Ⅰ、Ⅲ型膠原在絕經后盆腔器官脫垂患者陰道前壁組織中的表達

李明娥, 陳遞林*, 鐘 盈, 宋振坤, 王曉蘭

(1暨南大學第二臨床醫學院深圳市人民醫院婦科，深圳 518020；2深圳市第三人民醫院婦產科；*通訊作者，E-mail:dilin_c@163.com)

Ⅰ、Ⅲ型膠原在絕經后盆腔器官脫垂患者陰道前壁組織中的表達

李明娥1, 陳遞林1*, 鐘 盈2, 宋振坤1, 王曉蘭1

(1暨南大學第二臨床醫學院深圳市人民醫院婦科，深圳 518020；2深圳市第三人民醫院婦產科；*通訊作者，E-mail:dilin_c@163.com)

目的 通過研究Ⅰ、Ⅲ型膠原在絕經后盆腔器官脫垂(POP)患者陰道前壁中的表達，以探討二者在POP發生發展中的作用。 方法 因POP行盆底重建術的絕經后患者37例作為研究組；以同期因宮頸病變行全子宮切除術患者21例作為對照組。采用免疫組化染色法測定Ⅰ、Ⅲ型膠原的表達水平。 結果 ①Ⅰ型膠原在研究組和對照組婦女陰道前壁組織中的表達差異無統計學意義(P>0.05)。②Ⅲ型膠原在研究組陰道前壁組織中的表達低于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。 結論 在絕經后POP婦女陰道前壁組織中，Ⅰ型膠原的含量無明顯改變，而Ⅲ型膠原的含量降低，提示Ⅲ型膠原含量減少可能參與POP的發生發展。

盆腔器官脫垂； 絕經后； 陰道前壁組織； Ⅰ型膠原； Ⅲ型膠原

盆腔器官脫垂(pelvic organ prolapse,POP)，是一種影響中老年女性生活質量的常見疾病[1]。盆底支持結構主要由盆底的韌帶、筋膜和肛提肌構成。韌帶的主要成分是平滑肌和結締組織。而盆底結締組織的功能主要決定于其中膠原蛋白的數量、亞型比例及性質[2]。盆底結締組織中存在著Ⅰ型和Ⅲ型膠原。膠原是目前國內外研究關于POP婦女盆底支持組織中的熱點。本課題通過免疫組織化學方法對絕經后POP婦女陰道前壁組織中Ⅰ型、Ⅲ型膠原的表達進行研究，了解POP發生發展中膠原含量的改變，以探討POP發生發展中的相關因素。

1 資料和方法

1.1 研究對象

收集2010-12～2012-12在深圳市人民醫院婦科收治的盆腔器官脫垂(POP)需手術治療的絕經后患者37例作為研究組，術前均經婦科檢查及經陰道三維彩超評估，并經尿動力學檢查排除壓力性尿失禁。手術方式選擇盆底重建術。選擇同期因宮頸病變需行全子宮切除手術治療、且無盆腔器官脫垂和壓力性尿失禁的絕經后患者21例作為對照組，兩組患者均無子宮肌瘤、子宮內膜異位癥等雌激素相關疾病，均無類風濕性關節炎、甲狀腺功能疾病等影響膠原含量與代謝的疾病等，均無陰道前、后壁修補等手術史。兩組患者在年齡、 絕經時間、妊娠及分娩次數、體質量指數等方面差異均無統計學意義。1.2 取材部位

陰道前壁12點處取約0.5 cm×0.5 cm大小的組織1塊，立即放入10%的福爾馬林溶液中固定。

1.3 主要試劑

濃縮型兔抗人CollagenⅠ多克隆抗體和濃縮型兔抗人Collagen Ⅲ多克隆抗體均購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.4 免疫組化方法

陰道前壁組織在中性福爾馬林溶液中固定后脫水，二甲苯透明，浸蠟后包埋并制備3 μm切片。烘烤切片，脫蠟，水化，高壓加熱修復，洗修復液，畫線，染色(分別滴加1∶200兔抗人CollagenⅠ一抗，Collagen Ⅲ一抗)，PBS沖洗，DAB顯色，蘇木素復染，封片。顯微鏡下觀察結果，以已知皮膚膠原黃棕色染色設為陽性對照，以PBS設為空白對照。

1.5 結果判定

顯微鏡下膠原染色陽性區域為黃色至深棕黃色，由兩名高年資病理醫生閱片。按著色強度判定結果，顯色不明顯或無顯色為陰性(-)，顯色淡黃色為弱陽性(+)，顯色黃色為陽性(++)，顯色為深棕黃色為強陽性(+++)。

1.6 統計學處理

所有數據采用SPSS13.0統計軟件進行處理， 采用t檢驗及Wilcoxon秩和檢驗。以P<0.05作為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 膠原蛋白免疫組織化學染色情況

HE染色狀態下，可見非脫垂患者陰道前壁組織中膠原纖維排列成較規則的束狀或條索狀結構(見圖1)。POP患者陰道前壁組織免疫組織化學染色狀態下膠原纖維排列較稀疏凌亂成網狀，呈現不同的染色強度，強陽性表達為棕黃色(見圖2)，陽性表達為黃色(見圖3)。

圖1 HE染色狀態下非脫垂患者陰道前壁組織中的膠原結構 (HE,×200)Figure 1 The expression of collagen in normal anterior vaginal tissue without POP (HE,×200)

圖2 Ⅰ型膠原在POP患者陰道前壁中的強陽性表達 (IHC,×200) Figure 2 The strong positive expression of collagen Ⅰ in anterior vaginal tissue of POP patients(IHC,×200)

圖3 Ⅲ型膠原在POP患者陰道前壁組織中的陽性表達 (IHC,×200)Figure 3 The positive expression of Collagen Ⅲ in anterior vaginal tissue of POP patients (IHC,×200)

2.2 Ⅰ型膠原在POP患者陰道前壁組織中的表達

研究組37例POP患者陰道前壁組織中，陰性表達1例，弱陽性表達5例，陽性表達8例，強陽性表達23例，即37例POP患者陰道壁組織中Ⅰ型膠原總體陽性表達率為97.30%。而在21例對照組中，Ⅰ型膠原全部呈陽性表達，弱陽性表達者2例，陽性表達者5例，強陽性表達者14例，總體陽性表達率為100%。兩獨立樣本比較的Wilcoxon秩和檢驗表明兩組之間Ⅰ型膠原表達差異無統計學意義(Z=0.407，P=0.684，見表1)。

表1 Ⅰ型膠原在絕經后研究組與對照組陰道前壁組織中的表達 (例)

Table 1 Expression of collagen Ⅰin anterior vaginal tissue of POP patients and normal controls (cases)

組別 n-++++++陽性率(%)研究組371582397．3對照組2102514100．0

2.3 Ⅲ型膠原在POP患者陰道前壁組織中的表達

在研究組37例POP患者陰道前壁組織中，陰性表達者20例，弱陽性表達者15例，陽性表達者2例，無強陽性表達者，37例研究組患者陰道壁組織中Ⅲ型膠原總體陽性表達率45.9%。而在對照組中，Ⅲ型膠原陰性表達者6例，弱陽性表達者12例，陽性表達者2例，強陽性表達者1例，總體陽性表達率為71.4%。研究組Ⅲ型膠原的陽性表達低于對照組，通過兩獨立樣本比較的Wilcoxon秩和檢驗，Z=1.988，P=0.047，兩者差異有統計學意義(P<0.05，見表2)。

表2 Ⅲ型膠原在絕經后研究組與對照組陰道前壁組織中的表達

Table 2 Expression of collagen Ⅲ of anterior vaginal tissue in postmenopausal patients with POP and controls

組別n-++++++陽性率(%)研究組3720152045．9對照組216122171．4

3 討論

隨著人類預期壽命的增長及人們對生活質量要求的提高，盆腔器官脫垂(POP)日漸成為老年女性關注的疾病。近些年來隨著手術器械及聚丙烯補片材料的不斷改善，POP患者的手術方式也有了更好的選擇。雖然已明確POP發生與妊娠、分娩、盆底支持破壞等因素相關，但其確切發病機制仍不明確，進一步研究其發病因素及機制一直是婦科領域近年研究熱點。

盆底支持組織主要為相關的盆底肌、韌帶及筋膜等，其主要由平滑肌細胞、成纖維細胞及膠原構成，其支持和穩定功能主要取決于細胞外基質中不同類型纖維間的相互作用，主要包括膠原蛋白、蛋白聚糖、彈性蛋白、層黏連蛋白和纖連蛋白，其中膠原是結締組織的主要蛋白質成分。目前已發現數十種膠原，由不同基因編碼而成。不同的膠原蛋白有不同的化學結構及免疫學特性，其中Ⅰ型、Ⅱ型及Ⅲ型膠原在組織中含量最豐富，Ⅰ型膠原直徑較粗，有很高的抗張強度，起支持作用，Ⅲ型膠原直徑較細，與彈性有關[3-5]。

有文獻報道，POP患者盆底結締組織中膠原含量的下降使盆底筋膜、韌帶等支持結構松弛，導致了POP的發生[6]。但對膠原亞型的具體作用及機制看法不一，Ewies等[7]研究結果認為Ⅰ型膠原的含量與POP無關，而與Ⅲ型膠原含量增加有直接關系。另外，其還認為Ⅲ型膠原的上升與年齡及絕經狀態無直接關系，而與POP有關，即發生POP時Ⅲ型膠原含量增加，并且認為激素替代治療可逆轉部分POP的嚴重程度。Gabriel等[8]研究有類似的結果，其對絕經后POP婦女的子宮骶韌帶免疫組織化學染色定量分析其平滑肌及Ⅰ、Ⅲ型膠原含量變化的研究發現，平滑肌及Ⅰ型膠原的含量較正常對照組表達無差異，但Ⅲ型膠原的含量明顯上升，由此認為Ⅲ型膠原含量的上升與POP有關。然而Lin等[4]研究結果表明，陰道前壁脫垂婦女Ⅲ型膠原較正常對照組顯著降低，且Ⅰ型和Ⅲ型膠原的含量與年齡呈正相關。之后Knuuti等[5]通過對絕經后婦女Ⅰ型和Ⅲ型原膠原的羧基端肽鏈、交聯片段以及氨基酸的檢測發現，絕經后POP婦女Ⅲ型原膠原的濃度顯著增加。因此有關Ⅰ型和Ⅲ型膠原在POP患者中的表達及其作用目前仍存在爭議，究其原因可能與實驗對象、取材部位和研究方法等的不同相關。

本研究以絕經后POP患者為研究對象，采用免疫組織化學方法測定其陰道前壁組織中膠原Ⅰ、Ⅲ的陽性表達情況，研究結果顯示:研究組中Ⅰ型膠原陽性表達率為97.3%，對照組中的陽性表達率為100%，兩組間差異無統計學意義，與Ewies等[7]及Gabriel等[8]研究結果一致，提示Ⅰ型膠原的含量可能與POP無直接關系。本研究中Ⅲ型膠原在研究組中的陽性表達率為45.95%，在對照組中的陽性表達率為71.43%，研究組中Ⅲ型膠原的表達低于對照組，差異有統計學意義，這與Lin等[4]研究結果一致。提示Ⅲ型膠原含量的下降可能參與了絕經后POP發生發展過程。

近年來隨著人口老齡化趨勢及生活質量提高， POP的發生發展日益被重視。 雖確切發病機制目前尚無定論，但膠原蛋白形態結構變化及代謝表達異常無疑在POP患者疾病發生發展中發揮了重要作用，仍然需要大樣本前瞻性的進一步研究。

[1] Krlin RM,Soules KA,Winters JC.Surgical repair of pelvic organ prolapse in elder patients[J].Curr Opin Urol,2016,26(2):193-200.

[2] Bildircin D,Kokcu A,Celik H,etal.Comparison of connective tissue components in the uterine ligaments between women with and without pelvic organ prolapse[J].Minerva Ginecol,2014,66(2):201-208.

[3] Barbiero EC,Sartori MG,Girao MJ,etal.Analysis of type I collagen in the parametrium of women with and without uterine prolapse,according to hormonal status[J].Int Urogynecol J Pelvic Floor Dysfunct,2003,14(5)：331-334.

[4] Sun ZJ,Lang JH,Zhu L,etal.Etiological study on stress urinary incontinence and its relationship with collagen status[J].Chin J Obstet Gynecol January,2004，5(l):6-9.

[5] Moalli PA,Talarico LC,Sung VW,etal.Impact of menopause on collagen subtypes in the arcus tendineous fasciae pelvis[J].Am J Obstet Gynecol,2004,190:620-627.

[6] Weber AM,Buchsbsum GM,Chen B,etal.Basic science and translational research in female pelvic floor disorders:proceedings of an NIH-sponsored meeting[J].Neurourol Urodyn,2004,23(4):288-301.[7] Ewies AA,AI-Azzawi F,Thompson J.Changes in extracellular matrix Proteins in the cardinal ligaments of post-menopausal women with or without prolapse:a computerized immunohistomorphometric analysis[J].Hum Reprod,2003,18(10):2189-2195.

[8] Gabriel B,Denschiag D,Gobel H,etal.Uterosacral ligament in postmenopausal women with or without pelvic organ prolapse[J].Int Urogynecol J Pelvic Floor Dysfunct,2005,16(6):475-479.

Expression of collagenⅠand Ⅲ of anterior vaginal tissue in postmenopausal women with pelvic organ prolapse

LI Ming’e1,CHEN Dilin1*, ZHONG Ying2, SONG Zhenkun1, WANG Xiaolan1

(1DeparmentofGynaecology,ShenzhenPeople’sHospital，SecondClinicalMedicalCollegeofJinanUniversity,Shenzhen518020,China;2DeparmentofGynaecology，ThirdPeople’sHospital;*Correspondingauthor,E-mail:dilin_c@163.com)

ObjectiveTo investigate the expression of collagenⅠ and collagen Ⅲ in anterior vaginal tissue of postmenopausal women with pelvic organ prolapse(POP) and to explore its role in the development and progression of POP.MethodsA total of 37 postmenopausal POP patients were enrolled as research group, and 21 postmenopausal patients without POP were chosen as control group. Immunohistochemistory was used to examine the expression of collagenⅠ and collagen Ⅲ.Results①There was no obvious difference in expression of collagen Ⅰ in anterior vaginal tissue between two groups(P>0.05).②The expression of collagen Ⅲ in anterior vaginal tissue in POP group was significantly lower than in control group(P<0.05).ConclusionIn anterior vaginal tissue of postmenopausal women with pelvic organ prolapse, the expression of collagenⅠ dose not significantly change while the expression of collagen Ⅲ is decreased. The low expression of collagen Ⅲ may play a role in the development of pelvic organ prolapse.

pelvic organ prolapse(POP); postmenopausal; anterior vaginal tissue; collagenⅠ; collagen Ⅲ

深圳市科技計劃重點基金資助項目(201201012)

李明娥，女，1966-12生，博士，主任醫師,E-mali:mingeli007@126.com

2016-10-10

R711.2

A

1007-6611(2017)01-0059-04

10.13753/j.issn.1007-6611.2017.01.013