2006, 290(2): G194—G198

[7]Ji J, Zhang L, Wang P, et al. Saturated free fatty acid, palmitic acid, induces apoptosis in fetal hepatocytes in culture [J]. Experimental and Toxicologic Pathology, 2005, 56(6): 369—376

[8]Schrauwen P, Schrauwen-Hinderling V, Hoeks J, et al. Mitochondrial dysfunction and lipotoxicity [J]. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Molecular and Cell Biology of Lipids, 2010, 1801(3): 266—271

[9]Unger R H, Orci L. Lipoapoptosis: its mechanism and its diseases [J]. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Molecular and Cell Biology of Lipids, 2002, 1585(2): 202—212

[10]Gentile C L, Pagliassotti M J. The role of fatty acids in the development and progression of nonalcoholic fatty liver disease [J]. The Journal of Nutritional Biochemistry, 2008, 19(9): 567—576

[11]Zeng D, Mai K S, Ai Q H. Effects of fatty liver syndrome on liver lipid composition, metabolism related enzymes and antioxidase in large yellow croaker, Pseudo sciaena crocea [J]. Periodical of Ocean University of China, 2008, 38(4): 542—546 [曾端, 麥康森, 艾慶輝. 脂肪肝病變大黃魚肝臟脂肪酸組成, 代謝酶活性及抗氧化能力的研究. 中國海洋大學學報: 自然科學版, 2008, 38(4): 542—546]

[12]Du Z Y. Causes of fatty liver in farmed fish: a review and new perspectives [J]. Journal of Fisheries of China, 2014, 9: 53 [杜震宇. 養殖魚類脂肪肝成因及相關思考. 水產學報, 2014, 9: 53]

[13]Ji H, Li J, Liu P. Regulation of growth performance and lipid metabolism by dietary n-3 highly unsaturated fatty acids in juvenile grass carp, Ctenopharyngodon idellus [J]. Comparative Biochemistry and Physiology Part B:Biochemistry and Molecular Biology, 2011, 159(1): 49—56

[14]Ji H, Cao Y Z, Liu P, et al. Effect of dietary HUFA on thelipid metabolism in grass carp, Ctenopharymgodon idellus [J]. Acta Hydrobiologica Sinica, 2009, 33(5): 881—889 [吉紅, 曹艷姿, 劉品, 等. 飼料中HUFA影響草魚脂質代謝的研究. 水生生物學報, 2009, 33(5): 881—889]

[15]He A Y, Ning L J, Chen L Q, et al. Systemic adaptation of lipid metabolism in response to low-and high-fat diet in Nile tilapia (Oreochromis niloticus) [J]. Physiological Reports, 2015, 3(8): e12485

[16]Li C, Liu P, Ji H, et al. Dietary n-3 highly unsaturated fatty acids affect the biological and serum biochemical parameters, tissue fatty acid profile, antioxidation status and expression of lipid-metabolism-related genes in grass carp, Ctenopharyngodon idellus [J]. Aquaculture Nutrition, 2015, 21(3): 373—383

[17]Du Z Y, Clouet P, Zheng W H, et al. Biochemical hepatic alterations and body lipid composition in the herbivorous grass carp (Ctenopharyngodon idella) fed high-fat diets [J]. British Journal of Nutrition, 2006, 95(05): 905—915

[18]Perry R J, Samuel V T, Petersen K F, et al. The role of hepatic lipids in hepatic insulin resistance and type 2 diabetes [J]. Nature, 2014, 510(7503): 84—91

[19]Saponaro C, Gaggini M, Carli F, et al. The subtle balance between lipolysis and lipogenesis: a critical point in metabolic homeostasis [J]. Nutrients, 2015, 7(11): 9453—9474

[20]Du Z Y, Clouet P, Huang L M, et al. Utilization of different dietary lipid sources at high level in herbivorous grass carp (Ctenopharyngodon idella): mechanism related to hepatic fatty acid oxidation [J]. Aquaculture Nutrition, 2008, 14(1): 77—92

[21]Kuwashiro S, Terai S, Oishi T, et al. Telmisartan improves nonalcoholic steatohepatitis in medaka (Oryzias latipes) by reducing macrophage infiltration and fat accumulation [J]. Cell and Tissue Research, 2011, 344(1): 125—134

[22]Lu R H, Liang X F, Sun J J, et al. Establishment of a model of grass carp hepatocyte steatosis andanalysis of lipid metabolism gene expression [J]. Journal of Fishery Sciences of China, 2015, 22(1): 24—32 [盧榮華, 梁旭方,孫君君, 等. 草魚肝細胞脂變模型的建立及脂代謝基因表達分析. 中國水產科學, 2015, 22(1): 24—32]

[23]Mei S, Ni H M, Manley S, et al. Differential roles of unsaturated and saturated fatty acids on autophagy and apoptosis in hepatocytes [J]. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics, 2011, 339(2): 487—498

[24]Vinciguerra M, Carrozzino F, Peyrou M, et al. Unsaturated fatty acids promote hepatoma proliferation and progression through downregulation of the tumor suppressor PTEN [J]. Journal of Hepatology, 2009, 50(6): 1132—1141

[25]Vock C, Gleissner M, Klapper M, et al. Oleate regulates genes controlled by signaling pathways of mitogen-activated protein kinase, insulin, and hypoxia [J]. Nutrition Research, 2008, 28(10): 681—689

[26]Gomez-Lechon M J, Donato M T, Martínez-Romero A, et al. A human hepatocellular in vitro model to investigate steatosis [J]. Chemico-biological Interactions, 2007, 165(2): 106—116

[27]Maestre I, Jordán J, Calvo S, et al. Mitochondrial dysfunction is involved in apoptosis induced by serum withdrawal and fatty acids in the β-cell line INS-1 [J]. Endocrinology, 2003, 144(1): 335—345

[28]Okamoto Y, Tanaka S, Haga Y. Enhanced GLUT2 gene expression in an oleic acid-induced in vitro fatty liver model [J]. Hepatology Research, 2002, 23(2): 138—144

[29]Vinciguerra M, Veyrat-Durebex C, Moukil M A, et al. PTEN down-regulation by unsaturated fatty acids triggers hepatic steatosis via an NF-κBp65/mTOR-dependent mechanism [J]. Gastroenterology, 2008, 134(1): 268—280

[30]Cristancho A G, Lazar M A. Forming functional fat: a growing understanding of adipocyte differentiation [J]. Nature Reviews Molecular Cell Biology, 2011, 12(11): 722—734

[31]Gavrilova O, Haluzik M, Matsusue K, et al. Liver peroxisome proliferator-activated receptor γ contributes to hepatic steatosis, triglyceride clearance, and regulation of body fat mass [J]. Journal of Biological Chemistry, 2003, 278(36): 34268—34276

[32]Matsusue K, Haluzik M, Lambert G, et al. Liver-specific disruption of PPARγ in leptin-deficient mice improves fatty liver but aggravates diabetic phenotypes [J]. Journal of Clinical Investigation, 2003, 111(5): 737

[33]Yu S, Viswakarma N, Batra S K, et al. Identification of promethin and PGLP as two novel up-regulated genes in PPARγ1-induced adipogenic mouse liver [J]. Biochimie, 2004, 86(11): 743—761

[34]Linhart H G, Ishimura-Oka K, DeMayo F, et al. C/EBPα is required for differentiation of white, but not Brown adipose tissue [J]. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2001, 98(22): 12532—12537

[35]Qiao L, MacLean P S, You H, et al. Knocking down liver CCAAT/enhancer-binding protein α by adenovirustransduced silent interfering ribonucleic acid improves hepatic gluconeogenesis and lipid homeostasis in db/db mice [J]. Endocrinology, 2006, 147(6): 3060—3069

[36]Zhang X, Yang J, Guo Y, et al. Functional proteomic analysis of nonalcoholic fatty liver disease in rat models: Enoyl-coenzyme a hydratase down-regulation exacerbates hepatic steatosis [J]. Hepatology, 2010, 51(4): 1190—1199

[37]Pettinelli P, Videla L A. Up-regulation of PPAR-γ mRNAexpression in the liver of obese patients: an additional reinforcing lipogenic mechanism to SREBP-1c induction [J]. The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism, 2011, 96(5): 1424—1430

[38]Jaeschke H, Bajt M L. Regulation of apoptotic signaling pathways in hepatocytes in vivo [J]. Hepatology, 2003, 37(4): 942—945

[39]Gottlieb R A. Mitochondria and apoptosis [J]. Neurosignals, 2001, 10(3—4): 147—161

[40]Malhi H, Bronk S F, Werneburg N W, et al. Free fatty acids induce JNK-dependent hepatocyte lipoapoptosis [J]. Journal of Biological Chemistry, 2006, 281(17): 12093—12101

[41]Feldstein A E, Werneburg N W, Canbay A, et al. Free fatty acids promote hepatic lipotoxicity by stimulating TNF-α expression via a lysosomal pathway [J]. Hepatology, 2004, 40(1): 185—194

[42]Yin X M, Ding W X. Death receptor activation-induced hepatocyte apoptosis and liver injury [J]. Current Molecular Medicine, 2003, 3(6): 491—508

[43]Cregan S P, Dawson V L, Slack R S. Role of AIF in caspase-dependent and caspase-independent cell death [J]. Oncogene, 2004, 23(16): 2785—2796

[44]Ramalho R M, Cortez-Pinto H, Castro R E, et al. Apoptosis and Bcl-2 expression in the livers of patients with steatohepatitis [J]. European Journal of Gastroenterology & Hepatology, 2006, 18(1): 21—29

[45]Scopa C D, Vagianos C, Kardamakis D, et al. bcl-2/bax ratio as a predictive marker for therapeutic response to radiotherapy in patients with rectal cancer [J]. Applied Immunohistochemistry & Molecular Morphology, 2001, 9(4): 329—334

[46]Shimabukuro M, Wang M Y, Zhou Y T, et al. Protection against lipoapoptosis of β cells through leptin-dependent maintenance of Bcl-2 expression [J]. Proceedings of the National Academy of Sciences, 1998, 95(16): 9558—9561

INFLUENCE OF FATTY ACIDS ON LIPID ACCUMULATION AND APOPTOSIS STATUS OF GRASS CARP CTENOPHARYNGODON IDELLUS HEPATOCYTE IN VITRO

LI Xue-Xian, SUN Jian, JI Hong and CHEN Hao-Jie
(College of Animal Science and Technology, Northwest A & F University, Yangling 712100, China)

To investigate the effects of fatty acids on hepatocyte lipid metabolism and health status of grass carp (Ctenopharyngodon idellus), the normal grass carp hepatocytes were cultured with different concentrations of oleic acid (0—1 mmol/L) for 24h to measure cell viability and lipids content by methylthiazolyl tetrazolium (MTT) assay and oil red O staining, respectively. The lipid droplets and nuclear of hepatocytes were observed with BODIPY and DAPI staining. Hepatocyte apoptosis was analyzed by flow cytometry. Real-time qPCR was performed to detect the mRNA expression of peroxisome proliferator-activated receptor γ (PPARγ), CCAAT/enhancer binding protein alpha (C/EBPα) and apoptosis related genes [Caspase3a, Caspase-3b, Caspase-8, Caspase-9, apoptosis inducing factor (AIF), Bcl-2, Bax]. The results showed that the cell viability and intracellular lipid accumulation of hepatocytes increased significantly after treatment with 0.6 and 0.4 mmol/L oleic acid (P＜0.05). The lowest hepatocytes apoptosis rate was in 0.4 mmol/L group and the highest was in 1 mmol/L oleic acid group (P＜0.05). The mRNA levels of Caspase-3b and Caspase-9 reduced significantly and the mRNA ration of Bcl-2/Bax was elevated by 0.4 mmol/L oleic acid (P＜0.05). Consistently, 0.4 mmol/L oleic acid significantly reduced caspase-3b, caspase-9 and AIF mRNA levels and increased the mRNA ratio of Bcl-2/Bax (P＜0.05) and these genes showed opposite expression pattern in hepatocytes treated with 0.8 mmol/L oleic acid (P＜0.05). These results demonstrated dosage-dependent role for fatty acids in grass carp hepatocytes viability and intracellular lipid accumulation via the regulation of the genes related to lipid metabolism and apoptosis.

Fatty Acids; Hepatocyte; Apoptosis; Ctenopharyngodon idellus

Q173

A

1000-3207(2017)01-0056-09

10.7541/2017.8

2015-12-11;

2016-04-27

國家自然科學基金項目(31372538)資助 [Supported by the National Natural Science Foundation of China (31372538)]

李雪賢(1990—), 女; 碩士研究生; 主要從事水生動物營養與飼料學研究。E-mail: lxx0663@163.com

吉紅(1967—), 男, 河南靈寶人; 博士生導師; 主要從事水生經濟動物營養與飼料學研究。E-mail: jihong@nwsuaf.edu.cn