絲狀藍藻長孢藻屬的中國一新記錄種
——蒙氏長孢藻

熊志鵬宋高飛李守淳李仁輝

(1. 江西師范大學生命科學學院, 南昌 330022; 2. 中國科學院水生生物研究所, 武漢 430072)

絲狀藍藻長孢藻屬的中國一新記錄種
——蒙氏長孢藻

熊志鵬1宋高飛2李守淳1李仁輝2

(1. 江西師范大學生命科學學院, 南昌 330022; 2. 中國科學院水生生物研究所, 武漢 430072)

近期在湖北省陸水水庫進行野外調查時發現了在中國尚未報道的蒙氏長孢藻Dolichospermum mendotae (Trelease) Wacklin, et al. 2009。文章詳盡地描述了該種的特征, 并對其16S rRNA基因測序分析表明, 與日本、西班牙、捷克等地區所得到的該種的序列相似度很高, 顯示出來自不同地區的蒙氏長孢藻在分子系統進化樹上聚為一支。最后通過毒素分子檢測和生物試驗顯示分離于陸水水庫的三株蒙氏長孢藻不產神經毒素。

蒙氏長孢藻; 水華藍藻; 新記錄; 魚腥藻; 中國

淡水水體富營養化和藍藻水華的暴發是當今全球的一大環境問題和生態災難。隨著研究程度和方法的深入, 水華藍藻的多樣性也不斷地被顯示出來。目前浮游性的魚腥藻(Anabaena)包含了大約80個淡水形態種, 代表了一個寬泛的、多樣化的藍藻類群[6]。2009年Wacklin等通過16S rRNA基因序列的差異, 把大部分浮游性的原魚腥藻種類成立成長孢藻屬(Dolichospermum)[7]。所以, 同其他水華藍藻類群相似, 長孢藻屬的一些種類能夠產生具生物活性的肝毒素和神經毒素, 甚至異味物質, 對水生動物和人類健康表現出潛在的危害[3,4]。因此, 對長孢藻的形態多樣性、系統分類、生物學特性以及產毒性開展研究是非常必要的[5]。但是長孢藻的名稱在國內對并沒有得到較廣泛的使用, 如楊麗等[1]曾報道了8個浮游種類, 李守淳等[2]報道了2個新記錄浮游種類, 但當時仍歸類在魚腥藻屬中。2011年胡鴻鈞[8]而對浮游類魚腥藻的名稱進行了整理, 收錄了15個長孢藻種類。

最近在對湖北省赤壁市陸水水庫進行藍藻水華的調查時, 發現了一種在形態上類似于蒙氏長孢藻(Dolichospermum mendotae)的絲狀藍藻。通過對野外水體樣品中該形態藻絲的分離培養, 獲得了該種類的單種培養藻3株。然后通過對野外樣品和培養藻株的形態觀察和比較, 并進一步利用DNA序列分析, 確認該藻株為蒙氏長孢藻, 是一種尚未在中國報道過的新記錄種。

1 材料與方法

1.1 樣品的采集

采集地點位于湖北省赤壁市陸水水庫, 坐標為E113°53′21″、N29°41′46″, 用25號篩絹制作的浮游生物網采集水體中的藻類樣本。

1.2 藻種分離

使用經典的毛細管分離法: 將滅菌后的巴氏吸管制作成毛細管(Psateur Micropipette)于Nikon解剖鏡(Nikon SMZ 1500)下挑取單根藻絲, 然后轉移到含有2 mL CT培養基的24孔無菌培養板中, 放入光照培養箱中培養。培養條件: 溫度(25±1)℃, 光照強度為25 μE/(m2·s), 光照周期為12h∶12h (L∶D)。一般4—6周就可得到純培養藻株, 然后轉接到含有5 mL CT培養基的玻璃試管中保存。本研究使用的藻株的編號為CHAB3512和CHAB4408、CHAB4412,采集時間分別為2011年4月和2012年6月, 該藻種保存于中國科學院水生生物研究所有害藻類學科組藻種庫。

1.3 形態觀察

藻絲形態的觀察使用Nikon Eclipse 80i型光學顯微鏡, 外接數碼相機(DS-Ri1)與臺式計算機。數碼拍照和數據測量則通過圖像分析軟件NIS-Elements D 3.2實行。選取50個以上的藻體對各項數據進行測量統計。

1.4 DNA提取、PCR擴增和分子系統的分析

首先對培養藻株離心富集, 然后參照xanthogenate-SDS(XS)DNA抽提方法提取藻株基因組DNA[9], 將DNA保存于-20℃備用。PCR反應體系為50 μL, 包含200 mmol/L dNTP; 1.5 mmol/L MgCl2; 1×buffer PCR緩沖液; 1 μmol/L引物; 1 U Taq DNA聚合酶。藻株的16S rDNA序列擴增, 魚腥藻毒素和貝類毒素序列擴增所用引物見表 1。根據魚腥藻毒素和貝類毒素合成基因的特異性, 以及現有的參考文獻, 本研究選擇魚腥藻毒素合成基因anaF和貝類毒素合成基因sxtA相關的PCR擴增特異性引物作為藻株的魚腥藻毒素和貝類毒素合成基因的檢測引物。PCR擴增產物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測, 目的片段通過膠回收試劑盒回收(Bio-Flux), 克隆到pMD18-T載體(TaKaRa, Japan)上, 然后將克隆載體轉入感受態細胞E. coli DH5α中, 菌液送往北京華大基因科技有限公司進行測序。

獲得的序列通過NCBI的Blast進行比對, 并將獲得的序列和從GenBank數據庫中下載的基因序列用MAFFT進行多重序列比對[10], 然后進行序列保守區選擇(http://www.phylogeny.fr/version2_ cgi/one_task.cgi?task_type=gblocks), 利用PAUP軟件對序列飽和度檢測, 在未飽和的情況下用 Mr-ModelTest選擇模型(HKY+I+G), 應用PhyML version 3.5c構建最大似然樹(ML)[11]。用MEGA4構建鄰接樹(NJ), 參數如下: Kimura 2參數模型, 100次重復隨機加入序列, 用Bootstrap (1000 replicates)來檢驗各節點支持率[12]。應用Mrbayes 3.1.2軟件對序列數據進行貝葉斯分析(Bayes)[13], 以隨機樹起始, 運行5000000代(Generations), 每100代取樣并保存一次。在舍棄老化樣本(Burn-in samples)后, 根據剩余的樣本構建嚴格合意樹, 各分支的支持度使用貝葉斯后驗概率表示。ML、NJ及Bayes三個系統樹都以Microcystis aeruginosa為外類群。

1.5 小鼠生物試驗

試驗藻處理: 取培養至對數生長期的藻液, 濃度大約為105—106cells/mL, 采用5000 r/min離心10min收集藻細胞, 并用蒸餾水清洗沉淀2—3次。將收集到的藻泥等量分成兩份, 一份用于冷凍干燥測藻細胞干重, 一份用于后續試驗。將試驗藻泥用一定體積的生理鹽水(0.9% Nacl鹽溶液)稀釋成濃度梯度藻液, 濃度梯度設置為1 (540 mg/kg)、0.50 (300 mg/kg)、0.25 (140 mg/kg), 超聲破碎5min, 液氮/25℃水浴反復凍融3次, 用于破碎藻細胞, 得到的藻細胞破碎液直接用作實驗材料。

試驗小鼠: 試驗小白鼠購自湖北省疾病預防與控制中心的實驗動物中心, 清潔級(SPF), 昆明品系(KM), 雄性, 體重18—22 g。健康實驗小鼠隨機分組, 每組設3個重復, 分別取不同藻株的濃度梯度細胞注射液進行腹腔注射, 每只小鼠注射量為1 mL。腹腔注射1 mL生理鹽水作為空白對照。記錄小鼠中毒和死亡情況。

2 結果

2.1 蒙氏長孢藻Dolichospermum mendotae (Trelease) Wacklin, et al. 2009的形態特征

藻絲自由漂浮, 不規則纏繞。藻絲等極, 沿藻絲方向細胞呈柱狀, 藻絲末端不變細, 無膠質外鞘。營養細胞具氣囊, 圓柱形并且具圓形末端, 淡藍綠色, 細胞寬3.19—4.82 μm, 長為1.59—9.63 μm,長寬比為1.21—2.72 μm。異形胞單個間生, 橢圓形, 相對營養細胞稍寬, 寬4.24—6.25 μm, 長5.23—7.62 μm。孢子單個間生, 遠離異形胞, 長圓柱形具圓形末端, 有時呈輕微的弓形, 直徑3.84—7.04 μm, 長為14.85—44.71 μm。蒙氏長孢藻的具體形態見圖 1。

表 2列出了目前世界上所報道的關于蒙氏長孢藻的各指標具體信息情況。

蒙氏長孢藻一般浮游于較大的寡營養到輕微富營養的水庫、湖泊, 不常見, 有時形成輕微的水華。而陸水水庫在營養水平上正好屬于貧營養向中營養的過度階段(TN: 0.97—1.21 mg/L, TP: 0.02—0.05 mg/L)。

表 1 引物序列列表Tab. 1 Primers used in this study

圖 1 蒙氏長孢藻(字母A代表孢子, 字母H代表異形胞)Fig. 1 Dolichospermum mendotae (Trelease) Wacklin et al. 2009 (Letter ‘A' represents akinete, letter ‘H' as heterocyte)

2.2 分子系統分析

利用上述引物擴增16S rRNA基因, CHAB3512、CHAB4408和CHAB4412三株藻分別獲得了1404、1406和1405 bp的序列, GenBank編號分別為KJ482666、KJ482667、KJ482668。與GenBank藻株序列比對處理后, 截取了最大可使用的1030 bp構建系統發育樹(圖 2)。陸水水庫的三株蒙氏長孢藻與來自日本、西班牙、捷克等地區的蒙氏長胞藻(JN886024、FM242084、AB551482、FN691918)相似度均超過99%, 并很好的聚到一起。

2.3 毒素基因和生物毒性測試的檢測結果

本研究選擇魚腥藻毒素合成基因anaF和貝類毒素合成基因sxtA相關的PCR擴增, 但這3株蒙氏長孢藻均未發現產魚腥藻毒素和貝類毒素合成基因(圖 3)。

利用小鼠進行了進一步的毒性實驗。小鼠生物測試急性實驗24h內, 陰性對照組可自如爬行、進食和飲水, 無不適癥狀, 未有小鼠死亡現象發生。以產神經毒素saxitoxin的擬柱胞藻藻株Cylidrospermopsis raciborskii T3作為陽性對照, 其細胞處理液經小鼠腹腔注射后, 出現肌肉顫動、呼吸沉重、流涎、劇烈跳躍等典型的神經毒素中毒癥狀,并且毒素效應發生特別快, 注射后即發生毒素反應,且反應劇烈, 小鼠的存活時間在1—3min。而較高濃度的蒙氏長孢藻藻株的細胞注射液經腹腔注射后, 小鼠初期(10min)出現精神不振, 活動不適, 25min后恢復正常, 小鼠無死亡現象。

3 討論

魚腥藻屬(Anabaena Bory)由Bory于1822年創建, 以Anabaena oscillarioides為模式種, 既包括無氣囊、底棲種類, 也包括了具氣囊、浮游的類群, 隸屬于藍藻門(Cyanophyta), 念珠藻目(Nostocales), 念珠藻科(Nostocaceae), 魚腥藻亞科(Anabaenoideae)。然而以模式種A. oscillarioides為代表的底棲種類, 與具氣囊、浮游的魚腥藻類群在形態上, 生長習性和基因分子序列上都具有明顯的差異。由于模式種A. oscillarioides是底棲種類, 因此底棲種類就保留在原來的魚腥藻屬中, 而將具氣囊、浮游的魚腥藻類群中的一部分單獨劃分為一個新的屬——長孢藻屬Dolichospermum Ralfs 1850[7,17], 并以Dolichospermum flos-aquae (原來的Anabaena flos-aquae)作為其模式種。2009年Wacklin等[7]建立長胞藻屬的時候重新把原來魚腥藻的42個種類劃到了長孢藻屬內。在我國, 楊麗等[1]曾報道了10個浮游種類的魚腥藻, 這10個種類根據新的藍藻分類系統, 應該相應的改為歸屬于長孢藻屬內[1,2]。關于蒙氏長孢藻的特點, 它區別于其他長孢藻的主要特征是藻絲卷曲纏繞, 營養細胞為柱形, 異形胞和孢子不相鄰。相似的種類就是模式種水華長孢藻,但是后者的細胞是球形。表 2列出了目前報道的關于蒙氏長孢藻的各指標具體信息, 本種與Li等[18]在日本的北海道發現的藻株相比營養細胞和異形胞的直徑偏小, 而孢子的直徑卻偏大; 與Cronberg和Annadotter[19]所描述的蒙氏長孢藻相比其異形胞稍小, 而與Komárek[20]所描述的歐洲種在形態大小上沒有明顯差異。該種與D. sigmoideum (Nygaard) Wacklin, et al. 2009形態較為相似, 區別在于蒙氏長孢藻藻絲纏繞稍松, 藻絲較長, 經常形成的不規則纏繞群體狀態, 而D. sigmoideum藻絲纏繞較緊密,藻絲易斷裂成小片段。

表 2 不同研究中蒙氏長孢藻形態參數信息Tab. 2 Morphological characteristics of Dolichospermum mendotae in different studies

圖 2 基于16S rRNA基因序列構建的NJ/ML/Bayes分子系統樹Fig. 2 Maximum likelihood (ML) phylogenetic tree of cyanobacteria based on 16S rRNA Sequences (1030 bp) using the current GenBank data on cyanobacteria. Bootstrap values greater than 50% with distance/parsimony methods were indicated at the nodes with the form of NJ/ML/Bayers. Sequences from GenBank were indicated by accession numbers. The main clades were indicated by numbers. Sequences from this study were denoted with solid cycle

基于16S rRNA基因序列構建的分子系統樹分析顯示(圖 2), 長孢藻屬類群(Clade A and C)與底棲附著的魚腥藻類群(Clade G and H)形成明顯的不同分支, 同時也再次證明了長孢藻屬與其他的具異形胞的浮游類群, 如束絲藻(Clade B), 矛絲藻(Clade E)及Umezakia(Clade F)具有較近的親緣關系[4,14,21—23]。本研究所得的蒙氏長孢藻藻種的16S rRNA基因序列歸到長孢藻屬Clade C分支, 并且與其他研究中的蒙氏長孢藻序列聚到同一個支中, 與日本(AB551482)、西班牙(JN886024)、捷克(FN691918, FM242084)等地區所得到的序列相似度很高, 在基因水平上沒有明顯的差異。

圖 3 蒙氏長胞藻anaF和sxtA基因PCR擴增電泳圖Fig. 3 Electrophoresis results from anaF and sxtA gene of Dolichospermum mendotae

從這個16S rRNA基因系列的系統樹上可以看出, 長孢藻屬分布于位于系統發育樹的兩個不同的位置, 而長孢藻屬的模式種水華長孢藻位于系統樹的A分支, 而蒙氏長孢藻位于C分支。這主要的原因還是因為束絲藻屬的水華束絲藻和柔細束絲藻和長孢藻的種類混合在一個大類群中, 這2個屬的混合問題已經長期存在。

蒙氏長孢藻被認為具產神經毒素的能力, 比如,在芬蘭南部的兩個湖S??skj?rvi和S?yhteenj?rvi的水華中分離的D. mendotae均產神經毒素[24]。來自于加拿大湖泊的藻株NRC-44-1和NRC-525-17也能夠產神經毒素, 雖然這兩株藻一直被認為是水華長孢藻, 而Wantanabe則認為實際上應為蒙氏長孢藻[25],但由于缺少序列等更多信息, 暫時無法進一步確認這些結論。在本研究中, 通過魚腥藻毒素和貝類毒素的特異性引物對3株來自我國陸水水庫的蒙氏長孢藻進行初步檢測, 表明這些藻株并沒有魚腥藻毒素和貝類毒素的產毒基因。通過小鼠生物實驗也再次驗證了本研究中的蒙氏長孢藻都不產生神經毒素。未發現蒙氏長孢藻中國藻株的產毒特性, 可能是由于藻株過少, 或者區域性的局限。因此, 將來的研究需要分離到更大范圍和跟多的藻種, 深入地研究此類長胞藻的各種生物特性和產毒能力檢測。

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A NEWLY RECORDED SPECIES OF FILAMENTOUS CYANOBACTERIUM ——DOLICHOSPERMUM MENDOTA IN CHINA

XIONG Zhi-Peng1, SONG Gao-Fei2, LI Shou-Chun1and LI Ren-Hui2
(1. School of Sciences in Jiangxi Normal University, Nanchang 330022, China; 2. Key Laboratory of Algal Biology, Institute of Hydrobiology, Chinese Academy of Sciences, Wuhan 430072, China)

As a large group of water bloom forming cyanobacteria, Dolichospermum genus has been attracted more attention and its taxonomic status and biological characteristics were significantly improved. The present study performed a detailed description of a newly found Dolichospermum mendotae (Trelease) Wacklin, et al. 2009 from Lushui Reservoir, Hubei, China. Molecular phylogenetic analysis based on the 16S rRNA gene sequences showed that the Dolichospermum mendotae strain was very similar to the strains isolated from Japan, Spain and Czech. Cyanotoxin detection including neutoxin gene test and bioassay demonstrated that the Dolichospermum mendotae strain examined in this study was not neurotoxin producer.

Dolichospermum mendotae; Bloom forming cyanobacteria; New record; Anabaena; China

Q949.2

A

1000-3207(2017)01-0238-06

10.7541/2017.30

2016-01-04;

2016-05-17

國家自然科學基金(31470310)資助 [Supported by the National Natural Science Foundation of China (31470310)]

熊志鵬(1990—), 男, 江西高安人; 碩士; 主要從事藻類生物學研究。E-mail: 718957085@qq.com

李仁輝(1965—), 研究員; 主要從事藍藻分類系統以及藻類環境生物學研究。E-mail: reli@ihb.ac.cn