基因表達載體相關問題解讀及應用

安徽 吳 浩

基因表達載體相關問題解讀及應用

安徽 吳 浩

基因工程操作的核心是構建基因表達載體，圍繞該表達載體的考題很突出，如2009年安徽卷T30、2014年天津卷T8、2015年江蘇卷T32。下面從不同角度對該表達載體進行解讀。

1.基因表達載體的一般結構及各部分功能

基因表達載體的一般結構包括復制原點+目的基因（插入基因）+啟動子+終止子+標記基因（抗生素抗性基因）等組成。

啟動子是一段有特殊結構的DNA片段，位于基因的首端。啟動子是復制原點附近的一段DNA，它和特定的物質（如激素）作用后，通過一系列復雜的正反饋機制，激活復制原點（復制原點通常被某些酶結合而不易解旋）。

終止子位于基因的尾端，也是一段有特殊結構的DNA短片段；終止子相當于一盞紅色信號燈，使轉錄在所需要的地方停止下來。

復制原點處的A和T特別多，相對氫鍵少，不穩定，DNA容易解旋，因此易與引物結合，成為轉錄的起點或復制的起點。

抗生素抗性基因作為其標記基因。標記基因的作用是為了鑒別受體細胞中是否含有目的基因，從而將含有目的基因的細胞篩選出來。標記基因又稱報告基因，抗生素抗性基因是其中的一種。

【例1】 （2009年安徽卷T31，節選）某種野生植物有紫花和白花兩種表現型，已知紫花形成的生物化學途徑是：

A和a、B和b是分別位于兩對染色體上的等位基因，A對a、B對b為顯性?；蛐筒煌膬砂谆ㄖ仓觌s交，F1紫花∶白花=1∶1。若將F1紫花植株自交，所得F2植株中紫花∶白花=9∶7。

請回答：（5）紫花中的紫色物質是一種天然的優質色素，但由于B基因表達的酶較少，紫色物質含量較低。設想通過基因工程技術，采用重組的Ti質粒轉移一段DNA進入細胞并且整合到染色體上，以促進B基因在花瓣細胞中的表達，提高紫色物質含量。下圖是一個已插入外源DNA片段的重組Ti質粒載體結構模式圖，請填出標號所示結構的名稱：

①__________②__________③__________

【解析】（5）依題意，標號所示結構的名稱：①是T-DNA，②是標記基因，③是復制原點

【答案】（5）①T-DNA ②標記基因 ③復制原點

2.基因表達載體中啟動子、終止子的來源及特點

（1）如果目的基因是從自然界中已有的物種中分離出來的，在構建基因表達載體時，不需要在質粒上目的基因的前后端接上特定的啟動子、終止子，因為目的基因中已含有啟動子、終止子。

（2）如果目的基因是通過人工方法合成的，或通過cDNA文庫獲得的，則目的基因是不含啟動子和終止子的。若只將基因的編碼序列導入受體生物中，目的基因沒有啟動子、終止子，是無法轉錄的，因此，在構建基因表達載體時，需要在與質粒結合之前，在目的基因的前后端接上特定的啟動子、終止子。

（3）特異性啟動子。組織特異啟動子又稱器官特異性啟動子。在這類啟動子調控下，基因往往只在某些特定的器官或組織部位表達，并表現出發育調節的特性。如乳房生物反應器生產藥用蛋白時，使用的是該類基因。

【例2】（2012年安徽卷T31，節選）甲型血友病是由X染色體上的隱性基因導致的遺傳?。℉對h為顯性）。圖1中兩個家系都有血友病發病史，Ⅲ2和Ⅲ3婚后生下一個性染色體組成是XXY的非血友病兒子（Ⅳ2），家系中的其他成員性染色體組成均正常。

圖1

（5）利用轉基因豬乳腺生物反應器可生產F8。要使乳腺細胞合成F8，構建表達載體時，必須將F8基因cDNA與豬乳腺蛋白基因的__________等調控組件重組在一起。F8基因cDNA可通過克隆篩選獲得，該cDNA比染色體上的F8基因短，原因是該cDNA沒有_________。

【解析】（5）要使乳腺細胞合成F8，構建表達載體時，必須將F8基因cDNA與豬乳腺蛋白基因的啟動子和終止子等調控組件重組在一起。F8基因cDNA可通過克隆篩選獲得，該cDNA比染色體上的F8基因短，原因是該cDNA沒有內含子。

【答案】（5）啟動子 內含子

3.標記基因是否為載體上固有結構

作為運載體必須具備以下幾個特點：能夠在宿主細胞中復制并穩定地保存；具有多個限制酶切點，以便與外源基因連接；具有某些標記基因，便于進行篩選。質粒是基因工程最常用的運載體，它存在于許多細菌以及酵母菌等生物中，是能夠自主復制的很小的環狀DNA分子。根據此分析可知：標記基因是質粒上固有的。但在實踐中由于構建載體的目的不同，需要的標記基因也會不同，有的標記基因是需要另外加上的，如綠色熒光蛋白基因與目的基因做成融合基因，根據熒光蛋白的特性來確定目的基因表達的產物存在于細胞的什么部位。如2009年安徽高考和廣東理科基礎卷中都涉及“綠色熒光蛋白基因”。

【例3】（2009年安徽卷T4）2008年諾貝爾化學獎授予了“發現和發展了水母綠色熒光蛋白”的三位科學家。將綠色熒光蛋白基因的片段與目的基因連接起來組成一個融合基因，再將該融合基因轉入真核生物細胞內，表達出的蛋白質就會帶有綠色熒光。綠色熒光蛋白在該研究中的作用是 （ ）

A 追蹤目的基因在細胞內的復制過程

B 追蹤目的基因插入到染色體上的位置

C 追蹤目的基因編碼的蛋白質在細胞內的分布

D 追蹤目的基因編碼的蛋白質的空間結構

【解析】本題屬于信息給予題（或叫材料背景題），考查獲取信息、分析推理等能力。根據題干“將綠色熒光蛋白基因的片段與目的基因連接起來組成一個融合基因，再將該融合基因轉入真核生物細胞內，表達出的蛋白質就會帶有綠色熒光”這句話可知：綠色熒光蛋白基因不是目的基因，而是對目的基因進行標記。借助綠色熒光蛋白基因的表達來對目的基因表達產物進行追蹤提示。

【答案】C

4.載體上標記基因的標記原理

載體上的標記基因一般是一些抗生素的抗性基因。目的基因要轉入的受體細胞沒有抵抗相關抗生素的能力。當含有抗生素抗性基因的載體進入受體細胞后，抗性基因在受體細胞內表達，使受體細胞能夠抵抗相應抗生素，所以在受體細胞的培養體系中加入該種抗生素就可以只保留轉入載體的受體細胞。

【例4】（2016年全國卷ⅠT40，節選）某一質粒載體如圖所示，外源DNA插入到Ampr或Tetr中會導致相應的基因失活（Ampr表示氨芐青霉素抗性基因，Tetr表示四環素抗性基因）。有人將此質粒載體用BamHⅠ酶切后，與用BamHⅠ酶切獲得的目的基因混合，加入DNA連接酶進行連接反應，用得到的混合物直接轉化大腸桿菌，結果大腸桿菌有的未被轉化，有的被轉化。被轉化的大腸桿菌有三種，分別是含有環狀目的基因、含有質粒載體、含有插入了目的基因的重組質粒的大腸桿菌?；卮鹣铝袉栴}：

（2）如果用含有氨芐青霉素的培養基進行篩選，在上述四種大腸桿菌細胞中，未被轉化的和僅含有環狀目的基因的細胞是不能區分的，其原因是____________；并且____________和__________的細胞也是不能區分的，其原因是__________。在上述篩選的基礎上，若要篩選含有插入了目的基因的重組質粒的大腸桿菌的單菌落，還需使用含有是_________的固體培養基。

【解析】（2）依題意可知，目的基因插入后，導致四環素抗性基因（Tetr）失活，而氨芐青霉素抗性基因（Ampr）仍能行使正常功能。如果用含有氨芐青霉素的培養基進行篩選，在上述四種大腸桿菌細胞中，未被轉化的和僅含有環狀目的基因的細胞，因二者均不含氨芐青霉素抗性基因，在該培養基上都不能生長，所以是不能區分的；含有質粒載體和含有插入了目的基因的重組質粒的細胞，因二者都含氨芐青霉素抗性基因，在該培養基上都能生長，因此也是不能區分的。在上述篩選的基礎上，若要篩選含有插入了目的基因的重組質粒的大腸桿菌的單菌落，還需使用含有四環素的固體培養基；因目的基因插入后，導致四環素抗性基因（Tetr）失活，含有插入了目的基因的重組質粒的大腸桿菌在該培養基中不能生長，而含有質粒載體的則能正常生長。

【答案】（2）二者均不含氨芐青霉素抗性基因，在該培養基上都不能生長 含有質粒載體 含有插入了目的基因的重組質粒（或答含有重組質粒） 二者都含氨芐青霉素抗性基因，在該培養基上均能生長 四環素

（作者單位：安徽省靈璧縣靈璧一中）