從葉綠體DNA角度分析云南省砂梨地方品種遺傳多樣性

齊丹+曹玉芬+田路明+董星光+張瑩+霍宏亮+常耀軍

摘要：探討云南地區砂梨種質資源的遺傳背景，選用4對呈現多態性的葉綠體引物，對19個原產于云南省的砂梨品種和3個對照品種的trnL-trnF、rbcL、trnS-psbC區域進行擴增。結果表明：4對引物的擴增結果合并后得到長度為3 831 bp葉綠體基因片段，含有4個單倍型（H1～H4）、14個多態性位點，其中單一突變位點11個，簡約信息性位點3個，插入/缺失（InDel）1個。19份砂梨種質的單倍型（基因）多樣性（Hd）、核苷酸多樣性（Pi）分別為0.602、0.000 38。合并后的片段經Tajimas D檢驗其D值基本未達顯著水平，遵循中性模型。4個葉綠體單倍型的中介網絡顯示：單倍型H1與H2、H3的親緣關系較近，而H4則與上述3個單倍型的親緣關系較遠。經葉綠體單倍型分析可知，云南砂梨地方品種的遺傳多樣性較為豐富。

關鍵詞：砂梨；葉綠體DNA；遺傳多樣性；親緣關系

中圖分類號： S661.203.2文獻標志碼：

文章編號：1002-1302（2016）08-0209-03

云南省位于我國西南地區，其西北部為橫斷山脈區，東南部為云貴高原，地形地貌復雜，植物種質資源豐富，是中國梨的起源地之一，原產梨種質資源有川梨（Pyrus pashia Buch-Ham.）、砂梨（P.pyrifolia Nakai.）、滇梨（P.pseudopashia Yü.）、豆梨（P.calleryana Dcne.），其中砂梨是云南省地方栽培梨品種的主體，分布于云南省大部分地區，地方優良品種諸多，如寶珠梨、巍山紅雪梨、富源黃皮梨、火把梨等[1]。了解地方品種的遺傳多樣性和親緣關系，對揭示云南省砂梨資源的起源、保護及利用有重要意義。

DNA分子標記技術，如RAPD、AFLP、SSR、IRAP等，已經廣泛應用在果樹植物遺傳多樣性、品種鑒定、親緣關系等研究領域[2-5]。葉綠體DNA（cpDNA）在大多數被子植物中屬母系遺傳，分子較小、高拷貝、結構簡單、保守性強，且沒有或很少經歷重組，其中的非編碼區域變異豐富，適于進行低分類階元系統起源、發育和進化研究[6]。cpDNA非編碼區序列在梨屬植物的野生群體和栽培品種的群體結構、系統發生地理學、進化、遺傳多樣性研究上都有應用[7-13]。本研究從母系遺傳的角度出發，對葉綠體非編碼區trnL-trnF，trnS-psbC和rbcL區域進行擴增，分析云南省砂梨資源的親緣關系和遺傳多樣性。

1材料與方法

1.1材料

19份中國砂梨、2份日本砂梨（豐水、長十郎）、1份川梨（酸罐梨）來自遼寧省興城市中國農業科學院果樹研究所國家果樹種質興城梨、蘋果圃。所有材料（表1）的葉片經液氮處理后保存于-70 ℃冰箱備用。

1.2方法

使用QIGEN試劑盒方法提取總DNA，4對葉綠體通用引物參照常耀軍等的試驗結果[14][生工生物工程（上海）股份有限公司合成]。對22份材料進行PCR擴增，對擴增產物進行2%瓊脂糖凝膠檢測，得到清晰的特異性條帶后，純化后交上海美吉生物醫藥科技有限公司（北京）測序。

2結果與分析

2.1變異位點鑒別和cpDNA單倍型多樣性

本試驗所用4對引物擴增所涉及的葉綠體DNA序列分別是trnL-trnF（P2、P3）、trnS-psbC（P9）、rbcL（CP03），其中P2、P3引物擴增的是trnL-trnF序列的不同區域。通過MEGA 5.2軟件對測序結果進行序列排比，并進行人工校正，序列長度分別為561 bp（trnL-trnF，P2）、448 bp（trnL-trnF，P3）、1 537 bp（trnS-psbC，P9）、1 285 bp（rbcL，CP03），合并后的長度為3 831 bp；多態性位點14個，其中單一突變位點11個，簡約信息性位點3個，8 bp（TCAATTAG）的堿基插入/缺失（InDel）1個（表2）。

2.2單倍型的中介網絡圖的構建

利用軟件NetWork ver 4.6.1.2，采用中介鄰接網絡算法和最大簡約算法分別計算和優化結果，構建試驗材料4個 cpDNA 單倍型間的關聯圖，其中單倍型、中介矢量載體的名稱分別為HAP、mv，結果見圖1。21個砂梨品種存在3種單倍型：HAP_1、HAP_2、HAP_3，3種單倍型包含的品種數目分別為5、5、11個，2個日本砂梨品種豐水和長十郎及昆明麻、秋白砂、野生砂梨同為H2。川梨品種酸罐梨獨有單倍型H4，與其他砂梨品種相比，在trnL-trnF-448區域（P3）中，有長達8 bp的堿基插入-缺失片段（TCAATTAG）。圖1顯示HAP_2包含HAP_3，位于中介網絡圖的軀干上，說明HAP_2和HAP_3的分化時間要早。HAP_1和HAP_2由mv1連接，HAP_2和HAP_4由mv2連接。在變異位點上，HAP_2和HAP_3有1個差異，HAP_1和HAP_2有1個差異，HAP_1和HAP_3有2個差異，HAP_4和HAP_2有13個差異，且含有8 bp （TCAATTAG）的堿基插入-缺失片段。

3討論與結論

單倍型H1的5個品種巴克斯、花紅、水汁梨、海東和牛頭的原產地位于滇西北地區。滇西北麗江梨區為橫斷山脈的一部分，立體地形復雜，屬于高原氣候[15]。推測單倍型H1的品種起源于該地區，由于地理隔離導致的生殖隔離，使其單獨聚為1組，該情況與貴州砂梨種質資源遺傳多樣性的ISSR分析結果相似[16]。單倍型H2、H3的品種分布范圍較廣泛，其中原產云南的品種除滇西北地區以外均有分布，單倍型多樣性體現了地理分布特點。來自日本的砂梨品種長十郎、豐水及野生砂梨、昆明麻、秋白砂同為H2，日本砂梨在日本沒有發現，野生種，也沒有相關的記載[17]，從葉綠體母系遺傳的角度分析其母系祖先可能同為野生砂梨。沈玉英等在用RAPD分析部分中國砂梨和和日本梨的研究中發現，秋白砂梨與長十郎顯示最高的相似系數[18]，本研究中秋白砂梨與長十郎的單倍型相同，從母系遺傳角度說明二者的親緣關系很近。

這些不同類型的變異組成了4種不同類型的單倍型，單倍型多樣性Hd為0.675，其中云南省地方砂梨品種的Hd值為0.602，與遼寧省地方梨品種的0.577相比稍高[14]，由于研究所用的引物相同，推測云南省梨種質資源多樣性更為豐富，低于福建省地方砂梨品種的Hd值0.660[19]、浙江省野生豆梨群體的Hd值0.719[8]和云南省野生川梨的Hd值 0.718[9]，分析其主要原因在于所選用的引物不同以及野生群體表現出更強的遺傳多樣性。

川梨起源于中國西南地區和喜馬拉雅山區，因此被視為東方梨和西方梨之間的過渡種[9]，本研究所選用的對照品種酸罐梨為原產于云南省的川梨品種。對測序結果進行分析發現，在trnL-trnF-448區域（P3）中，有長達8 bp的堿基插入（InDel），而在云南砂梨品種和日本砂梨品種中這段序列缺失，為川梨品種酸罐梨獨有，表明InDel作為1次突變事件，可用于系統發育分析，為闡明梨屬植物種間關系提供了重要信息來源[20-21]。云南地區的梨屬種質資源豐富，建議加強對云南省地方梨栽培品種和野生種的保護和利用，豐富梨育種基因庫。

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