臭豆腐鹵水微生物群落及其接種發酵

趙國忠，謝小芳，邸海波，陳衛*

(1.江南大學食品學院，江蘇無錫214122；2.天津市靜海區衛生監督所，天津301600）

臭豆腐鹵水微生物群落及其接種發酵

趙國忠1，謝小芳1，邸海波2，陳衛1*

(1.江南大學食品學院，江蘇無錫214122；2.天津市靜海區衛生監督所，天津301600）

對樣品臭豆腐鹵水中微生物分離，應用傳統微生物鑒定、細菌16S rRNA鑒定，探索不同微生物種屬組成結構對臭豆腐品質作用以及風味的影響。分離鑒定了臭豆腐鹵水中的主要細菌為漫游球菌（Vagococcuscarniphilus）、嗜冷桿菌屬（Psychrobactersp.）、沙克乳桿菌（Lactobacillus sakei）、地衣芽孢桿菌（Enterococcus avium）、鳥腸球菌（Enterococcus devriesei），并在無菌條件下采用純菌種以及混合菌種直接進行豆腐發酵。單一菌種發酵比混合菌種發酵的臭鹵所制得的臭豆腐總體感官評價結果偏低。除空白發酵結果以外，菌株St2（嗜冷桿菌）發酵的臭豆腐樣品總體評價最差。菌株St5（鳥腸球菌）發酵所得的臭豆腐樣品色澤較好，香氣成分也較濃郁。

臭豆腐；微生物分離鑒定；發酵

臭豆腐被西方人稱為“東方奶酪”，是我國傳統發酵豆制品，聞起來臭，吃起來香是臭豆腐的顯著特點。臭豆腐是以大豆為原料加工成型的豆腐坯塊后經臭鹵浸漬制成的非即食性產品。其中制備臭豆腐的臭鹵是用一些蔬菜、香辛料等植物為原料，經過加工、配制、發酵而成的汁液，具有特異的植物發酵液風味。臭豆腐的質量受豆腐坯的鮮嫩程度、鹵汁的配方比例以及溫度高低、時間長短的直接影響。臭豆腐生產的類型是根據環境條件、生活習性不同而定的。微生物在臭豆腐特殊風味以及高營養價值的形成過程中起到至關重要的作用[1]。臭豆腐鹵水中的蛋白質可以被微生物分解為多肽及氨基酸，且釋放出大量的氨及其它化合物，從而形成了臭豆腐的特殊風味[2]。

近年來，有關從臭豆腐鹵水中分離出各種微生物的研究報道很多，但對于臭豆腐中微生物結構組成以及各種微生物在發酵過程中作用的研究較少。因此，通過研究臭豆腐中的微生物組成，研究其與品質的關系。為制備有風味貢獻價值的多菌種發酵劑及臭豆腐的工業化生產提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

臭豆腐鹵水：安徽農家自制。

實驗所用試劑均為市售分析純。

MRS培養基：蛋白胨10g/L，牛肉膏10g/L，酵母膏5g/L，檸檬酸氫二銨2 g/L，葡萄糖20 g/L，乙酸鈉5 g/L，磷酸氫二鉀2 g/L，硫酸鎂0.58 g/L，硫酸錳0.25 g/L，瓊脂18 g/L，pH 6.2～6.6。

LB培養基：胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，氯化鈉10 g/L，瓊脂18 g/L，pH 7.2。

平板計數瓊脂（plate count agar，PCA）培養基：胰蛋白胨5g/L，酵母浸粉2.5g/L，葡萄糖1g/L，瓊脂15g/L，pH 7.0。1.2儀器與設備

SW-CJ-2FD型超凈工作臺：蘇州尚田潔凈技術有限公司；MLS-3750型滅菌鍋、-80℃超低溫冰箱：日本三洋公司；GRP-9080型隔水式恒溫培養箱：上海森信實驗儀器有限公司；DYCP-31BN瓊脂糖電泳槽：北京六一生物科技有限公司；Gel Doc XR+型凝膠成像儀、T100型PCR儀：美國BioRad公司；Allegra 6R冷凍離心機：德國貝克曼公司；101A-7B電熱鼓風干燥箱：常州杰博森儀器有限公司；QP2010氣質聯用儀：日本島津公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 菌落計數

采用平板涂布法，并用生理鹽水對樣品進行十倍梯度連續稀釋，選取10-1～10-4四個稀釋度，分別吸取200 μL樣品稀釋液均勻涂布于LB固體平板培養基上，于37℃好氧培養48 h后，根據生長情況選擇合適的稀釋梯度進行計數并記錄。

1.3.2 菌株形態觀察及菌株16S rRNA基因測序

顯微鏡觀察：將培養基上形態不同的單菌落分別編號，觀察平板上不同菌株的菌落形態特征并做及時記錄與拍照。同時，選取特征菌株轉至新的固體平板培養基上，作革蘭氏染色后顯微鏡（油鏡）下觀察，并及時記錄與拍照。根據革蘭氏染色結果，選取不同形態特征的菌株活化后進行聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增。其中上游引物27F序列：5′-AGAGTTTGATCCTGGCCTCA-3′，下游引物1492R序列：5′-GGTTACCTTG TTACGACTT-3′，擴增片段為1 500 bp。PCR體系50 μL：10×buffer5μL；脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP）5 μL；上游引物（25 μmol/L）0.5 μL；下游引物（25 μmol/L）0.5 μL；TaqDNA聚合酶0.5 μL；模板DNA 1.5 μL；ddH2O 37 μL。PCR擴增條件為：95℃預變性3 min；95℃變性10 s；55℃退火30 s；72℃延伸1 min；72℃延伸5 min，2～4步進行30個循環。產物送測序[3]。

1.3.3 接種發酵

以自然發酵編號0為對照，將平板形態特征不同的5株菌編號1～5，混合菌株編號6，加入豆腐中培養發酵（37℃好氧），對每種菌株的生長進行菌落計數，觀察記錄菌落計數結果[4]。

1.3.4 感官評價

經過基本篩選、培訓和考核選取16名嗅覺靈敏的品嘗員組成感官分析品評小組。臭豆腐的感官鑒定主要從色澤、形態、香氣等幾個品質指標進行分析。感官評定評分標準見表1[5]。

表1 臭豆腐感官評定標準Table 1 Sensory evaluation standard of stinky tofu

2 結果與分析

2.1 臭豆腐鹵液中主要微生物的分離

分別對臭豆腐鹵汁中的細菌和真菌菌落總數進行了測定[6]。臭豆腐樣品在LB培養基上的菌落形態結果如表2所示。臭豆腐鹵水微生物在培養基上表型不一樣，證明鹵水中所含的微生物多種多樣。

表2 臭豆腐LB培養基上的菌落形態Table 2 Colonial morphology of stinky tofu in LB plates

2.2 革蘭氏染色

挑選形態不同的過氧化氫酶反應呈陽性的5株菌株，（菌株St1、St2、St3、St4、St5）經革蘭氏染色后，在油鏡下觀察細菌的細胞形態，結果見圖1。

圖1 菌株個體形態油鏡觀察結果（×1000）Fig.1 Cellular morphology observed by oil microscope(×1000)

由圖1可知，從LB培養基中分離到5株形態不同的菌株。菌株St1為革蘭氏陽性，紫色球菌；菌株St2為革蘭氏陰性，是芽孢桿菌；菌株St3為革蘭氏陽性，紫色的小球菌；菌株St4為革蘭氏陰性，也是芽孢桿菌；菌株St5為革蘭氏陽性的紫色球菌。

通過初步的菌株鑒定，根據細胞形態特征和革蘭氏染色結果可以分離純化得到這五種微生物，但具體菌株的種屬仍不清楚，所以需要進行進一步實驗來鑒定菌株種屬。

2.3 細菌16S rRNA基因測序鑒定

細菌PCR擴增結果如圖2所示，細菌16S rRNA鑒定結果見表3。

圖2 細菌16S rRNA PCR瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.2 Agarose gel electrophoresis of 16S rRNA PCR products

表3 細菌16S rRNA鑒定結果Table 3 Identification results of bacteria by 16S rRNA

由圖2可知，5株菌都在1 500 bp左右處有亮條帶。由表3的進一步16S rRNA鑒定結果可知，菌株St1為漫游球菌屬（Vagococcus carniphilus）；菌株St2為嗜冷桿菌（Psychroba-ctersp.）；菌株St3為沙克乳桿菌（Lactobacillus sakei）；菌株St4為地衣芽孢桿菌（Enterococcus avium）；菌株St5為鳥腸球菌（Enterococcus devriesei）；這些結果都與前面革蘭氏染色初步鑒定的結果是一致的。

由圖3可知，臭豆腐鹵液中的菌株主要都是細菌。參考已報道的研究成果也能得知：郭華等[8]從臭豆腐的發酵鹵液中分離得到的2個主要菌株經鑒定后初步確定是環狀芽孢桿菌屬以及奈瑟氏菌屬。盧義伯等[9]采用定性、定量培養的方法，從臭豆腐的鹵液中分離篩選得到的優勢菌株則是熒光假單孢菌。而本實驗分離得到的嗜冷桿菌，也在黑龍江克東腐乳、山東水豆豉中發現過同屬菌株。

在臭豆腐鹵液中真菌數量遠小于細菌。真菌在臭豆腐發酵過程中起的作用則需進一步的研究。在臭豆腐形成的體系中，真菌，如絲孢酵母、畢赤酵母，在臭鹵的制備以及發酵前期，它們和細菌是共生的作用，酵母主要起到分解的作用，然而后期浸鹵過程中會由于食鹽濃度的升高以及后面的氧氣減少，細菌逐漸占據優勢地位，而真菌慢慢停止生長。最后這些留在臭豆腐成品中的細菌對臭豆腐風味的形成起著重要的作用。推測臭豆腐中不同菌在不同組合下因為相互作用可能會有不同生長狀況。因此，通過在無菌的條件下采用純菌種以及混合菌株直接進行發酵，觀察主要菌株在豆腐中的生長情況。

2.4 臭豆腐接種發酵

漫游球菌、嗜冷桿菌、沙克乳桿菌、地衣芽孢桿菌、鳥腸球菌5種單獨菌株發酵的臭豆腐樣品中，鳥腸球菌發酵的臭鹵液中的菌落數最多，從某種程度上說，該菌株在好氧條件下于臭豆腐樣品中生長的最好。地衣芽孢桿菌的菌落數最少，這種菌株在好氧條件下于臭豆腐樣品中生長的最緩慢。相比于5種單獨菌株的發酵，混合菌株在發酵后菌落數上升最明顯，并且混合菌株在臭豆腐樣品中的生長最旺盛。由此可見，微生物在豆腐樣品中的生長是相互協同作用的結果，菌群協調才能使豆腐更好地發酵[10]。

混合菌株接種發酵前各菌屬的比例是1∶1∶1∶1∶1，但是發酵以后，鳥腸球菌是主要優勢菌株，漫游球菌數次之，而地衣芽孢桿菌的比例最低。由此可以推測，在臭豆腐樣品發酵過程中，鳥腸球菌可能抑制了其他菌的生長，逐漸成為優勢菌[11]。

2.5 感官評定結果

表4是對自然發酵、5種菌株單獨發酵以及混合菌株發酵制得實驗樣品進行感官評價的結果（每項都是多次評價后取平均值）。其中0為自然發酵，1～5為St1～St5菌株單獨發酵，6為混合菌株發酵（1∶1∶1∶1∶1）。

表4 臭豆腐樣品感官評價結果Table 4 Sensory evaluation results of stinky tofu samples

由表4可以看出，實驗樣品0的臭豆腐感官評價最差，而實驗樣品6的臭豆腐感官評價最高?？梢?，在自然發酵情況下的臭豆腐樣品的品質最差，而這些單一菌株相比于混合菌株制備發酵的臭鹵所制得的臭豆腐總體感官評價結果都不高。其中菌株St3（沙克乳桿菌）發酵出的臭豆腐樣品是總體評價中最好的，而菌株St2（嗜冷桿菌）發酵出的臭豆腐樣品是總體評價中最差的?？傮w來看，這5種菌株對臭豆腐形態的影響都非常小，基本并沒有太大的改變。在色澤方面，菌株St5（鳥腸球菌）發酵所制得的臭豆腐樣品的色澤比較好，它制得的臭豆腐樣品的香氣成分也是較濃郁[12]。這些感官方面的差異可能跟不同菌種作用所產生的酶的種類不同有關，而酶活力大小也是影響臭豆腐樣品品質的原因之一[13]。這說明單一菌株對臭豆腐樣品的結構、品質、香氣的影響主要表現在某個特定方面，對其最終風味形成的貢獻還是相對單薄的[14]。而多種菌株之間會存在相互協同作用，這才是真正改變臭豆腐產品結構質地，繼而改變臭豆腐的風味形成的主要原因[15]。

3 結論

本實驗以臭豆腐鹵水為研究對象，在特定條件下于不同的固體培養基上培養后，分離樣品臭豆腐中的主要可培養微生物。從該臭鹵樣品中分離篩選出5種具有產生臭豆腐特征風味物質能力的菌株，再對菌株進行鑒定分別為：漫游球菌屬（Vagococcus carniphilus）、嗜冷桿菌（Psychrobactersp.）、沙克乳桿菌（Lactobacillus sakei）、地衣芽孢桿菌（Enterococcus avium）以及鳥腸球菌（Enterococcus devriesei）。霉菌為近平滑念珠菌（Candida parapsilosis）、涎沫念珠菌（Candida zeylanoides）；酵母為絲孢酵母（Trichosporon montevideense）、畢赤酵母（Pichia membranifaciens）。臭豆腐鹵水中雖然也存在霉菌和酵母，但是比例較低。模擬臭豆腐的生產工序，用分離得到的單一菌株以及將它們混合后的菌株來制備發酵臭豆腐，對以此制得的實驗樣品進行分析，發現混合發酵比單一菌株發酵有更好的感官得分。

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Microbial species of stinky tofu brine and the inoculated fermentation

ZHAO Guozhong1,XIE Xiaofang1,DI Haibo2,CHEN Wei1*
(1.School of Food Science and Technology,Jiangnan University,Wuxi 214122,China; 2.Health Supervision Institute of Jinghai,Tianjin 301600,China)

Themicrobesofstinkytofubrinewasisolated,andidentifiedbytraditionalmicrobiologicalidentificationandbacterial16SrRNAidentification. Theeffectofdifferentrelationshipbetweenmicrobialdiversity,communitystructureofstinkytofubrineonstinkytofuqualityandflavorwasresearched. The results showed that the main bacteria in stinkytofu brine wereVagococcus carniphilus,Psychrobactersp.,Lactobacillus sakei,Enterococcus avium,Enterococcus devriesei.In aseptic condition,the stinky tofu was fermented using single strains and multi-strains.Results showed that the sensory evaluationofstinkytofufermented bysingle strain waslower than thatfermented bymulti-strains.In addition to blank fermentation,the sensoryscore of thestinkytofufermentedbyPsychrobactersp.St2wasthelowestintheseproducts,buttheproductfermentedbyEnterococcusdevrieseiSt5wasbetterin colorandflavor.

stinky tofu;isolation and identification of microorganism;fermentation

TS214.2

0254-5071（2017）02-0021-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.02.005

2016-10-11

國家自然科學基金青年科學基金(31401682)；江蘇省科技計劃項目青年基金(BK20140146)；江南大學2015年本科教改項目(JG2015096)

趙國忠(1983-)，男，副教授，博士，研究方向為食品微生物學。

*通訊作者：陳衛(1966-)，男，教授，博士，研究方向為食品微生物學。