miR-122a抑制人喉癌細胞株Hep2細胞增殖的研究

陳云華 于亞峰

(常熟市第二人民醫院耳鼻咽喉科，常熟215500)

miR-122a抑制人喉癌細胞株Hep2細胞增殖的研究

陳云華 于亞峰①

(常熟市第二人民醫院耳鼻咽喉科，常熟215500)

目的：研究miR-122a對人喉癌細胞株Hep2細胞增殖、細胞周期以及相關蛋白表達量的影響。方法：人喉癌細胞株Hep2細胞分別轉染miR-122a寡聚核苷酸(A組)和miR-122a inhibitor(阻遏物)(B組)，同時設立阻遏物陰性對照( inhibitor negative control，miR-NC inhibitor)(C組)和空白對照(D組)。用RT-PCR、MTT法、流式細胞儀和Western blot技術評價各組細胞增殖和細胞周期的生物學特征。結果：轉染miR-122a寡聚核苷酸后，Hep2細胞中miR-122a表達顯著增加。同D組相比，A組細胞增殖水平明顯受到抑制，miR-122a寡聚核苷酸能夠有效誘導Hep-2細胞周期阻滯在G1/G0期，A組細胞分裂周期蛋白42表達水平明顯下調，細胞周期調控因子蛋白CDK4及細胞周期素D1蛋白表達水平明顯降低。結論：miR-122a寡聚核苷酸能夠顯著抑制喉癌細胞Hep2的增殖，miR-122a是潛在的人喉癌細胞基因治療的候選靶點。

喉腫瘤；miR-122a；細胞周期；Hep2細胞

喉癌作為頭頸部常見的惡性腫瘤之一，現階段常用的治療手段主要包括兩種，放療后全喉切除或者是直接手術治療。但是這兩種治療的方式影響了患者的術后喉功能和生活質量[1，2]。因而需要研發新的治療策略，微小RNA(miRNAs，miRNA)分子治療因其對機體損傷較小的優勢成為相關腫瘤的新治療模式。微小RNA是非編碼小RNA，大小為20～25個核苷酸(nucleotide，nt)。最近相關研究表明，miRNA能夠在細胞功能調控方面發揮巨大作用，同腫瘤的發生和發展密切相關，例如，在腫瘤中某些miRNA呈特異性表達，表現出促癌或者抑癌的作用[3]。借助芯片技術的巨大優勢，依托常熟市第二人民醫院和蘇州大學附屬第一醫院大量的人喉癌標本組織，美國LC Sciences公司提供通過測定分析正常人喉組織和人類喉癌細胞系中miRNA表達譜，研究結論發現多種人喉癌中表達特異性的miRNA(見表1)。miR-122a作為一個有代表性的miRNA，是抑癌性微小RNA，近期的研究結果證實miR-122a在許多腫瘤組織中表達量較低[4]，這其中就包括喉癌。本研究通過轉染人喉癌細胞，增加miR-122a在喉癌細胞中的表達量，觀察其對人喉癌瘤細胞周期相關蛋白表達量以及其增殖的影響，從而探究miR-122a對喉癌細胞生長增殖的生物學特征影響。本文旨在研究喉癌發生發展中miR-122a對喉癌的影響作用機制，最后能夠為miR-122a作為喉癌診斷以及治療靶點提供合理的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料 通過miRNAs目標靶基因數據庫(http://www.mirbase.org/)查詢獲得miR-122a基因序列，并且委托華大基因公司設計合成；胎牛血清由杭州四季青生物工程材料有限公司提供，1640培養基由美國Hyclone提供，Lipofectamine 2000轉染試劑由美國Invitrogen 公司提供，寡聚核苷酸由上海華大基因科技有限公司提供，TaqMan microRNA反轉錄試劑盒由寶生物工程(大連)有限公司提供，PVDF 膜為美國伯樂Bio-Rad，ECL發光液顯影液由美國賽默飛公司提供，細胞周期蛋白一抗CDC42、CDK4和Cyclin D由武漢博士德生物工程有限公司提供。主要儀器：MK3多功能酶標儀由美國賽默飛公司提供，FACSCanto流式細胞儀由美國BD公司提供，上海天能Tanon 3500凝膠成像系統由河南博奧誠恒科貿有限公司提供，Image J軟件由美國國立衛生研究院提供。

1.2 方法

1.2.1 Hep2細胞培養和轉染 將Hep2細胞分為A組(轉染miR-122a寡聚核苷酸組)、B組(miR-122a inhibitor)，C組(miR-122a-NC inhibitor)和D組(空白對照組)。在37℃、5%CO2孵箱中，細胞培養在含10%新生胎牛血清的1640培養基中，待細胞生長到對數生長期時進行測量。將調整后的Hep2細胞(1×106ml-1)接種到12孔培養板中，正常培養24 h，融合細胞在50%～60%時。轉染試劑和寡聚核苷酸按照說明書進行1∶1混合，混勻后孵育15 min，接種到12孔板中，然后繼續培養6 h，換完生長液后連續培養24 h。然后重復轉染1次，不作處理的組為空白對照組。

1.2.2 miR-122a的表達檢測 轉染Hep2細胞2 d后，利用細胞刮刀收集細胞。將提取的總miRNA溶入無RNA酶的雙蒸水中，用來檢測miRNA的質量和濃度。利用TaqMan microRNA反轉錄試劑盒進行反轉錄，加入反義miRNA或內參U6引物擴增。在擴增反應結束以后，分析PCR反應曲線，最后得到Ct值。PCR反應完成后，利用ABI 7300System SDS軟件分析，記錄分析與之相應的Ct值，利用2-ΔΔCt方法計算基因相對表達量。

1.2.3 MTT法檢測Hep2細胞增殖 Hep2細胞轉染48 h后，用胰酶消化后經PBS沖洗，收集細胞。進行細胞計數以后，以濃度2×104個/100 μl分裝到96孔培養板中，做6個復孔。在37℃、5%CO2培養條件下，每孔加入5 μl的MTT溶液培養，到達檢測點(24、48、72 h)時棄去培養液，每孔加入150 μl二甲基亞砜，輕輕振動10 min，在550nm波長處，利用多功能酶標儀，檢測各孔的吸光度值。

1.2.4 利用流式細胞術檢測腫瘤細胞的周期 腫瘤細胞被轉染48 h以后，通過胰酶消化后收集腫瘤細胞，加入PBS混勻，1 500 r/min離心 5 min，重復洗1次。最后分別加入PI及RNase A，利用流式細胞儀檢測Hep2腫瘤細胞的周期狀況。

1.2.5 周期相關蛋白表達的檢測 經寡聚核苷酸轉染48 h后的四組腫瘤細胞提取總蛋白，以利用傳統的BCA蛋白定量法進行蛋白定量。對應的SDS-PAGE(12%)凝膠電泳分離蛋白質(40 μg)。濕轉至PVDF膜，脫脂奶粉37℃封閉1 h，在4℃下，細胞周期蛋白一抗CDC42、CDK4和Cyclin D孵育過夜，HRP標記的二抗孵育1.5 h后。利用ECL發光液顯影和凝膠成像儀成像。利用Image J軟件分別測量四組電泳條帶的灰度值。獲得各實驗組相對灰度值(不同處理組灰度值除以空白對照組)，從而判斷CDC42蛋白相對的表達情況，GAPDH作為內對照。

表1 正常人喉組織和人類喉癌細胞系miRNA表達譜

Tab.1 miRNA differentially expressed profile between normal laryngeal tissue and human laryngeal carcinoma cell line

miRNAProportionNormallaryngealtissueMinimumMaximumAverageHumanlaryngealcarcinomacelllineMinimumMaximumAveragemiR-1005.013195.536367.894564.5812229.7630860.3422039.98miR-106b4.51590.813166.841591.572574.777172.735481.94miR-122a0.029159.7516700.512816.97112.31345.56228.94miR-127-3P6.61586.641235.18905.143406.868928.986137.62miR-175.793077.46936.94438.1514540.138039.8825196.79miR-2181.011631.4116004.838929.611000.0217231.129018.91miR-29c0.26947.255562.42570.93164.321269.59632.47

Note：The results ofP<0.01 in table were obtained byttest of indepo samples,and the proportion were between human laryngeal carcinoma cell line and normal human laryngeal tissue.

2 結果

2.1 miRNA微陣列芯片表達譜分析結果 微陣列芯片雜交結果顯示，miR-122a的表達降低最明顯，見表1。

2.2 Hep2細胞中miR-122a的表達檢測結果 Hep2細胞被轉染miR-122a寡聚核苷酸48 h以后，miR-122a相對表達量分別為：D組(51.49±0.31),C

圖1 轉染miR-122a后，Hep2細胞中miR-122a表達水平明顯上調Fig.1 MiR-122a expression levels significantly increased in Hep2 cells after transfected miR-122a

圖2 轉染miR-122a后不同時間MTT法檢測Hep2細胞生長情況Fig.2 MTT assay Hep2 cells growth at different times after transfected miR-122a

圖3 miR-122a誘導Hep2細胞周期阻滯在G1/G0期Fig.3 miR-122a induced Hep2 cell cycle arrest in G1/ G0 phase

組(53.58±0.68)，B組(43.36±0.64)，A組(96.13±1.12)。經單因素方差分析，4組整體差異顯著(F=1 905.178，P=0.000)，兩兩比較發現：與D組相比，A組細胞中miR-122a表達水平明顯上調，差異具有統計學意義(LSD-t=52.493，P=0.000)，見圖1。

2.3 MTT法檢測Hep2腫瘤細胞的增殖情況 Hep2細胞被miR-122a寡聚核苷酸轉染以后，利用MTT法分別在24、48、72 h后腫瘤細胞相對存活率如圖2所示。在24 h后不同時間段內，A組的相對存活率顯著低于B、C和D組 (均P<0.05)，見圖2。

2.4 腫瘤細胞周期的檢測 miR-122a寡聚核苷酸轉染Hep2腫瘤細胞48 h，A組細胞G1/G0期達68.28%，明顯高于B組(30.34%)，C組(46.27%)和D組(46.66%)，具有差異統計學意義(P<0.05)。結果表明miR-122a寡聚核苷酸能夠有效誘導Hep2細胞周期阻滯在G1/G0期。見圖3、4。

2.5 Western blot檢測CDC42及細胞周期相關蛋白的表達 轉染miR-122a寡聚核苷酸的Hep2細胞48 h后，A組CDC42蛋白表達量B組和D組相比，其表達量明顯減少(P<0.05)，表明Hep2細胞在被miR-122a寡聚核苷酸轉染后CDC42蛋白表達水平降低，同miR-122a呈負相關。而且同C組相比，CDK4以及Cyclin D1蛋白表達水平也是明顯減少，見圖5。

圖4 轉染miR-122a Hep2細胞周期圖Fig.4 Transfected with miR-122a in Hep2 cell cycle

圖5 各組CDK4、Cylin D1及CDC42蛋白表達水平Fig.5 CDK4,Cyclin D1 protein levels and CDC42 in groups

3 討論

miRNAs作為一類內源性非編碼的小RNA分子，近期科研結果顯示miRNA與人類多種腫瘤的形成與發展密切關聯。miR-122a作為廣泛存在的且在人類正常細胞中發現較早的miRNA，其中重要的特點是miR-122a在多種腫瘤組織中呈低表達的狀態。當今熱點之一是探討miRNA在腫瘤發生和發展中的功能?，F階段miRNA的發現為研究基因的表達調控提供了另一種研究思路[5]。

喉癌其本質上是因為其多基因異常而發生的惡性疾病[6]。miR-122a與喉癌細胞相關周期蛋白的表達目前國內外尚沒有相關報道。本次研究通過轉染miR-122a寡聚核苷酸的方式，使Hep2細胞內的miR-122a表達量升高，通過RT-PCR法檢測其表達數量后，研究結果與空白組相比，轉染寡聚核苷酸組的喉癌細胞中miR-122a表達量明顯增多，并且進一步研究發現，通過MTT法檢測喉癌細胞增殖，轉染寡聚核苷酸組喉癌細胞的相對存活率隨著時間的相對延長，抑制效應增強，并且明顯降低。另外細胞周期實驗結果顯示，寡聚核苷酸miR-122a能有將腫瘤細胞阻滯在G1/G0期。本研究表明，miR-122a同抑制喉癌細胞的增殖密切相關。因此本次研究推測miR-122a可能在喉癌的發生過程中起著非常重要的抑制作用。

研究表明，細胞周期中的G1期是啟動細胞周期循環的重要時期。其中的CDK4/Cyclin D1是G1期向S期轉換的重要的周期蛋白[7]。Western blot的研究結果顯示CDK4/Cyclin D1表達相對于對照組和無義序列組顯著減少，此結果表明G1期向S期轉換受到明顯的抑制作用。CDC42具有GTP酶活性，定位于人染色體1p36.1[8，9]。當前研究發現CDC42在乳腺癌等多種腫瘤中具有較高的表達量，參與腫瘤細胞增殖、凋亡、周期等有關的許多過程[10，11]。Gao等[12]研究miR-137在HCC肝癌細胞中表達增高，能夠調控CDC42，誘導肝癌細胞周期阻滯在G1/G0期，從而抑制其增殖。本實驗研究發現miR-122a寡聚核苷酸能夠顯著下調CDC42蛋白和CDK4和Cyclin D1水平表達，表明CDC42、CDK4和Cyclin D1可能是miR-122a的下游靶基因，miR-122a通過調控 CDC42、CDK4和Cyclin D1抑制Hep2細胞增殖。我們將進一步研究人喉癌細胞生長過程中miR-122a對Cyclin D1、CDC42和CDK4的調控作用。

總之，體外實驗研究結果顯示，被轉染miR-122a寡聚核苷酸后的Hep2細胞，miR-122a表達量增高明顯。因此我們推測miR-122a通過調節CDC42蛋白的表達，進而影響Hep2喉癌細胞的細胞周期和增殖能力。miR-122a能夠作為潛在的人喉癌細胞基因治療的候選靶點，可為喉癌的臨床治療提供有效的解決方案。

[1] Li P,Liu H,Wang Z,etal.MicroRNAs in laryngeal cancer:implications for diagnosis,prognosis and therapy[J].Am J Transl Res,2016,8(5):1935-1944.

[2] 張思毅,盧仲明,宋新漢,等.喉癌組織中的microRNA差異表達譜及miR-125a-5p抑制喉癌細胞增殖的初步研究[J].中國病理生理雜志,2013,29(1):86-92.

[3] Wierzbicka M,Winiarski P,Osuch-Wójcikiewicz E.The incidence of laryngeal cancer in Europe with special regard to Poland in last 2 decades[J].Otolaryngol Pol,2016,70(4):16-21.

[4] 李 群,陸達鍇,崔 翔,等.非編碼RNA在喉癌發生中的作用及其臨床意義[J].中國細胞生物學學報,2013,35(12):1797-1805.

[5] Sakurai F,Furukawa N,Higuchi M,etal.Suppression of hepatitis C virus replicon by adenovirus vector-mediated expression of tough decoy RNA against miR-122a[J].Virus Res,2012,165(2):214-218.

[6] Michael RS,Ellisen LW.The molecular pathogenesis of head and neck squamous cell carcinoma[J].J Clin Invest,2012,122(6):1951-1957.

[7] Lewis BP,Burge CB,Bartel DP.Conserved seed pairing,often flanked by adenosines,indicates that thousands of human genes are microRNA targets[J].Cell,2005,120(1):15-20.

[8] Yang SW,Ting HC,Lo YT,etal.Guanine nucleotide induced conformational change of Cdc42 revealed by hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry[J].Biochim Biophys Acta,2016,1864(1):42-51.

[9] Fukuda H,Nakamura S,Chisaki Y,etal.Daphnetin inhibits invasion and migration of LM8 murine osteosarcoma cells by decreasing RhoA and Cdc42 expression[J].Biochem Biophys Res Commun,2016,471(1):63-67.

[10] Chou J,Wang BI,Zheng T,etal.MALAT1 induced migration and invasion of human breast cancer cells by competitively binding miR-1 with cdc42[J].Biochem Biophys Res Commun,2016,472(1):262-269.

[11] 解英俊,鄂長勇,盛基堯,等.沉默Cdc42對肝癌細胞增殖、遷移和侵襲能力的影響[J].中華外科雜志,2015,53(12):957-962.

[12] Gao M,Liu L,Li S,etal.Inhibition of cell proliferation and metastasis of human hepatocellular carcinoma by miR-137 is regulated by CDC42[J].Oncol Rep,2015,34(5):2523-2532.

[收稿2016-09-26 修回2016-10-11]

(編輯 許四平)

Impact of miR-122a on inhibition proliferation of laryngeal carcinoma cell line Hep2

CHENYun-Hua,YUYa-Feng.

DepartmentofOtolaryngology,ChangshuSecondPeople′sHospital,Changshu215500，China

Objective:To study the effect of miR-122a on inhibition proliferation of laryngeal carcinoma cell line Hep-2.Methods: The oligomucleotide of miR-122a was transfected into laryngeal carcinoma cell line Hep2 cells,which were devided into three groups of A(miR-122a transfection),B(miR-122a inhibitor),C(miR-122a-NC inhibitor) and group of D(blank control).The expression of miR-122a was defected by RT-PCR,and relevant protein expression was evaluated by Western blot.The cell proliferation and cell cycle were determined by MTT assy and flow cytometry,respectively.Results: Compared to group D,miR-122a expression in Hep2 cells was obviously elevated atter miR-122a-transfected.The proliferation of Hep2 cells in group A was significantly inhibited and the cell cycle arrested at G1/G0 phase.The protein expression of CDC42 was downregulated with decreased expressions of CDK4 and cyclin D1 in group A.Conclusion: miR-122a inhibits the proliferation activity of Hep2 cells,suggesting that miR-122a can be taken as a potential candidate for gene therapy of laryngeal carcinoma.

Laryngeal carcinoma;miR-122a;Cell cycle;Hep2 cells

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.03.007

陳云華(1974年-)，男，副主任醫師，主要從事頭頸部腫瘤方面的研究,E-mail：yunhua1974@126.com。

及指導教師：于亞峰(1974年-)，男，博士，副主任醫師，主要從事頭頸部腫瘤方面的研究。

R739.65

A

1000-484X(2017)03-0352-04

①蘇州大學附屬第一醫院耳鼻咽喉科，蘇州215006。