乳酸菌代謝保護劑中糖產酸對冷凍保護的影響

崔樹茂，趙建新，陳衛，張灝

(江南大學 食品學院，江蘇 無錫，214122)

乳酸菌代謝保護劑中糖產酸對冷凍保護的影響

崔樹茂，趙建新，陳衛，張灝*

(江南大學 食品學院，江蘇 無錫，214122)

真空冷凍干燥是乳酸菌菌粉制備的關鍵技術手段，在凍干前須將菌泥與保護劑混勻并進行預凍。文中系統研究了菌泥與保護劑混勻過程中的代謝產酸情況，及產酸引起的pH值降低對預凍的影響。測定了不同菌泥添加保護劑后在室溫和冷藏溫度下的產酸速率，以及不同pH值下冷凍后菌株的存活率，分析了不同pH值條件下冷凍對菌株ATP酶、β-半乳糖苷酶、乳酸脫氫酶及細胞膜完整性和流動性的影響。結果表明，菌泥與保護劑混合后，室溫環境下的產酸速率很快，可在短時間內將菌懸液的pH值降至4.0。而pH值降低確實會對冷凍菌株的存活產生影響，pH值在降至4.0時，菌株冷凍存活率顯著降低。低pH值條件下的冷凍，會損傷ATP酶、β-半乳糖苷酶及降低細胞膜的流動性，是導致冷凍存活率降低的原因。因此，為提高真空冷凍干燥的菌株存活率，首先須控制菌泥與保護劑混合時的溫度和時間，確保預凍階段乳酸菌無損失。

乳酸菌；產酸速率；存活率；酶

乳酸菌能夠發酵糖類產酸，具有優良的發酵性能，賦予發酵食品特有的風味和品質，被廣泛地應用到發酵乳制品[1]，發酵果蔬[2]，發酵香腸[3]等。同時乳酸菌也是一種益生菌，具有改善腸胃，治療便秘，拮抗腸炎，提高免疫等功能性[4-6]。發酵食品的乳酸菌發酵劑、益生菌片劑、動物飼料乳酸菌添加劑、乳酸菌活性飲料等乳酸菌制品深受廣大消費者的喜愛。

為了便于運輸和保藏，以及后期產品的加工利用，乳酸菌的生產通常以菌粉的形式呈現。而目前最有效地獲得乳酸菌菌粉的技術是真空冷凍干燥，將菌體預凍成固體，水分在低溫和低分壓條件下揮發。但是，直接凍干乳酸菌會對菌體造成嚴重的機械損傷，并對細胞膜、酶等造成破壞，殺死細胞[7]。因此，凍干保護劑的使用是提高乳酸菌凍干存活率的主要手段。蛋白質和糖類是主要的保護劑，因其能夠在冷凍過程形成無定形結構，減少細胞損傷，是提高凍干存活率的先決條件；且糖類能夠通過氫鍵替代穩定脂質膜和蛋白[8]。脫脂乳、海藻糖、蔗糖是應用最廣泛的凍干保護劑。

但是，脫脂乳中的乳糖、海藻糖和蔗糖均能被乳酸菌利用產生有機酸。酸能夠以未解離的分子形式與細胞膜的磷脂高度互溶，從而通過被動擴散進入細胞內部[9-11]，造成膜電位的耗散，細胞質酸化及細胞內酸根離子積累，對胞內關鍵酶和細胞膜造成損傷，從而對菌體產生毒害作用[12]。因此在凍干前，保護劑中的糖有可能被乳酸菌代謝產酸，引起菌懸液pH值的降低，從而造成菌體在預凍時即產生損傷。

本研究的目的是探討凍干前不同乳酸菌在含糖類保護劑中的產酸規律，探討酸對菌株冷凍存活的影響，為提高乳酸菌的凍干存活率，以及凍干前的準備工作時提出指導方案。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)CCFM 8661，干酪乳桿菌(Lactobacilluscasei)CCFM 30，鼠李糖乳桿菌(Lactobacillusrhamnosus)CCFM1107，江南大學食品生物技術中心保藏。

1.1.2 試劑

脫脂乳，上海光明乳業股份有限公司；海藻糖(純度≥98%)，日本林原；蔗糖，上海國藥集團；MRS培養基，青島海博生物技術有限公司。

1.2 儀器與設備

GRP-9160型隔水式恒溫培養箱，上海森信實驗儀器有限公司；RCBIOS10型冷凍離心機，賽默飛世爾科技公司；FE-20型pH計，梅特勒-托利多集團；SCIENTZ-48型高通量均質機，浙江寧波新芝科技有限公司；F-7000型熒光分光光度計，日本日立公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 乳酸菌的活化與培養

從甘油保菌管內吸取 200μL乳酸菌菌液，接種到5mLMRS液體培養基中，在各自的最適溫度(植物乳桿菌和鼠李糖乳桿菌的最適溫度是37 ℃，干酪乳桿菌的最適溫度是42 ℃)條件下活化培養18～24h，重復上述操作1次得到活化菌液。然后以體積分數5%接種到MRS液體培養基中，置于最適溫度培養。

1.3.2 乳酸菌菌泥的收集

乳酸菌生長至穩定期后，在4℃條件下以6 000～8 000g的離心力離心10min。棄上清液，菌泥分別用10g/L的無菌蛋白胨水溶液(pH7.0)，9g/L的無菌生理鹽水(pH7.0)和0.01mol/L的無菌磷酸鹽緩沖液(phosphatebuffersaline，PBS，pH7.0)洗滌2次。不同溶液洗滌得到菌泥添加與菌泥等質量的無菌生理鹽水，振蕩，充分混勻菌體，形成的菌懸液用于后續實驗，以未洗滌的菌泥作為對照。

1.3.3 保護劑的配制

稱取一定質量的脫脂乳，完全溶解于純化水中，配制一定濃度的脫脂乳溶液，105 ℃滅菌10min；然后稱取一定質量的蔗糖和海藻糖，分別配制成適宜濃度的蔗糖和海藻糖溶液，115 ℃高溫滅菌20min。滅菌后將脫脂乳溶液和糖溶液按一定比例混合，使其與菌泥混合后，各保護劑成分滿足以下濃度：脫脂乳 120g/L，海藻糖 20g/L，蔗糖 20g/L。所有保護劑溶液均在無菌環境下調整pH值至pH7.0。

1.3.4 保護劑溶液中pH值與含酸量的對應曲線

取10mL上述已配制好的保護劑溶液添加不同量的乳酸，測定其pH值，以乳酸濃度為橫坐標，pH值為縱坐標，繪制曲線。

1.3.5 乳酸菌在不同溫度下的產酸速率

不同保護劑溶液中分別添加不同量的菌泥，除了滿足上述各保護劑成分的濃度，使植物乳桿菌、干酪乳桿菌和鼠李糖乳桿菌的菌泥終濃度分別為1、2、4g/10mL。將菌懸液立即放入冰水(0℃)和室溫[(23±2)℃]環境下，每10min取樣，測定菌懸液的pH值和總酸濃度。以時間為橫坐標，不同質量菌泥在不同時間的產酸量為縱坐標，線性擬合得斜率為不同質量菌泥單位時間的產酸量；再以菌泥質量為橫坐標，不同質量菌泥單位時間的產酸量為縱坐標，線性擬合得斜率為乳酸菌單位質量單位時間的產酸量，即為單位質量的產酸速率。

pH值的測定：FE-20型型酸度計直接測定。

可滴定總酸度(乳酸)：直接酸堿滴定法，以乳酸計。

1.3.6 乳酸菌在不同pH值的冷凍存活

按1.3.5的菌泥終濃度將乳酸菌菌泥與保護劑溶液混勻后，調節pH值為pH7.0，然后在室溫環境下靜置，在pH值分別降至pH7.0、6.0、5.0、4.0時取樣測定菌株的存活率，其余樣品立即放入液氮中冷凍。冷凍4h后解凍，測定不同pH條件下冷凍后菌懸液的活菌濃度。計數采用平板菌落計數法。

式中：NA，不同pH值條件下冷凍前后的活菌濃度，CFU/mL；NB，冷凍前pH值為7.0時的活菌濃度，CFU/mL。

1.3.7 無細胞提取物的制備

冷凍后的樣品在室溫條件下解凍后離心，上清液用于胞外β-半乳糖苷酶和乳酸脫氫酶的測定。菌泥用無菌蒸餾水洗滌2次，然后用無菌蒸餾水重懸至冷凍前體積。以體積比1∶1.5添加玻璃珠(直徑0.1 mm)，在高通量均質機中研磨1 min，冰浴5 min，循環10次后離心，上清液用于測定總蛋白(蛋白測定采用上海碧云天P0011型BCA試劑盒測定)、ATP酶、胞內β-半乳糖苷酶和乳酸脫氫酶。

1.3.8 ATP酶的測定

ATP酶采用南京建成的A016-1型的ATP酶試劑盒按照說明書測定。酶活定義：每分鐘每克蛋白質分解ATP產生1 μmol無機磷的量為1個ATP酶活力單位。即1 U= 1μmolPi/(g·min)。

1.3.9 β-半乳糖苷酶的測定

β-半乳糖苷酶能夠催化分解鄰硝基苯-β-D-半乳糖苷(o-nitrophenyl-β-d-galactoside，oNPG)生成鄰硝基苯(o-nitrophenyl，oNP)和半乳糖，該酶的測定采用BHOWMIK描述的方法[13]。酶活定義：每分鐘每克蛋白質分解oNPG生成1 μmoloNP的量為1個β-半乳糖苷酶活力單位。即1 U= 1μmoloNP/(g·min)。

1.3.10 乳酸脫氫酶的測定

乳酸脫氫酶能夠將丙酮酸還原成乳酸，在此過程中降低還原型輔酶(reduced form of nicotinamide-adenine dinucleotid，NADH)在340 nm處的吸收。該酶的測定按照BERGMEYER和BERNT在1974年提出的經典方法進行[14]。酶活定義：每分鐘每克蛋白質降低1個吸收值，為1個乳酸脫氫酶活力單位。即1 U= 1 μE/(g·min)。

1.3.11 細胞膜流動性的測定

熒光各異性被用來描述細胞膜的流動性，其測定按照LOUESDON描述的方法進行[15]。熒光偏振(P)、各向異性(r)和微黏度(η)用來評價膜流動性的高低，他們根據LI的方法進行估算[16]。P，r，η越高表示膜的流動性越低。

1.3.12 數據統計與分析

實驗中不同組(>3)之間的顯著性差異通過SPSS 16.0軟件進行ANOVA判斷(Tukey’s檢驗)，P<0.05則認為差異顯著。

2 結果與分析

2.1 不同溶液洗滌對產酸速率的影響

乳酸菌在培養至穩定期時，胞內會積累大量的有機酸，如果不洗滌菌泥，添加保護劑后菌泥中的酸會使菌懸液的pH值降低。經測定，植物乳桿菌CCFM8610、干酪乳桿菌CCFM30及鼠李糖乳桿菌CCFM1107的濕菌泥含酸量分別為：0.217 mmol/g，0.159 mmol/g和0.152 mmol/g。圖1顯示，10 mL保護劑溶液中添加2 g以上的濕菌泥即會使菌懸液的pH值降至pH 5.5以下。因此，離心收集后的濕菌泥需要中性溶液進行洗滌，去除胞內殘留的乳酸。

圖1 保護劑溶液中pH值與乳酸含量的對應曲線Fig.1 The corresponding curves of pH and lactic acid content in the solution of protective agent

中性的生理鹽水、PBS(pH 7.0，0.01 mol/L)水及10 g/L的蛋白胨水溶液被廣泛地用于菌泥的洗滌，均能達到去除菌泥中酸殘留的效果。表1展示了不同溶液洗滌后菌泥的產酸速率，以未洗滌的菌泥為對照。結果表明，不同溶液洗滌的菌泥產酸速率與未洗滌的菌泥產酸速率無顯著差異，洗滌以及洗滌溶液并不會對菌泥產酸速率產生影響。生理鹽水成本低，配制簡單，因此后續試驗均采用中性的生理鹽水作為菌泥的洗滌劑。

表1 菌泥經不同溶液洗滌后在不同溫度下的產酸速率 單位：mmol/(g·min)

2.2 不同溫度對產酸速率的影響

乳酸菌代謝保護劑中糖產酸是一系列的酶促反應過程，酶的作用受到溫度的影響。從表1可以看出，在室溫環境下乳酸菌的產酸速率明顯高于冷藏溫度。且在室溫環境時，不同的乳酸菌產酸速率不同，植物乳桿菌產酸最快，其次是干酪乳桿菌，鼠李糖乳桿菌產酸速率低于其他2株菌。在冷藏溫度時，酶系反應基本被抑制，3株乳酸菌的產酸速率均很低，且無明顯差異。

在乳酸菌的凍干菌粉生產過程中，菌泥洗滌后通常在室溫環境下添加保護劑，振蕩或攪拌混勻后，將菌體與保護劑充分混勻后移至凍干機進行預凍。從添加保護劑至溫度降至樣品凍結，這一過程通常需要1～2 h，甚至更長。結合表1和圖1可知，10 mL保護劑溶液中添加2 g濕菌泥，30 min即可將菌懸液的pH值降至pH 4.0左右。

2.3 產酸引起的pH值降低對冷凍存活率的影響

室溫條件下，菌泥會快速代謝保護劑中的糖類產酸，使菌懸液的pH值降低。雖然菌懸液中菌的存活率并沒有伴隨著pH值的降低而降低(數據未列出)，但是pH值的降低卻對冷凍后的存活率產生影響。圖2顯示，3株乳酸菌在pH值降到pH4.0時，冷凍后的存活率顯著地降低。pH值高于pH5.0時，冷凍后的存活率沒有顯著變化。因此，為了確保后續凍干的存活率，菌泥與保護劑混合過程中，要避免pH值的過度降低?？刂凭嗯c保護劑的混合溫度是必要的，使其盡可能地保持低溫，且混勻時間盡可能短，確保菌株不因產酸而在預凍過程中即產生損傷。

圖2 pH值對冷凍存活率的影響Fig.2 Effect of pH on survival rate of Lactobacillus during freezing注：標有不同字母表示酶活在不同pH具有顯著性差異，P<0.05

2.4 產酸引起的pH值降低對冷凍細胞ATP酶的影響

ATP酶是乳酸菌細胞膜上維持細胞正常生理功能的重要酶系。Na+K+-ATP酶鑲嵌在細胞膜脂質雙分子層中，能夠催化ATP水解供能，驅動Na+和 K+于細胞膜兩側的對向運輸，維持著細胞膜兩側的膜電位、調節細胞滲透壓，為營養物質的吸收提供動力等方面起著重要作用[17]。Ca2+Mg2+-ATP酶是乳酸菌調節細胞Ca2+和Mg2+的濃度的另一種重要的膜酶。從圖3和圖4可以看出，pH值對冷凍后ATP酶活的影響與存活率一致，在pH值降至5.0以后，Na+K+-ATP酶和Ca2+Mg2+-ATP酶均出現顯著的降低。說明pH值的降低，加重冷凍對乳酸菌ATP酶的損傷，ATP酶的破壞是導致存活率降低的原因之一。

圖3 冷凍過程中pH值對乳酸菌Na+K+-ATP酶的影響Fig.3 Effect of pH on Na+K+-ATP of Lactobacillus during freezing注：標有不同字母表示酶活在不同pH具有顯著性差異，P<0.05。

圖4 冷凍過程中pH值對乳酸菌Ca2+Mg2+-ATP酶的影響Fig.4 Effect of pH on Ca2+Mg2+-ATP of Lactobacillus during freezing注：標有不同字母表示酶活在不同pH具有顯著性差異，P<0.05

2.5 產酸引起的pH值降低對冷凍細胞β-半乳糖苷酶的影響

β-半乳糖苷酶是乳酸菌分解乳糖的重要酶，該酶的活性直接影響乳酸菌的代謝能力。圖5顯示，干酪乳桿菌CCFM 30和鼠李糖乳桿菌CCFM 1107在pH值降至pH4.0時，冷凍后β-半乳糖苷酶的活性顯著降低。而植物乳桿菌CCFM 8610在pH值降至pH6.0時，冷凍后β-半乳糖苷酶的活性即顯著降低，但此時存活率并未受影響；在pH值降至pH4.0時，β-半乳糖苷酶的活性出現更顯著的降低。說明pH值的降低，會加重冷凍對乳酸菌β-半乳糖苷酶的損傷，該酶活性降低至一定程度后，會影響菌株的存活。

圖5 冷凍過程中pH值對乳酸菌β-半乳糖苷酶的影響Fig.5 Effect of pH on β-galactosidase of Lactobacillus during freezing注：標有不同字母表示酶活在不同pH具有顯著性差異，P<0.05

2.6 產酸引起的pH值降低對冷凍細胞乳酸脫氫酶的影響

乳酸脫氫酶是糖酵解途徑的關鍵酶，在該途徑的最后一步將丙酮酸還原成乳酸，該酶活力大小直接影響菌株的代謝能力，更會影響菌株的存活。圖6顯示，伴隨著pH值的降低，乳酸脫氫酶在冷凍后酶活升高，且在pH值降至pH 5.0以下時，乳酸脫氫酶酶活顯著上升。此現象歸因于乳酸菌遇到酸脅迫時的自我保護機制[18-19]。此結果表明pH值的降低不會導致冷凍對乳酸菌乳酸脫氫酶的破壞，在低pH值時冷凍存活率的降低與乳酸脫氫酶沒有關系。

圖6 冷凍過程中pH值對乳酸菌乳酸脫氫酶的影響Fig.6 Effect of pH on LDH of Lactobacillus during freezing(注：標有不同字母表示酶活在不同pH具有顯著性差異，P<0.05)

2.7 產酸引起的pH值降低對冷凍細胞膜完整性和流動性的影響

β-半乳糖苷酶和乳酸脫氫酶均是胞內酶，只有膜的完整性遭到破壞時兩種酶才會泄漏到胞外。在該實驗中，任何條件下的胞外液體均未檢測到兩種酶的存在。說明膜的完整性良好，即使pH值降低，冷凍亦未對乳酸菌的細胞膜產生破壞。

但是膜的流動性卻因pH值的降低而產生影響，表2中可以看出，3株乳酸菌在pH值降至pH 4.0時，冷凍后細胞膜的熒光偏振(P)、各向異性(r)和微黏度(η)均顯著升高，表明膜的流動性降低。細胞膜流動性的降低是乳酸菌在凍干過程存活率降低的主要因素之一[16]。結果表明，pH值的降低導致冷凍對細胞膜的流動性產生破壞，從而影響了菌株的冷凍存活率。

表2 pH值對細胞膜熒光偏振、各向異性及微黏度的影響

注：a,b表示數值間具有顯著性差異，p<0.05。

3 結論

(1)乳酸菌添加凍干保護劑后，室溫環境下可代謝保護劑中糖類產酸，2 g/10 mL的菌泥濃度，可使菌懸液的pH值在30 min內降至pH 4.0左右。

(2)中性的生理鹽水、PBS(pH 7.0，0.01mol/L)水及10 g/L的蛋白胨水溶液洗滌菌泥后，菌的產酸速率沒有區別。

(3)pH值降至pH 4.0時，冷凍后乳酸菌的存活率顯著降低。

(4)低pH值條件下乳酸菌冷凍存活率的降低歸因于Na+K+-ATP酶，Ca2+Mg2+-ATP酶，β-半乳糖苷酶的損傷以及細胞膜流動性的降低，與乳酸脫氫酶和細胞膜的完整性無關。

(5)為了提高乳酸菌的凍干存活率，須確保預凍階段菌的存活，因此須控制菌泥與保護劑混合時的溫度及時間，避免乳酸菌代謝保護劑中糖大量產酸。

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Effect of acids produced by metabolizing carbohydrate of protectants on viability ofLactobacillusduring freezing

CUI Shu-mao, ZHAO Jian-xin, CHEN Wei, ZHANG Hao*

(School of Food Science and Technology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China)

Vacuum freeze-drying is the key technology for preparingLactobacilluspowder. It is significant for cell pastes to be mixed with protectants before freeze drying. In this paper, the acid production rate in the mixing processing of cell pastes and protectants, and the effect of pH decrease caused by acid production on viability ofLactobacillusduring freezing, were studied. The rate of acid production at room temperature and cold storage temperature, as well as the survival rate ofLactobacillusat different pH value after freezing, were determined. In addition, ATPase, β-galactosidase, lactate dehydrogenase (LDH), and cell membrane integrity and fluidity ofLactobacillusafter freezing at different pH were measured. The results showed that the rate of acid production at room temperature was very fast, which could reduce the pH of the bacterial suspension to 4.0 in a short time after mixed with protectants. The low pH indeed decreased the survival rate of frozen strains, which was significantly reduced at pH 4.0. The damage of ATP enzyme and β-galactosidase, and the reduction of the fluidity of cell membrane caused by freezing under low pH could result in the low survival rate. Therefore, the temperature and time for mixing cell pastes with protectants must be controlled to avoid loss of lactic acid bacteria in pre-freezing stage in order to improve the survival rate during vacuum freeze drying.

Lactobacillus; acid production rate; survival rate; enzyme

博士研究生(張灝教授為通訊作者,E-mail:zhanghao@jiangnan.edu.cn)。

十二五國家科技支撐項目：發酵乳制品乳酸菌菌種與發酵劑的研究與開發

2016-06-08，改回日期：2016-08-04

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201703004