奧沙利鉑調控PI3K/Akt信號通路抑制腦膠質瘤細胞株U87生長的作用研究①

段友強 劉義鋒 李 巍

(鄭州大學附屬鄭州中心醫院神經外科，鄭州450007)

·基礎免疫學·

奧沙利鉑調控PI3K/Akt信號通路抑制腦膠質瘤細胞株U87生長的作用研究①

段友強 劉義鋒②李 ?、?/p>

(鄭州大學附屬鄭州中心醫院神經外科，鄭州450007)

目的：研究奧沙利鉑(Oxaliplatin,Ox)調控PI3K/Akt信號通路抑制腦膠質瘤細胞株U87生長的作用。方法：培養U87腦膠質瘤細胞，分別利用0、20、40、80 μg/ml的奧沙利鉑處理U87細胞24、36、48、72 h，利用MTT檢測各處理組細胞增殖情況；利用流式細胞儀檢測40 μg/ml的奧沙利鉑處理48 h對U87細胞周期及細胞凋亡的影響；Western blot檢測40 μg/ml 的奧沙利鉑處理48 h對U87細胞凋亡相關蛋白及PI3K/Akt信號通路蛋白表達的影響。結果：奧沙利鉑處理抑制U87細胞增殖，與0 μmol/L處理相比，差異顯著(P<0.01)，40 μg/ml的奧沙利鉑處理48 h差異最顯著。40 μg/ml的奧沙利鉑處理48 h后，U87細胞周期被阻滯在S期，U87細胞凋亡顯著增加(P<0.01)，抑凋亡因子Bcl-2蛋白表達明顯下降，促凋亡因子Bax、Cleaved-caspase3蛋白表達明顯升高(P<0.01)，PI3K及p-Akt的表達量明顯降低(P<0.01)，Akt表達量無明顯差異(P>0.05)。結論：奧沙利鉑可能通過抑制PI3K/Akt信號通路抑制U87細胞增殖，阻滯細胞周期，促進細胞凋亡。

奧沙利鉑；腦膠質瘤細胞；增殖；細胞周期；凋亡

腦膠質瘤常發于神經外胚層，是神經系統常發惡性腫瘤，發病率約占顱內腫瘤的45%[1]。目前對膠質瘤的治療仍以手術為主，但是由于膠質瘤具有浸潤性生長的特點，手術并不能完全切除癌變組織，手術后極易復發，致死率極高[2，3]，因此迫切的需要尋找新的膠質瘤治療手段。奧沙利鉑是第三代鉑類抗癌藥物，具有極好的抗腫瘤效果，藥物對正常細胞的毒副作用較小，與順鉑、卡鉑之間無交叉耐藥的出現[4]。奧沙利鉑在結腸癌[5]、乳腺癌[6]、非小細胞肺癌[7]、胃癌[8]等癌癥的治療中取得了較好的效果，但是關于奧沙利鉑作用于膠質瘤的相關研究還較少。本研究通過體外培養腦膠質瘤細胞株U87，并使用奧沙利鉑處理，探究了奧沙利鉑對U87細胞增殖、細胞周期以及凋亡的影響，并探討了可能存在的作用機制，以期為腦膠質瘤的治療提供基礎研究。

1 材料與方法

1.1 材料 膠質瘤U87細胞系由中國科學院細胞庫提供；奧沙利鉑購自山東鉑源藥業有限公司；胎牛血清、胰蛋白酶、DMEM培養基購自美國Hyclone；蛋白酶裂解液購自上海碧云天生物技術有限公司；Bax單抗、Bcl-2單抗、Cleaved-caspase3單抗、PI3K單抗、Akt單抗、p-Akt單抗購自美國CTS；蛋白提取試劑盒、細胞凋亡檢測試劑盒購自南京凱基生物科技有限公司；MTT試劑盒購自美國Roche；酶標儀、流式細胞儀購自美國Thermo。

1.2 方法

1.2.1 U87細胞培養 取凍存的腦膠質瘤U87細胞株，置于37℃恒溫水浴鍋解凍，解凍完全后離心收集細胞，將細胞接種于含10%胎牛血清的DMEM培養基中，細胞放于37℃、5%CO2細胞培養箱中培養至約鋪滿培養皿底80%時取出，棄去細胞培養液，使用PBS緩沖液沖洗細胞2次，向細胞中加入0.25%的胰蛋白酶消化2～3 min，待大部分細胞脫離皿底時，向細胞中加入DMEM細胞培養液終止消化，細胞轉移至離心管中離心收集沉淀，向沉淀中加入DMEM培養液重懸細胞，重懸后細胞接種至新的含10%胎牛血清的DMEM細胞培養液中繼續培養。

1.2.2 四氮唑藍測定細胞增殖 取對數生長期的U87細胞，棄去細胞培養液，經PBS緩沖液清洗后，加入0.25%胰酶消化，消化完全后將細胞轉移至離心管中，1 000 r/min離心10 min取沉淀，向細胞沉淀中加入培養液后重懸，顯微鏡下計數并調整細胞濃度為5×106個/ml，按每孔200 μl的量將細胞懸液接種于96孔板中，將細胞置于細胞培養箱中培養24 h。培養結束后棄去舊培養液，向細胞中分別加入含奧沙利鉑濃度為0、20、40、80 μg/ml的新鮮細胞培養液，并設置空白對照組，空白對照組不加細胞，置于細胞培養箱中繼續培養24、36、48、72 h，培養結束前4 h向每孔細胞中加入20 μl MTT，置于培養箱中繼續培養直至結束，向每孔細胞中加入200 μl DMSO，混勻后置于酶標儀中檢測490nm處吸光度，并分析細胞的增殖情況。細胞存活率=(實驗組OD值-空白組OD值)/(對照組OD值-空白組OD值)×100%。

1.2.3 流式細胞儀PI單染色法檢測細胞周期將U87細胞接種于6孔板中，細胞生長至對數期后，加入40 μg/ml的奧沙利鉑處理48 h，另取不做處理的細胞作為對照，胰酶消化各組細胞后，離心收集細胞沉淀，PBS重懸細胞并調整細胞濃度為5×105個/ml，取1 ml細胞，向細胞中加入3 ml預冷的75%的乙醇4℃過夜，PBS清洗2次，加入500 μl含50 mg/L RNaseA及10 μg/ml PI的PBS緩沖液，室溫避光孵育30 min后，利用流式細胞儀檢測細胞周期的分布情況。

1.2.4 流式細胞儀測定細胞凋亡 將U87細胞接種于6孔板中，待細胞生長至對數期，向細胞中加入終濃度為40 μg/ml的奧沙利鉑處理細胞48 h，另取不做處理的細胞作為對照，胰酶消化各組細胞，離心收集細胞沉淀，PBS重懸細胞并調整細胞濃度為5×105個/ml，取1 ml細胞，向細胞中加入10 μl Annexin V-FITC和5 μl PI，室溫避光孵育15 min后，使用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。

1.2.5 Western blot檢測細胞中相關蛋白表達 取對數生長期的經40 μg/ml奧沙利鉑處理48 h的U87細胞，胰酶消化后收集細胞沉淀，向沉淀中加入細胞裂解液后置于冰上孵育30 min，4℃，12 000 r/min離心20 min，上清轉移至新的離心管中，采用BCA試劑盒檢測所提取蛋白濃度。向提取的蛋白中加入Loading Buffer，100℃煮沸5 min制備蛋白樣品。配置蛋白膠，蛋白膠凝固后上樣，保證每孔蛋白上樣量一致，80 V電泳30 min后，換用120 V電壓繼續電泳，直至溴酚藍跑出玻璃板。冰浴100 V轉膜，5%脫脂奶粉室溫孵育PVDF膜6 h，分別以Bax、Bcl-2、Cleaved-caspase3、PI3K、Akt、p-Akt單克隆抗體作為一抗，4℃過夜孵育，TBST清洗3次，加入二抗置于37℃孵育1 h，TBST清洗3次，加入ECL發光劑進行顯影，利用自動凝膠成像系統采集圖像。

2 結果

2.1 奧沙利鉑抑制U87細胞增殖 分別使用0、20、40、80 μg/ml的奧沙利鉑處理對數期的U87細胞24、36、48、72 h后，利用MTT檢測各組細胞存活情況，并進行統計，結果如圖1所示，奧沙利鉑處理對U87細胞的存活具有抑制作用，且具有濃度時間依賴性，U87細胞存活率隨著奧沙利鉑處理時間的增長、處理濃度的增高而降低，與0 μg/ml處理相比，差異顯著(P<0.01)。40 μg/ml的奧沙利鉑處理48 h對U87細胞存活的抑制作用最明顯。

2.2 奧沙利鉑對U87細胞周期的影響 利用流式細胞儀檢測40 μg/ml奧沙利鉑處理48 h對U87細胞周期的影響，結果如表1所示，奧沙利鉑處理后，G0/G1期和G2/M期細胞減少，S期細胞增多，與 0 μg/ml奧沙利鉑處理相比，差異顯著(P<0.05)，40 μg/ml奧沙利鉑處理誘導U87細胞被阻滯在S期。

2.3 奧沙利鉑促進U87細胞凋亡 40 μg/ml奧沙利鉑處理U87細胞48 h后，利用流式細胞儀檢測U87細胞凋亡情況，并進行統計，結果如圖2所示，40 μg/ml奧沙利鉑處理后，U87細胞凋亡明顯增多，與0 μg/ml處理相比差異具有顯著統計學意義(P<0.01)。

圖1 奧沙利鉑處理對U87細胞存活的影響Fig.1 Effect of oxaliplatin treatment on U87 cell survivalNote: **.P<0.01.

GroupsG0/G1phase(%)Sphase(%)G2/Mphase(%)0μg/mloxaliplatin39.40±1.2447.25±2.2013.35±2.5340μg/mloxaliplatin32.75±2.391)56.53±3.501)10.72±1.051)

Note：Compared with 0 μg/ml oxaliplatin group,1)P<0.05.

圖2 奧沙利鉑處理對U87細胞凋亡的影響Fig.2 Effect of oxaliplatin treatment on U87 cell apoptosisNote: A.Flow cytometry detected U87 cell apoptosis；B.U87 cell apoptosis rate,**.P<0.01.

2.4 奧沙利鉑對Bcl-2、Bax、Cleaved-caspase3蛋白表達的影響 收集經40 μg/ml奧沙利鉑處理48 h后處于對數期的U87細胞，提取細胞總蛋白，Western blot檢測凋亡相關蛋白Bcl-2、Bax、Cleaved-caspase3的表達，結果如圖3所示，40 μg/ml奧沙利鉑處理后，抑凋亡因子Bcl-2蛋白表達量降低，促凋亡因子Bax、Cleaved-caspase3蛋白表達量升高，與0 μg/ml處理相比具有顯著性差異(P<0.01)。

圖3 奧沙利鉑處理對U87細胞凋亡蛋白表達影響Fig.3 Effect of oxaliplatin on expression of apoptotic protein in U87 cellsNote: A.Western blot detected the protein expression rate；B.The protein relative expression rate,**.P<0.01.

圖4 奧沙利鉑處理對PI3K/Akt通路關鍵蛋白表達影響Fig.4 Effect of oxaliplatin treatment on protein expression in PI3K/Akt pathwayNote: A.Western blot detected the protein expression rate；B.The protein relative expression rate,**.P<0.01.

2.5 奧沙利鉑對PI3K、Akt、p-Akt蛋白表達的影響 Western blot檢測40 μg/ml奧沙利鉑處理48 h對PI3K/Akt通路蛋白表達的影響，結果如圖4所示，與0 μg/ml處理相比，40 μg/ml奧沙利鉑處理后，PI3K及p-Akt的表達量明顯降低(P<0.01)，Akt表達量無明顯差異(P>0.05)。

3 討論

腦膠質瘤是常發于人顱內的一種原發性腫瘤，是顱內發病率以及致死率最高的惡性腫瘤。傳統的腦膠質瘤治療手段是手術切除為主，輔以放療、化療、生物治療等多種治療方法。由于腦膠質瘤的惡性程度極高，在顱內呈浸潤性生長，與正常腦組織的界限很不明顯，手術難以完全切除癌變組織，因此術后腦膠質瘤的復發率極高。

奧沙利鉑是繼順鉑和卡鉑之后開發的第三代鉑類金屬抗腫瘤藥物，屬于DNA烷化劑。奧沙利鉑不僅具有很高的抗癌活性，而且對順鉑耐藥的細胞也具有抑制作用。研究發現，奧沙利鉑進入到細胞內，通過與DNA結合形成鉑類-DNA復合物，引起DNA的損傷，進而引起細胞凋亡；引起腫瘤細胞凋亡是鉑類抗腫瘤藥物發揮作用的主要方式[9]。為了探究奧沙利鉑對腦膠質瘤細胞的作用，分別使用0、20、40、80 μg/ml的奧沙利鉑處理U87細胞24、36、48、72 h，檢測U87細胞的存活情況，結果發現，奧沙利鉑能顯著抑制膠質瘤細胞的存活，且呈濃度時間依賴性，其中40 μg/ml的奧沙利鉑處理48 h對U87細胞存活的抑制作用最明顯。膠質瘤的發生發展過程十分復雜，除了與細胞活性的升高有關之外，與細胞周期調控的失常也具有密切的關系。細胞周期進程中，細胞周期蛋白通過與相關的激酶結合調控細胞周期進程[10]。腫瘤藥物通常將腫瘤細胞周期阻滯在G1/S或G2/M期，從而修復受損的DNA[11]。本研究利用40 μg/ml奧沙利鉑處理U87細胞48 h，流式細胞儀檢測細胞周期的分布情況，結果顯示，奧利沙鉑處理后，處于G0/G1期和G2/M期細胞減少，S期細胞增多，說明奧利沙鉑處理誘導U87細胞被阻滯在S期。Bcl-2和Bax屬于Bcl-2家族，Bcl-2家族在細胞凋亡過程中具有重要的作用[12]。Bcl-2抑制細胞凋亡，Bax對細胞凋亡具有促進作用，二者在細胞中常以同源或異源二聚體形式存在[13]。當細胞內Bcl-2含量增多時，Bcl-2/Bax二聚體含量增多，凋亡受到抑制，當Bax含量增加時，Bax自身形成同源二聚體，促進細胞凋亡[14]。caspase家族在細胞凋亡過程中具有重要作用。caspase3位于caspase級聯反應的下游，是caspase凋亡依賴途徑的交匯點，caspase3的活化對細胞凋亡具有促進作用[15]。流式細胞儀檢測結果顯示，40 μg/ml奧沙利鉑處理U87細胞48 h顯著促進U87細胞凋亡，Western blot檢測結果發現，奧沙利鉑處理后，Bcl-2蛋白表達明顯降低，Bax、Cleaved-caspase3蛋白表達明顯升高，證實奧沙利鉑通過調控凋亡相關蛋白的表達促進U87細胞凋亡。

PI3K/Akt信號通路在細胞中廣泛存在，對細胞的增殖、分化、凋亡及細胞周期進程具有調控作用[16]。有研究證實，PI3K/Akt通路的活化促進癌細胞增殖，抑制凋亡的發生[17]。研究PI3K/Akt對細胞凋亡的調控，發現活化的Akt通過磷酸化Bcl家族成員BAD，阻斷BAD/Bcl-2復合體的形成，直接調控細胞凋亡[18]，也可以通過磷酸化NF-κB，促進NF-κB轉錄，進而促進Bcl-xl的表達，促進細胞存活[19]，Akt還可通過磷酸化mTOR參與細胞周期進程[20]。本研究利用Western blot檢測奧利沙鉑處理對PI3K、Akt、p-Akt蛋白表達的影響，結果顯示，奧沙利鉑處理后，PI3K及p-Akt的表達量明顯降低，Akt表達量無明顯差異，證實奧利沙鉑對PI3K/Akt信號通路具有抑制作用。奧沙利鉑處理可以顯著抑制U87細胞增殖，阻滯細胞周期進程，促進細胞凋亡，作用機制可能與PI3K/Akt信號通路的抑制有關，為臨床上奧沙利鉑治療腦膠質瘤提供了新的研究思路。

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[收稿2016-09-26 修回2016-11-08]

(編輯 倪 鵬)

Research of oxaliplatin inhibit growth in glioma U87 cells by regulating PI3K/Akt signal pathway

DUANYou-Qiang,LIUYi-Feng,LIWei.

DepartmentofNeurosurgery,ZhengzhouCentralHospitalAffiliatedtoZhengzhouUniversity,Zhengzhou450007,China

Objective:To investigate the effect of oxaliplatin inhibit the growth in glioma U87 cells by regulating PI3K/Akt signal pathway.Methods: The glioma U87 cells were cultivated in vitro,using 0,20,40,80 μg/ml oxaliplatin treated U87 cells 24,36,48,72 h respectively,MTT was used to detect cell proliferation.Using 40 μg/ml oxaliplatin treated U87 cells 48 h,flow cytometry was used to detect cell cycle and apoptosis.Cells apoptosis protein and PI3K/Akt pathway protein expression after 40 μg/ml oxaliplatin treated U87 cells 48 h was detected by Western blot.Results: MTT assay showed that compared with the 0 μg/ml treatment,oxaliplatin treatment could significantly inhibited U87 cell survival (P<0.01),40 μg/ml oxaliplatin treatment 48 h ,the survival inhibitory was the most obvious.U87 cell cycle was arrested in S phase after 40 μg/ml oxaliplatin treatment 48 h.After 40 μg/ml oxaliplatin treatment 48 h,compared with the 0 μg/ml treatment,U87 cell apoptosis rate significantly increased (P<0.01).Western blot showed that after 40 μg/ml oxaliplatin treatment,anti-apoptotic factor Bcl-2 expression had significant decreased,pro-apoptotic factors Bax,Cleaved-caspase3 protein expression had significantly increased (P<0.01).PI3K,p-Akt expression was significantly decreased (P<0.01),and Akt expression had no significant change in Akt pathway (P>0.05).Conclusion: Oxaliplatin may suppress U87 cell proliferation,arrest cell cycle,and promote apoptosis by inhibit PI3K/Akt signaling pathway.

Oxaliplatin; Glioma cells; Proliferation; Cell cycle; Apoptosis

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.03.002

①本文為國家自然科學基金項目(No.81401097)。

段友強(1967年-)，男，碩士，主治醫師，主要從事神經外科方面的研究，E-mail：youqiangduan6705@163.com。

R739.4

A

1000-484X(2017)03-0328-05

②鄭州大學附屬南陽中心醫院神經內科，南陽473000。

③沈陽軍區總醫院神經內科，沈陽110000。