ARHI對5-FU誘導胃癌細胞周期阻滯和凋亡的影響

唐海靈， 莊 坤， 左利平， 張 欣， 楊振威， 韓 坤

(西安市中心醫院消化內科，西安 710003；*通訊作者，E-mail：hankun411@163.com)

ARHI對5-FU誘導胃癌細胞周期阻滯和凋亡的影響

唐海靈， 莊 坤， 左利平， 張 欣， 楊振威， 韓 坤*

(西安市中心醫院消化內科，西安 710003；*通訊作者，E-mail：hankun411@163.com)

目的 探討ARHI對5-FU誘導胃癌細胞周期阻滯和凋亡的影響。 方法 以穩定轉染pIRES2-EGFP或pIRES2-EGFP-ARHI重組質粒的BGC-823胃癌細胞系為模型，采用5-氟尿嘧啶(5-FU)刺激細胞24 h，通過流式細胞術檢測細胞周期和凋亡的改變，利用Western blot檢測cyclin D1、Bax、Bcl-2及活化caspase-3蛋白的表達水平。 結果 ARHI與5-FU都能夠導致BGC-823細胞發生G1期阻滯，G1期比例分別增加至61.64%±4.56%(P<0.05)和65.71%±4.89%(P<0.01)，二者聯合作用效果更明顯，G1期比例增加至81.14%±5.63%(P<0.01)；ARHI與5-FU引起的G1期阻滯與cyclin D1的表達水平降低相關；ARHI對BGC-823細胞凋亡沒有影響，5-FU可導致細胞凋亡，凋亡率為7.22%±1.55%(P<0.01)，而二者聯合作用導致更顯著的細胞凋亡，凋亡率達到17.34%±2.81%(P<0.01)；5-FU單獨或與ARHI聯合促使Bax/Bcl-2比值增高、caspase-3的活化增強。 結論 ARHI能夠增強5-FU誘導的胃癌細胞周期阻滯和凋亡。

胃癌； 抑癌基因； ARHI； 5-氟尿嘧啶； 細胞周期； 細胞凋亡

近幾十年來胃癌發病率不斷下降，但胃癌仍然是世界范圍內最常見的惡性腫瘤之一，居于癌性死因的第3位。胃癌患者男女比例為2∶1，中國、日本、韓國等東北亞國家是胃癌高發國家，其男性發病率可達69/10萬，而歐美等國家的胃癌發病率較低。雖然胃癌的臨床治療方法不斷改進，但多數胃癌患者確診時已是晚期，因此，其5年生存率不足30%[1]。

人ARHI(aplysia ras homolog Ⅰ)基因定位于染色體1p31，編碼一種小GTP結合蛋白，屬于Ras超家族成員。雖然與原癌基因Ras具有54%-59%的同源性，但ARHI卻屬于腫瘤抑制基因，是Ras超家族中發現的第一個抑癌基因。ARHI在多種腫瘤組織和細胞中低表達，而過表達ARHI對多種腫瘤細胞具有抑制效應[2]。本課題組前期發現ARHI在胃癌組織及細胞系中表達降低，而過表達ARHI能夠抑制胃癌細胞的增殖、遷移和侵襲[3]。5-氟尿嘧啶(5-Fluorouracil，5-FU)是胃癌化療的基本藥物，與其他化療藥物類似，在臨床應用過程中同樣面臨著耐藥性問題。本研究擬檢測過表達ARHI對胃癌細胞5-FU化療敏感性的影響，并揭示其相關的分子機制。

1 材料和方法

1.1 主要儀器

CO2細胞培養箱(SANYO，日本)；小型臺式高速冷凍離心機(Eppendorf，德國)；Infinite 200 Pro多功能酶標儀(Tecan，瑞士)；蛋白電泳儀(Bio-Rad，美國)；FACSCalibur流式細胞儀(Beckman Coulter，美國)；FluorChem FC2凝膠成像分析系統(Alpha Innotech，美國)。

1.2 主要試劑

DMEM培養基(Gibco，美國)；胎牛血清(Gibco，美國)；細胞培養用青霉素-鏈霉素、胰酶細胞消化液、Annexin Ⅴ-FITC細胞凋亡檢測試劑盒、細胞周期與細胞凋亡檢測試劑盒、RIPA裂解液(上海碧云天生物技術有限公司)；抗cyclin D1、Bax、Bcl-2、活化caspase-3、β-actin抗體(Cell Signaling Technology，美國)；BCA蛋白定量試劑盒、ECL化學發光試劑盒(Pierce，美國)。

1.3 細胞培養

穩定轉染pIRES2-EGFP或pIRES2-EGFP-ARHI重組質粒載體的BGC-823胃癌細胞系由本室保存。細胞接種于25 cm2培養瓶中，加入約5 ml DMEM培養基(含10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素)，于37 ℃、5% CO2的細胞培養箱中培養，每2-3 d胰酶消化傳代1次。

1.4 穩定細胞系的建立

本課題組前期已經建立了穩定表達pIRES2-EGFP或pIRES2-EGFP-ARHI重組質粒載體的BGC-823胃癌細胞系[3]。簡要過程為：將pIRES2-EGFP對照載體及構建好的pIRES2-EGFP-ARHI重組質粒載體轉染BGC-823細胞，采用遺傳霉素(G418，400 μg/ml)篩選4周，通過Western blot鑒定ARHI的表達，獲得穩定轉染細胞系。

1.5 流式細胞術檢測細胞周期和凋亡

檢測細胞凋亡按試劑盒說明書進行，簡要過程為：采用10 μmol/L的5-FU刺激BGC-823細胞24 h，然后收集細胞，取1×105個細胞，依次加入Annexin Ⅴ-FITC結合液、Annexin Ⅴ-FITC、碘化丙啶(PI)染色液，室溫避光孵育20 min，然后通過流式細胞儀檢測細胞凋亡。檢測細胞周期的簡要過程為：將收集的細胞中加入預冷的70%乙醇固定過夜，加入PI染色液，37 ℃避光孵育30 min，然后通過流式細胞儀檢測細胞周期。

1.6 Western blot檢測蛋白表達

采用10 μmol/L的5-FU刺激BGC-823細胞24 h，然后收集細胞，加入適量RIPA裂解液裂解細胞提取蛋白，采用BCA法進行蛋白定量后，加入樣品緩沖液煮沸5 min。取50 μg蛋白樣品進行SDS-PAGE、轉膜，然后用5%脫脂奶粉封閉NC膜，依次加入一抗、二抗，最后采用ECL化學發光試劑盒顯色并成像。

1.7 統計學分析

2 結果

2.1 ARHI對5-FU誘導的細胞周期的影響

以穩定轉染了pIRES2-EGFP、pIRES2-EGFP-ARHI質粒載體的BGC-823細胞系為模型，5-FU處理細胞后，通過流式細胞術檢測細胞周期的變化。結果表明：pIRES2-EGFP組細胞G1期比例為55.10%±4.37%；pIRES2-EGFP-ARHI組細胞發生G1期阻滯，G1期比例增加為61.64%±4.56%(P<0.05)；5-FU刺激后同樣引起細胞發生G1期阻滯，G1期比例增加為65.71%±4.89%(P<0.01)；而ARHI與5-FU聯合作用導致更為顯著的G1期阻滯，G1期比例增加為81.14%±5.63%(P<0.01)。隨著G1期比例增高，相應的G2期和S期的比例下降(見圖1)。

2.2 ARHI與5-FU對cyclin D1蛋白表達的影響

為檢測ARHI和5-FU引起BGC-823細胞周期阻滯的分子機制，5-FU處理BGC-823細胞后，通過Western blot檢測細胞周期蛋白cyclin D1的表達，結果表明：ARHI與5-FU都對cyclin D1的表達具有一定的抑制作用，5-FU的抑制效果較ARHI明顯，而二者聯合作用進一步顯著抑制了cyclin D1的表達(見圖2)。

與pIRES2-EGFP組比較，*P<0.05，**P<0.01圖1 ARHI與5-FU對細胞周期的影響Figure 1 Effects of ARHI and 5-FU on cell cycle

圖2 ARHI與5-FU對cyclin D1表達的影響Figure 2 Effects of ARHI and 5-FU on cyclin D1 expression

2.3 ARHI對5-FU誘導的細胞凋亡的影響

以穩定轉染pIRES2-EGFP和pIRES2-EGFP-ARHI的BGC-823細胞系為模型，5-FU刺激細胞后，通過流式細胞術檢測細胞凋亡的變化。結果表明：pIRES2-EGFP組細胞凋亡率為0.61%±0.07%；pIRES2-EGFP-ARHI組細胞凋亡率為0.67%±0.09%，與pIRES2-EGFP組相比未發生明顯變化；而5-FU刺激后導致細胞發生明顯的凋亡，凋亡率為7.22%±1.55%(P<0.01)；ARHI與5-FU聯合導致更為顯著的細胞凋亡，凋亡率達到17.34%±2.81%(P<0.01，見圖3)。

2.4 ARHI與5-FU對Bax/Bcl-2比值及caspase-3活化的影響

為檢測ARHI和5-FU引起BGC-823細胞凋亡的分子機制，采用Western blot檢測Bax、Bcl-2及caspase-3剪切體的表達變化，結果表明：ARHI對Bax、Bcl-2及活化caspase-3的表達沒有影響；5-FU促進Bax表達而抑制Bcl-2表達，即導致Bax/Bcl-2比值升高，同時增加了caspase-3剪切體的表達；ARHI與5-FU聯合作用進一步顯著提高了Bax/Bcl-2比值及caspase-3剪切體的表達(見圖4)。

與pIRES2-EGFP組比較，**P<0.01 圖3 ARHI與5-FU對細胞凋亡的影響 Figure 3 Effects of ARHI and 5-FU on cell apoptosis

圖4 ARHI與5-FU對Bax、Bcl-2及活化caspase-3表達的影響Figure 4 Effects of ARHI and 5-FU on expression of Bax, Bcl-2, and activated caspase-3

3 討論

Yu等[4]于1999年最早發現了ARHI基因，該基因為母系印記基因，其在正常卵巢和乳腺細胞中高表達，在卵巢癌和乳腺癌細胞中缺失或低表達。隨后的研究發現ARHI在胰腺癌、肝癌、甲狀腺癌、骨肉瘤、膠質瘤、肺癌等其他腫瘤中也表現出低表達或缺失[2,5]。ARHI低表達或缺失的原因包括雜合性丟失、DNA甲基化修飾、組蛋白去乙?；揎?、轉錄調控等[2]。重新表達ARHI能夠通過多種機制抑制腫瘤細胞的惡性表型[6]。

本課題組前期發現ARHI在胃癌組織及細胞系中表達明顯下調或缺失，而在正常胃組織中普遍表達，且ARHI表達與患者腫瘤的分化程度及TNM分期有關。同時發現過表達ARHI能夠抑制胃癌細胞的增殖、遷移和侵襲[3,7]。5-FU是消化系統腫瘤最常用的化療藥物，但在臨床應用過程中同樣面臨耐藥性問題，因而提高腫瘤細胞對5-FU的敏感性具有重要價值。近期研究表明,ARHI能夠顯著提高卵巢癌細胞對順鉑(cisplatin)的化療敏感性[8]。本研究發現過表達ARHI可導致BGC-823胃癌細胞發生G1期阻滯，同時增強了5-FU誘導的細胞周期阻滯。雖然ARHI對凋亡沒有影響，但明顯增強了5-FU誘導的凋亡。

cyclin D1在細胞周期由G1期進入S期過程中發揮關鍵作用[4]。Bax、Bcl-2是細胞凋亡線粒體通路中的關鍵分子，Bax促進凋亡而Bcl-2抑制凋亡，二者比值變化可以反映細胞凋亡趨勢變化。caspase-3是細胞凋亡執行的關鍵分子，未活化的前體分子量為32/35 kD，活化后剪切為17/19 kD[6,8]。Yu等[4]研究發現過表達ARHI能夠降低cyclin D1的表達，從而抑制卵巢癌和乳腺癌細胞的增殖。Washington等[8]發現ARHI可通過抑制Bcl-2的表達而促進卵巢癌細胞凋亡。本研究同樣發現ARHI導致G1期阻滯的同時可抑制cyclin D1的表達。雖然單獨表達ARHI并不抑制Bcl-2的表達，但可增強5-FU對Bcl-2表達的抑制效應，并增強Bax表達，最終提高Bax/Bcl-2比值、活化caspase-3而導致細胞凋亡?？傊?，本研究結果表明ARHI可提高胃癌細胞對5-FU的化療敏感性，有待于更深入研究其機制及體內實驗。

[1] Satolli MA,Buffoni L,Spadi R,etal.Gastric cancer:The times they are a-changin’[J].World J Gastrointest Oncol,2015,7(11):303-316.

[2] 唐海靈，陳建民.抑癌基因ARHI研究進展[J].中國腫瘤臨床，2011，38(20):1291-1294.

[3] Tang HL,Hu YQ,Qin XP,etal.Aplasia ras homolog member Ⅰ is downregulated in gastric cancer and silencing its expression promotes cell growth in vitro[J].J Gastroenterol Hepatol,2012,27(8):1395-1404.

[4] Yu Y,Xu F,Peng H,etal.NOEY2(ARHI),an imprinted putative tumor suppressor gene in ovarian and breast carcinomas[J].Proc Natl Acad Sci U S A,1999,96(1):214-219.

[5] Ye K,Wang S,Wang J,etal.Zebularine enhances apoptosis of human osteosarcoma cells by suppressing methylation of ARHI[J].Cancer Sci,2016:Epub ahead of print.

[6] Yu J,Kong CZ,Zhang Z,etal.Aplasia Ras homolog member I expression induces apoptosis in renal cancer cells via the β-catenin signaling pathway[J].Mol Med Rep,2015,11(1):475-481.

[7] 唐海靈，胡益群，楊奕軒，等.抑癌基因ARHI在人胃癌組織中的表達及意義[J].世界華人消化雜志，2011，19(1):25-30.

[8] Washington MN,Suh G,Orozco AF,etal.ARHI (DIRAS3)-mediated autophagy-associated cell death enhances chemosensitivity to cisplatin in ovarian cancer cell lines and xenografts[J].Cell Death Dis,2015,6:e1836.

Effects of ARHI on 5-FU-induced gastric cancer cell cycle arrest and apoptosis

TANG Hailing, ZHUANG Kun, ZUO Liping, ZHANG Xin, YANG Zhenwei, HAN Kun*

(DepartmentofGastroenterology,Xi’anCentralHospital,Xi’an710003,China;*Correspondingauthor,E-mail:hankun411@163.com)

ObjectiveTo elucidate the effects of ARHI on 5-FU-induced gastric cancer cell cycle arrest and apoptosis.MethodsBGC-823 gastric cancer cells were stably transfected with recombinant plasmid vector pIRES2-EGFP or pIRES2-EGFP-ARHI for the experiments. After 5-fluorouracil(5-FU) stimulation, flow cytometry was used to detect the changes of cell cycle and apoptosis. Western blot was used to detect the protein expression levels of cyclin D1,Bax,Bcl-2 and activated caspase-3.ResultsBoth ARHI and 5-FU induced G1phase arrest in BGC-823 cells,and the percentage of G1cells increased to 61.64%±4.56%(P<0.05) and 65.71%±4.89%(P<0.01), respectively. The combined effect of ARHI and 5-FU was more significant, and the percentage of G1cells increased to 81.14%±5.63%(P<0.01). ARHI and 5-FU-induced G1phase arrest was accompanied by down-regulated protein expression of cyclin D1. ARHI had no effect on BGC-823 cell apoptosis,and 5-FU was able to induce significant apoptosis with an apoptotic rate of 7.22%±1.55%(P<0.01). The combined effect of ARHI and 5-FU was more significant, and the apoptotic rate increased to 17.34%±2.81%(P<0.01). 5-FU alone or ARHI and 5-FU-induced BGC-823 cell apoptosis were accompanied by increased Bax/Bcl-2 ratio and activated caspase-3 expression.ConclusionARHI can enhance 5-FU-induced cell cycle arrest and apoptosis in gastric cancer cells.

gastric cancer; tumor suppressor gene; ARHI; 5-Fluorouracil; cell cycle; cell apoptosis

國家自然科學基金資助項目(81502084)

唐海靈，男，1980-07生，碩士，主治醫師，E-mail：xasthl@163.com

2016-11-30

R735.2

A

1007-6611(2017)01-0026-04

10.13753/j.issn.1007-6611.2017.01.006