耐鎘乳酸菌對重金屬鎘的吸附機制

邵鑫，孫凱，熊婧，余翀，吳希陽

(暨南大學 理工學院，食品科學與工程系，廣東 廣州，510632)

耐鎘乳酸菌對重金屬鎘的吸附機制

邵鑫，孫凱，熊婧，余翀，吳希陽*

(暨南大學 理工學院，食品科學與工程系，廣東 廣州，510632)

乳酸菌；鎘耐受性；吸附機制

在所有重金屬污染問題中，鎘因其生物毒性大、移動性強成為最受關注的對象之一[1]。而通過食物攝入是鎘進入人體的最主要渠道(90%)[2-4]。當鎘被人體吸收后，自然排泄是一個非常緩慢的過程，因此，使用解毒劑驅排體內蓄積的鎘是預防及治療鎘中毒的優選措施[5]。但這些藥物治療方法單一，副作用多、安全性差、價格昂貴、療程較長。螯合物還會結合除鎘之外的其他金屬，甚至體內的一些必需微量元素，若長時間服用會影響機體健康[6-7]。

由于農產品/食品重金屬鎘污染問題日趨嚴重，尋找能夠移除食品及人體中的重金屬鎘的方法已然迫在眉睫。雖然已發現了許多能夠吸附重金屬鎘的微生物，但它們通常是環境工業微生物或條件致病菌，無法應用于食品行業[8]。

乳酸菌具有吸附重金屬鎘的能力，不僅能夠在環境中對鎘進行吸附，且在腸道內也能夠發揮吸附作用[9-13]。環境和腸道微生態在長期的低劑量鎘的壓力下，可能會產生對鎘的耐受性，因此通過篩選能夠分離出耐鎘乳酸菌成為潛在的鎘吸附劑和解毒劑。而乳酸菌作為食品安全級別的益生菌，在食品中應用廣泛，使用食品安全級的乳酸菌作為重金屬鎘吸附劑添加到含鎘食品中移除食品中的鎘；或作為膳食補充劑攝入體內，通過糞便將重金屬排出體外，防止鎘在體內進行積累是新的研究思路[14]。

現有的研究報道局限于乳酸菌對鎘的吸附力研究，缺乏對細菌細胞本身機理的了解。本研究結合紅外光譜、掃描電鏡方法，從細胞的微觀結構及形態變化對乳酸菌吸附重金屬鎘的機理進行了探索。

1 實驗材料

1.1 實驗菌株

研究采用的乳酸桿菌菌株如表1所示，為本實驗室收藏的標準菌株，其中的干酪乳桿菌(LAB-111)分離自益力多乳酸菌飲品。

1.2 培養基及相關試劑

MRS培養基(250 g)、MRS肉湯(250 g)，北京陸橋技術有限責任公司；戊二醛(500 mL)、無水乙醇(500 mL)、醋酸異戊酯(500 mL)、多聚甲醛(500 mL)、Cd(NO3)2·4 H2O(分析純)，天津市大茂化學試劑廠。

1.3 儀器與設備

真空冷凍干燥機(FD-1-50)，北京博醫康實驗儀器有限公司；傅里葉變換紅外吸收光譜儀(EQUINOX55)，德國Bruker公司；掃描電子顯微鏡(XL-30ESEM)、透射電子顯微鏡(TECNAI-10)，荷蘭飛利浦公司；火焰原子分光光度計(AA-7000)，日本島津公司。

2 實驗方法

2.1 鎘儲備液的配制

稱取27.44 g Cd(NO3)2·4 H2O溶于100 mL無菌蒸餾水中，配制成100 g/L的母液，經0.45 μm濾膜過濾后，儲存于4 ℃冰箱中。

2.2 實驗菌株的最低抑菌濃度(MIC)測定

將表1中17株實驗室保藏的標準乳酸桿菌接種于MRS平板中，于37 ℃二氧化碳培養箱中培養48 h，挑取單菌落懸浮于1 mL滅菌純水中，取1環劃線于不同Cd2+濃度的平板上培養48～72 h后觀察生長情況并記錄各菌株的MIC。

2.3 目標菌體收集及吸附

將表1中LAB-5、LAB-9、LAB-28、LAB-53四株對鎘具有高耐受性的乳酸桿菌(MIC≥4.0 g/L)的實驗菌株和1株在鎘耐受性實驗中MIC最低(10 mg/L)的乳酸菌LAB-54接種于MRS培養基上，置于37 ℃二氧化碳培養箱中培養48 h，挑取單菌落接種于MRS肉湯中，37 ℃培養24 h后，2 795 g離心10 min收集菌體，用滅菌純水洗滌3次，懸浮成100 g/L(濕重)的菌懸液。

取100 g/L的鎘儲備液用無菌水配制成濃度為100 mg/L的Cd2+水溶液，加入100 g/L的菌懸液，使菌體終濃度為5 g/L，置于37 ℃搖床培養120 min。于2 795 g離心10 min使吸附后的菌體沉淀，用無菌水洗滌3次，轉入已稱重的EP管中，80 ℃烘箱干燥至恒重，測干重。上清液用0.45 μm濾膜過濾，存于4 ℃冰箱中待測。共設3批平行實驗。

取100 g/L的鎘儲備液用無菌水配制成濃度為0、25、300 mg/L的Cd2+水溶液，分別加入LAB-5和LAB-54 100 g/L的菌懸液，使菌體終濃度為5 g/L，置于37 ℃搖床培養120 min。4 024.8 g離心10 min使吸附后的菌體沉淀，用純水洗滌3次后再次離心使菌體沉淀。

2.4 標準曲線的制作

取鎘標準溶液(100 ppm)配制成濃度為0、0.5、1、1.5、2、2.5 ppm的標準溶液，注入火焰原子化器中測其吸光度值，以標準曲線工作液的濃度為橫坐標，相應的吸光度值為縱坐標，繪制標準曲線并求出吸光度值與濃度關系的一元線性回歸方程。

2.5 儀器工作參數設定及樣品的測定

火焰原子吸收分光光度計測定條件如下：波長228.8 nm，狹縫0.15～0.2 nm，燈電流6～7 mA，空氣流量5 L/min，背景校正為氚燈。

于測定標準曲線工作液相同的實驗條件下，吸取吸附后的上清液樣品注入火焰原子化器，測其吸光度值。代入標準系列的一元線性回歸方程中求樣品中鎘的濃度，平行測定2次。若測定結果超出標準曲線范圍，用1%硝酸溶液稀釋至范圍內后再行測定。按公式(1)計算鎘的生物吸附率[15]：

(1)

其中，Qr，吸附率，%；Co，金屬離子初始濃度，mg/L；Ce，吸附后重金屬離子最終濃度，mg/L；m，菌株的干重，g；V，溶液總體積，L。

2.6 紅外光譜及掃描電鏡分析

將吸附后的菌體沉淀在-80 ℃冷凍過夜后，冷凍干燥至恒重，取干燥菌粉于瑪瑙研缽中與溴化鉀以1∶50的質量比在紅外燈下研磨混勻后壓片，成形后置于傅里葉變換紅外吸收光譜儀的檢測臺上，對鎘結合的細胞進行紅外光譜分析。

以2.5%戊二醛懸浮吸附后的菌體沉淀，于4℃冰箱中固定過夜，4 024.8 g離心5 min，去上清；用0.1 mol/L，pH 7.2的PBS清洗菌體3次，每次10 min；用30%、50%、70%、90%的乙醇梯度脫水各10 min，再用無水乙醇(100%)脫水2次，每次10 min，然后用醋酸異戊酯懸浮菌體2次，每次8 min；將菌懸液在蓋玻片上滴樣，待醋酸異戊酯揮發后，將蓋玻片置于臨界點干燥機的樣品槽內進行干燥處理；將干燥好的樣品粘貼在銅臺上，用離子鍍膜機在樣品表面噴鍍1層金屬導電膜，然后將樣品置于掃描電鏡樣品觀察室中，選用3 kV加速電壓對菌體的表面微觀特征進行觀察。

3 結果與討論

3.1 MIC測定結果

對17株乳酸桿菌進行MIC測定的結果顯示，共有4株菌MIC≥4.0 g/L(23.50%)，11株菌(64.70%)的MIC低于2.0 g/L，其中LAB-54的MIC最低為10 mg/L，另外2株菌的MIC在2.0～2.5 g/L，如表1所示。

表1 實驗菌株的耐鎘MIC實驗

3.2 標準曲線的制作

鎘標準溶液的濃度分別為0、0.05、0.1、0.15、0.2、0.25 mg/L，以Cd2+濃度為橫坐標，吸光度值為縱坐標，繪制的標準曲線回歸方程為：y=1.003 7x+0.007 2，擬合度R2=0.999 2。

3.3 不同乳酸菌對鎘的吸附率

本研究通過原子吸收分光光度法測定經乳酸菌在含Cd2+溶液中進行生物吸附后的Cd2+含量，可知細菌胞內或胞外吸附后溶液中的重金屬含量的改變，從而測定出不同的菌株對鎘的吸附性能。

圖1顯示了4株對鎘具有高耐受性能以及1株對鎘具有低耐受性能的乳酸菌在Cd2+濃度為100 mg/L的溶液中對Cd2+的吸附率。

圖1 耐鎘乳酸菌的鎘吸附率Fig.1 Cd removal efficiency of Cd-resistant LAB strains

可以看出，4株高耐受乳酸菌具有一定的Cd2+吸附能力，而LAB-54作為低耐受對照菌株的吸附率最低(6.80%)，LAB-9、LAB-28、LAB-53 3株菌的吸附率分別為：27.20%、28.00%、29.10%。LAB-5的吸附率最高, 達到了31.40%。ZHAI等在篩選高吸附性能的菌株時將篩選標準定為當吸附率高于18% 則認為該菌株具有高吸附性能[16]。若以此為依據，則本研究所篩選的4株乳酸菌皆被認為是高吸附菌株。

3.4 紅外光譜

圖2 在3種Cd2+濃度(0、25、300 mg/L)下LAB-5的FTIR圖Fig.2 FTIR photographs of LAB-5 biomass under three different Cd2+ concentrations (0, 25, 300 mg/L)

圖3 在3種Cd2+濃度(0、25、300 mg/L)下LAB-54的FTIR圖Fig.3 FTIR photographs of LAB-54 biomass under three different Cd2+ concentrations (0, 25, 300 mg/L)

吸附前后主要吸收峰的變化量如表2所示，以吸附前為對照，若吸附后為負值，則該吸收峰向低波數移動，代表紅移，若吸附后為正值，則該吸收峰向高波數移動，代表藍移。

表2 吸附重金屬鎘前后細胞主要吸收峰的變化

LAB-54的鎘耐受能力非常弱，MIC為10 mg/L，選取該菌目的是作為對照組觀察低耐受菌株與鎘的結合機制。在25 mg/L的Cd2+處理后，只有原位于3 428.81 cm-1和2 931.27 cm-1的峰位置發生偏移，強度明顯減弱，其他位置的吸收峰變化均不明顯，推測此時Cd2+與細胞結合位點主要在細胞壁的脂肪酸上。在300 mg/L的Cd2+處理后，各吸收峰均出現了不同程度的強度減弱，說明該菌與羥基、羧基、磷酸基、酰胺基、烴基官能團共同作用。

3.5 掃描電鏡分析

掃描電鏡能從不同角度對樣品的表面微觀形態觀察，對在空白對照(0 mg/L)、低濃度(25 mg/L)和高濃度(300 mg/L)的Cd2+進行吸附后的2株乳酸菌進行掃描，以細胞的變化來分析鎘對細胞的影響，并推測作用機制。

圖4為LAB-5在3種不同Cd2+濃度處理后的細胞形態。LAB-5為革蘭氏陽性長桿菌，吸附前(圖4-A)細胞形態完整無缺，表面光滑飽滿，細胞與細胞之間似乎黏連著一層光滑的外膜。在25 mg/L的Cd2+吸附后(圖4-B)的細胞明顯出現變形、扭曲、凹陷、皺褶，表面變得粗糙，細胞之間覆蓋著的光滑外膜消失，胞外還黏連著一些絲狀物質。在300 mg/L的Cd2+吸附后(圖4-C)的細胞損傷更為嚴重，明顯觀察到細胞壁穿孔現象，表面粗糙不堪，有些細胞的胞內物質完全流失，呈扁平狀的空殼塌陷在蓋玻片上，絲狀黏連物明顯增多。結合紅外光譜(圖2)來看，在低濃度下，細胞已開始大規模壞死，推測Cd2+同時與細胞壁上的S層蛋白、多聚糖、胞內分泌的多糖、酰胺、蛋白質結合。在高濃度下，細胞壞死加重，推測是由于Cd2+濃度過高，胞內外滲透壓差異巨大，更多高毒性的鎘進入了細胞內部，胞內物質迅速并且大量地從孔中溢出，使鎘的吸附量從低濃度的7 mg/g增加到21 mg/g(干重)。

圖4 在3種Cd2+濃度下LAB-5的SEM圖(A-0、B-25 mg/L、C-300 mg/L)Fig.4 SEM photographs of LAB-5 biomass under three different Cd2+ concentrations (A-0, B-25, C-300 mg/L)

圖5為LAB-54在3種不同Cd2+濃度處理后的細胞形態。LAB-54為革蘭氏陽性短桿菌，由于該菌的MIC只有10 mg/L，因此其在25和300 mg/L的Cd2+都無法生長，推測是Cd2+的毒性導致細胞死亡。該菌未對其吸附性能進行探討，但由于其MIC非常低，失活菌體對鎘的吸附能力應較強。吸附前(圖5-A)細胞為存活狀態，完整無缺，表面飽滿。在25 mg/L的Cd2+吸附后(圖5-B)的細胞壁形態完全改變，表面粗糙，內陷、破裂、穿孔的程度十分嚴重，胞外附著許多細小顆粒。在300 mg/L的Cd2+吸附后(5C)的細胞胞內物質完全流失，呈扁平狀的空殼塌陷在蓋玻片上，有些細胞堆積在一起完全變形，甚至無法觀察到細胞原來的形態。

圖5 在3種Cd2+濃度下LAB-54的SEM圖(A-0、B-25 mg/L、C-300 mg/L)Fig.5 SEM photographs of LAB-54 biomass under three different Cd2+ concentrations (A-0, B-25 mg/L, C-300 mg/L)

對以上2株菌進行掃描電鏡分析，可以初步推測：LAB-5在低濃度下細胞幾乎無死亡，此時為胞外吸附，在高濃度下細胞壞死較多，表明Cd2+已通過胞內運輸進入細胞內部，胞外吸附和胞內擴散共同作用；LAB-54則在低濃度下可能同時存在2種機制共同作用。因此，乳酸菌與鎘的作用機制包括胞外吸附及胞內擴散，而高耐受細菌可能存在一些耐受機制能夠阻止Cd2+進入胞內，或將已進入胞內的Cd2+排出。

4 結論

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The cadmium removal mechanism of lactobacillus strains

SHAO Xin, SUN Kai, XIONG Jing, YU Chong, WU Xi-Yang*

(Department of Food Science & Engineering,Jinan University, Guangzhou 510632, China)

lactic acid bacteria (LAB); cadmium (Cd) resistance; removal mechanism

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201703009

碩士研究生(吳希陽教授為通訊作者，E-mail:kentwu@hotmail.com)。

廣東省科技計劃項目(2015A030401042)；廣東省自然科學基金項目(S2012010008479)

2016-05-12，改回日期：2016-11-02