系統性紅斑狼瘡患者外周血單核細胞PD-L2分子的表達及其臨床意義①

吳萍萍 沈 冬 郭云娣 張雅琴 傅豐慶 劉翠平 孫 靜

(蘇州衛生職業技術學院，蘇州市檢驗醫學重點實驗室，蘇州215009)

系統性紅斑狼瘡患者外周血單核細胞PD-L2分子的表達及其臨床意義①

吳萍萍 沈 冬②郭云娣 張雅琴 傅豐慶③劉翠平③孫 靜

(蘇州衛生職業技術學院，蘇州市檢驗醫學重點實驗室，蘇州215009)

目的：分析系統性紅斑狼瘡患者外周血單核細胞PD-L2分子的表達及其與疾病活動程度的相關性。方法：收集26例系統性紅斑狼瘡患者及38例健康對照組外周血，Ficoll分離單個核細胞后，TRIZOL抽提總RNA，定量PCR分析PD-L2 基因的表達，流式細胞儀檢測CD14、PD-L2分子的表達。統計學分析其相關性及與疾病活動程度之間的關聯。結果：定量PCR結果提示系統性紅斑狼瘡患者外周血單核細胞PD-L2基因表達高于健康對照組(P<0.05)，流式發現單核細胞上PD-L2高表達(P<0.05)，且活動期患者表達高于穩定期，并且與疾病的評分(SLEDAI)呈正相關(P<0.05)。結論：免疫分子PD-L2可能參與系統性紅斑狼瘡疾病的進程并可能成為疾病預防及治療的潛在分子。

系統性紅斑狼瘡；PD-L2；SLEDAI

系統性紅斑狼瘡(Systemic lupus erythematosus，SLE)是一種以自身抗體和免疫復合物產生為特征的自身免疫性疾病，其主要表現為免疫系統活性增強，臨床以高γ球蛋白血癥、免疫復合物形成和補體系統激活為主要特征，其產生的自身抗體對自身抗原有著高度的特異性反應?；颊呙庖呦到y中免疫活性細胞包括T細胞和抗原遞呈細胞的異?；罨菍е旅庖呶蓙y的基礎[1]。

免疫活性細胞之間的信號轉導主要通過細胞間的共刺激分子完成。研究已證明淋巴細胞的活化需要識別雙信號系統，第一信號由TCR與抗原肽-MHC分子復合物特異性結合提供，第二信號由APC與T細胞表面的共刺激分子相互作用提供。正性共刺激分子(CD28、ICOS、ICAM-1、LFA-3等)和負性共刺激分子(CTLA4、BTLA、PD-1等)形成了一個復雜的信號網絡，綜合調節免疫反應，在免疫活化和耐受中起關鍵作用[2-5]。

PD-L2是B7家族第5個被發現的新成員,于2001年Tseng[6]和Mueller[7]在研究PD-L1的功能時發現并報道。PD-1(Programmed death-1)是PD-L1和PD-L2的共同受體[2]，正如B7-CD28信號通路一樣,PD-L1/PD-L2-PD-1信號通路在外周耐受和自身免疫病的發病機制中同樣起著重要的作用。有關PD-L1在自身免疫性疾病中的作用機制已有眾多研究報道，但尚未見有關PD-L2分子與自身免疫性疾病特別是SLE間的相關報道。本研究擬通過Real-time PCR及流式細胞術分析PD-L2分子在SLE外周血單核細胞的分布，并與健康對照組相比較，為研究該發分子的生物學功能及探討其在SLE發病中的機制奠定生物學基礎。

1 對象與方法

1.1 研究對象 26例SLE患者的外周血來自2014年10月至2015年7月蘇州市中醫醫院風濕科。所有病人至少符合4個美國風濕病學會對SLE的診斷標準，并且病人在半年內均未接受過任何的激素或者免疫治療。在研究開展前，標本收集得到了單位倫理委員會的同意。32例健康對照組的外周血來自2015年5月參加健康體檢的正常者。

1.2 方法

1.2.1 Real-time PCR檢測PD-L2的表達 Ficoll梯度分離外周血單個核細胞(Peripheral blood mononuclear cell，PBMC)， TRIZOL抽提其總RNA(TaKaRa，大連)，Oligo-dT反轉錄成cDNA后凍存在-20℃以備用。內參引物為β-actin，序列為：上游5′-ATC TGG CAC CAC ACC TTC TAC C-3′；下游5′-GAT AGC ACA GCC TGG ATA GCA A3′ 。PD-L2引物序列為：上游5′-GTC AGA TGG AAC CCA GGA CC-3′；下游5′-TAG GCT CCA GAG GTG AGT CC-3′。Real-time PCR中所用的SYBR購自QIGEN公司(德國)，使用PCR兩步法進行實驗，具體為95℃10 s，60℃ 30 s，45個循環，結果用Cycel threshold(CT,單個PCR反應達到的對數擴增期的循環數)來表示。將目的基因PD-L2的CT值減去內參的CT值得到ΔCT來反映基因的表達量。

1.2.2 流式細胞術檢測PD-L2的表達 利用流式細胞術評價外周血T細胞、B細胞及單核細胞上PD-L2的表達。1.2.1中利用Ficoll分離的PBMC經PBS洗滌后配置成1×106單細胞懸液，取50 μl分別與3 μl FITC標記CD14抗體(美天旎公司，德國)以及APC標記的PD-L2(BD公司，美國)抗體共孕30 min，PBS洗滌后上機檢測。檢測前注意避光保存，檢測儀器為BD公司Accuri C6型號。

2 結果

2.1 PD-L2在SLE患者外周血PBMC中高表達 TRIZOL抽提SLE患者及健康對照組的總RNA反轉錄后，PCR可從中擴增出PD-L2基因，所用引物擴增的產物大小約為130 bp(見圖1B)。為檢測患者與健康人群中PD-L2的表達差異，我們通過熒光定量PCR擴增PD-L2基因。SLE患者組中PD-L2基因CT均值為29.79，相對內參β-actin基因ΔCT值為-0.98；健康人群組中PD-L2基因CT均值為32.04，相對內參β-actin基因ΔCT值為-4.42。SLE患者組中PD-L2基因表達明顯高于健康對照組。(圖2，P=0.0337)。

2.2 PD-L2在SLE患者外周血單核細胞上高表達 已有的研究報道發現PD-L2在靜息的淋巴細胞包括T細胞、B細胞、單核細胞等上均不表達，而在活化的單核細胞上有表達，為分析SLE患者單核細胞上PD-L2的表達情況，我們用FITC標記的CD14抗體標記單核細胞同時用PE標記的PD-L2進行雙染。結果發現SLE患者單核細胞上PD-L2表達明顯高于健康對照組。SLE患者單核細胞上PD-L2的表達為10.3%，健康對照組上表達率為6.76%。兩者具有顯著統計學差異(P<0.05)，見圖3。

2.3 PD-L2的表達與SLE疾病活動程度密切相關 為分析PD-L2的表達與SLE疾病活動度是否存在相關性。我們分析了PD-L2的表達與疾病活動程度之間的相關性。疾病活動程度根據系統性紅斑狼瘡疾病活動度評分(SLEDAI)，SLEDAI<6 者判定為穩定期病例，SLEDAI>6者判定為活動期病例?；顒悠赟LE患者外周血PD-L2表達明顯高于穩定期，且其表達水平與SLEDAI評分間有一定相關性(圖4)。

圖1 SLE患者外周血中β-actin 基因 及PD-L2基因的表達Fig.1 Expression of PD-L2 and β-actin in peripheral blood of SLE patientsNote: A.The expression of β-actin in PBMC of SLE patients；B.The expression of SLE PD-L2 in PBMC of SLE patients.

圖2 定量PCR檢測SLE患者與健康對照組外周血中PD-L2的表達Fig.2 Expression of PD-L2 through Real-time PCR analysis in PBMC of SLE and healthy controls

圖3 系統性紅斑狼瘡患者外周血單核細胞上PD-L2表達明顯高于健康對照組Fig.3 Increased PD-L2 expression on monocytes in peripheral blood of SLE patientsNote: A.Representative flow cytometry of PD-L2 expression on monocytes in the PBMC of healthy controls;B.Representative flow cytometry of PD-L2 expression on monocytes in the PBMC of SLE grougp;C.The average percent of PD-L2 expression on monocytes.

圖4 系統性紅斑狼瘡外周血單核細胞上PD-L2的表達與疾病活動相關Fig.4 Correlation of PD-L2 expression on monocytes in SLE and degree of disease activity Note: A.The percentage of PD-L2 positive cells is plotted for RA patients with active disease(n=16) and patients in catabasis(n=10).PD-L2 expression was statistically higher in the active stage than in catabasis(P=0.011 2);B.The percentage of PD-L2 positive cells in SLE patients correlates with their disease activity score(SLEDAI)(P=0.046 1).

3 討論

共刺激分子在免疫應答中具有重要作用，其決定了T細胞活化后的去向：增殖、無能或凋亡[8]。正負信號形成復雜的免疫網絡調節免疫反應，發揮免疫效應或是維持免疫耐受。在這其中PD-L1和PD-L2及其受體PD-1的信號途徑被認為與移植排斥反應、自身免疫性疾病、慢性病毒感染、腫瘤等疾病密切相關，因此探討該途徑在疾病中的功能是目前研究的熱點[9-11]。

SLE是一類以全身免疫異常而導致多器官受累為特征的疾病，病理表現為大量自身抗體產生和免疫復合物的沉積。機體產生針對核成分的自身抗體，能與許多自身成分形成免疫復合物，并在局部激活補體系統，吸引中性粒細胞浸潤，造成局部組織的炎癥損傷。已有部分研究報道發現SLE患者外周血中PBMC存在表達PD-1及PD-L1異常[12，13]，發現PD-1受體在患者體內表達下降導致機體免疫耐受功能受到影響產生大量自身抗體，而有關PD-1另一配體PD-L2在SLE患者體內的表達及生物學功能機制至今尚未清楚。

為探討PD-L2分子在SLE患者中的中的表達情況，我們通過熒光定量PCR方法及流式細胞術分析該基因在SLE患者外周血PBMC中的表達情況。研究結果發現PD-L2在SLE患者體內相對于健康人群明顯高表達，且活動期患者表達水平明顯高于穩定期。PD-1/PD-L信號通路作為經典的T細胞抑制性信號，近年來也發現其對T細胞的活化具有一定作用，因此PD-L2在自身免疫病SLE患者外周血中高表達也具備可能性，若條件允許后期工作應進一步擴大樣本含量來驗證實驗結果，此工作可能為進一步探討PD-L2分子的生物學功能，為研究SLE 發病機制以及尋找分子診斷標志和藥物靶標提供線索。

[1] Raziuddin S,Nur MA,Wabel AA,etal.Increased circulating HLA-DR+CD4+T cells in systemic lupus erythematosus:alterations associated with prednisolone therapy[J].Scand J Immunol,1990,31(2):139-145.

[2] Sharpe AH,Wherry EJ，Ahmed R,etal.The function of programmed cell death 1 and its ligands in regulating autoimmunity and infection[J].Nat Immunol,2007,8(3):239-245.

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[9] Kristjansdottir H,Steinsson K,Gunnarsson I,etal.Lower expression levels of the programmed death 1 receptor on CD4+CD25+T cells and correlation with the PD-1.3A genotype in pat ients with systemic lupus erythematosus [J].Arthritis Rheum,2010,62(6):1702-1711.

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[收稿2016-10-20 修回2016-11-08]

(編輯 倪 鵬)

Expression and clinical significance of PD-L2 molecule on monocytes of peripheral blood in systemic lupus erythematosus

WUPing-Ping,SHENDong,GUOYun-Di,ZHANGYa-Qin,FUFeng-Qing,LIUCui-Ping,SUNJing.

SuzhouVocationalHealthTechnology,SuzhouKeyLaboratoryofLaboratoryMedicine,Suzhou215009,China

Objective:To analyze PD-L2 expression on monocytes of peripheral blood cells in systemic lupus erythematosus(SLE) and it′s correlation with the degree of disease activity.Methods: Peripheral blood of 26 cases of SLE patiens and 38 cases of healthy controls were collected.Peripheral blood mononuclear cells(PBMC) were isolated and realtime PCR was carried on to analyze the PD-L2 gene expression.At the same time flow cytometry was performed to analyze the CD14 and PD-L2 expression.Results: PD-L2 was significantly up-regulated on monocytes in RA patients than in healthy controls and had correlation with the disease activity and the SLEAI score.Conclusion: These findings help to clarify the function of PD-L2,including its potential role as a biomarker for SLE.

Systemic lupus erythematosus;PD-L2;SLEDAI

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.03.020

①本文受國家自然科學基金資助項目(31170836)和江蘇省高校優秀科技創新團隊項目(自身免疫病抗體的挖掘和應用)的資助。

吳萍萍(1987年-)，女，實驗員，主要從事分子免疫和臨床免疫學方面的研究。

及指導教師：孫 靜(1981年-)，女，博士，副教授，主要從事腫瘤免疫和自身免疫病方向研究，E-mail：jsun@szhct.edu.cn

R392.11

A

1000-484X(2017)03-0414-04

②蘇州科技城醫院，蘇州2151530。

③蘇州大學附屬第一醫院臨床免疫研究所，蘇州215007。