小麥蛋白胨促進乳酸菌增殖的研究

孫文敬，辛曉亞，郭文杰，崔鳳杰*，方頌平，朱本國，馮岳琴，夏統前

1(江蘇大學 食品與生物工程學院，江蘇 鎮江，212013)2(安徽瑞福祥食品有限公司，安徽 亳州，236800)

小麥蛋白胨促進乳酸菌增殖的研究

孫文敬1，辛曉亞1，郭文杰2，崔鳳杰1*，方頌平2，朱本國2，馮岳琴1，夏統前1

1(江蘇大學 食品與生物工程學院，江蘇 鎮江，212013)2(安徽瑞福祥食品有限公司，安徽 亳州，236800)

對比分析了制備的小麥蛋白胨(WP)與市售蛋白胨的理化性質及其部分(全部)替代發酵氮源對乳酸菌增殖的影響。結果表明，該小麥蛋白胨理化性質已基本達到市售蛋白胨的質量標準要求。小麥蛋白胨所含的非游離氨基酸大分子量(Mw)肽段(>500 u)的比例高于其他市售植物蛋白胨，但其有利于乳酸乳球菌、干酪乳桿菌、羅伊氏乳桿菌和植物乳桿菌等增殖，活菌數分別達到9.64×108CFU/mL，2.30×109CFU/mL，1.60×109CFU/mL和1.14×109CFU/mL。對比發酵前后肽段分子質量分布發現，干酪乳桿菌可能主要吸收和/或降解小麥蛋白胨中分子量大于180 u的肽段為氮源供其生長。

小麥蛋白胨；氮源；乳酸菌；培養基；增殖

蛋白胨是一種以蛋白質為底物、經蛋白酶水解得到的水溶性混合物，主要是由胨、肽和氨基酸組成[1]。作為微生物培養基的基礎成分，蛋白胨可以提供大部分微生物生長和發育所需要的氮源[2]，已廣泛用于發酵工業和醫藥工業，也作為功能性食品和化妝品的配料應用于食品或化妝品等生產[3]。蛋白胨從來源上可分為動物源、植物源和微生物蛋白胨。傳統發酵工業主要采用酪蛋白為來源的蛋白胨進行日常生產。但動物源蛋白胨缺點明顯，如存在潛在的病毒污染、成分不明確和不利于產物純化等。因此，疫苗、抗體和干擾素等生物制藥領域對動物源蛋白胨的使用安全顧慮逐漸增加[4]。而植物和微生物源蛋白胨具有無污染和高安全性等優點，現已成為生物制藥領域的優先選擇。

目前，國內外諸多研究集中在利用酶法水解玉米蛋白、大豆蛋白、菜籽餅粕等植物蛋白制備抗氧化肽、降壓肽和抗菌肽等功能肽。而開發和利用植物蛋白生產發酵氮源及其性能評價的系統研究仍相對較少。如李潤嬌等將花生粕酶解制備花生蛋白胨，并用于乳酸菌的培養[5]；莫芬等酶解小麥面筋蛋白得到了不同水解度產物，其具有顯著影響釀酒酵母的增殖及風味物質組成的作用[6]；而白鳳翎等發現，分子質量小于5 ku的大豆蛋白水解物具有明顯的促進酸奶乳酸菌增殖效果[7]。國外已有較多將植物蛋白水解液應用于蛋白藥物生產和疫苗制備等方面的研究。如KIM等采用大豆蛋白水解物、小麥蛋白水解物及酵母提取物三者的復合物培養懸浮型重組CHO 細胞，以促進抗體合成[8]。FALLAH研究發現酶解鰱魚加工副產物制備的魚蛋白胨可作為有效氮源用于培養金黃色葡萄球菌[9]。BENEDINI等證實，將大豆蛋白胨替代獸疫鏈球菌的傳統腦心浸液(Brain-Heart Infusion)和羊血培養基，菌體生長良好，未造成菌體生長損傷和代謝偏轉[10]。

我國擁有豐富的小麥蛋白資源。作為小麥淀粉加工副產品，小麥蛋白具有較高的營養價值，但由于其溶解性較差而限制了其在食品發酵工業中的應用。近年來，開發小麥蛋白新用途，實現其高值化應用是研究的熱點之一。目前國內外有關小麥蛋白的研究多集中在其活性多肽的酶法制備和功能評價等方面。本課題組前期已較為系統地開展了酶法水解小麥蛋白生產抗氧化肽的研究，包括篩選蛋白酶、優化其水解條件以及解析小麥蛋白肽結構等[11-13]。然而，有關小麥蛋白水解物作為氮源應用于微生物菌體生長和產物合成的研究鮮有報道[6]。本項目在前期研究的基礎上，擬對比分析制備的小麥蛋白胨與市售蛋白胨的理化性質，考察研究小麥蛋白胨(部分)替代市售蛋白胨等氮源培養乳酸菌的性能，進而通過分析其肽段分布和氨基酸組成，探討小麥蛋白胨促進乳酸菌增殖的可能機制，為擴大小麥蛋白胨應用領域提供了一定的理論指導。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 小麥蛋白胨

小麥蛋白胨WP：小麥蛋白(蛋白含量73.37%，安徽瑞福祥食品有限公司由經中性蛋白酶(1.0×106U/g，南寧東恒華道生物科技有限公司)和胰蛋白酶(2.5×106U/g，上海生工科技有限公司)酶解后[12]，經板框過濾、噴霧干燥制成的淡黃色粉末狀樣品。

小麥蛋白胨E1(ORG E1)購自法國Organotechnie公司；Oxoid NO.1植物蛋白胨購自英國Oxoid公司；Fluka 93452小麥蛋白胨購自Sigma公司；麥麩蛋白胨Hypep 4601N購自美國Kerry 公司。

牛肉膏、酵母膏、胰蛋白胨、葡萄糖、乙酸鈉、檸檬酸氫二銨、吐溫-80、K2HPO4·3H2O、MgSO4·7H2O 和MnSO4·H2O等購自國藥集團化學試劑有限公司。

1.1.2 菌株來源

乳酸乳球菌乳酸亞種(Lactococcuslactissubsp.lactis)CICC 6242，購自中國工業微生物菌種保藏管理中心；羅伊氏乳桿菌(Lactobacillusreuteri)和植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)，由加拿大西安大略大學和加拿大益生菌研發中心GREGOR Reid教授提供。干酪乳桿菌(Lactobacilluscasei)，由本實驗室采用常規乳酸菌分離方法獲得并保存。

1.2 培養基

改良MRS液體培養基 (g/L)：胰蛋白胨 10，牛肉膏 10，酵母膏5，K2HPO4·3H2O2，乙酸鈉5，葡萄糖 20，吐溫80 1 mL，檸檬酸氫二銨2，MgSO4·7H2O 0.58，MnSO4·H2O 0.25，pH6.5，121 ℃滅菌20 min。

MRS固體培養基：在液體培養基的基礎上加入15%的瓊脂。

部分替代發酵培養基 (g/L)：將改良MRS培養基中胰蛋白胨替換成制備的小麥蛋白胨或市售蛋白胨，其他組成及含量均不變。

完全替代發酵培養基 (g/L)：將改良MRS培養基中胰蛋白胨、牛肉膏和酵母膏全部替換成制備的小麥蛋白胨或市售蛋白胨，添加量為20 g/L，其他組成及含量均不變。

1.3 乳酸菌培養

將各乳酸菌菌株接入MRS培養基于37℃下活化12 h后，以3% (v/v)接種量接入裝有 60 mL種子培養基的100 mL三角瓶中，37℃靜置培養12 h后制成發酵種子液。

分裝部分替代或完全替代發酵培養基60 mL/100 mL三角瓶，121 ℃滅菌20 min后，接入3% (v/v) 種子液，37 ℃靜置培養12 h后，分別測度乳酸菌增殖性能(OD600nm值，活菌數和菌體干重)。

1.4 乳酸菌增殖性能測定

OD600nm測定：以空白培養基調零，分光光度計于600 nm下測定發酵液OD值。

活菌計數：采用平板菌落計數法測定發酵液中乳酸菌的活菌數，發酵終止后，取1mL發酵液，以無菌水稀釋成10-1～10-7等7個梯度，選取適宜梯度0.1 mL涂布于平板上，每個樣品重復3次，37 ℃培養48 h，選取菌落數在 30～300 之間的平板進行菌落計數，活菌數用CFU/mL 表示。

菌體干重：取25 mL發酵液，轉速8 000 r/min離心10 min，取沉淀烘干至恒重后測菌體干重。

1.5 蛋白胨樣品理化性質測定

準確稱取各蛋白胨樣品，配制成質量濃度為20 g/L的溶液，觀察其溶解性、溶液外觀色澤等，并測定其pH值；采用GB 5009.5—2010凱氏定氮法測定其總氮含量，并計算其蛋白含量；采用DNS法測定其總糖含量。

1.6 蛋白胨樣品中氨基酸種類和含量的測定

取一定量蛋白胨樣品于試管中，分別加入10 mL 6 moL/L的HCl溶液，置110 ℃水解24 h后過濾定容至50 mL；取濾液0.5 mL蒸干，加入1 mL樣品稀釋液充分溶解，用氨基酸自動分析儀測定。

1.7 蛋白胨樣品中肽分子量分布的測定[6]

采用高效液相色譜法測定不同來源蛋白胨中肽段分子量分布。色譜條件為：(a)色譜柱：TSKgel 2000 SWXL 300 mm×7.8 mm；柱溫：30 ℃；(b)流動相：乙腈/水/三氟乙酸，45/55/0.1(v/v)；流速：0.5 mL/min；進樣量：20 μL；洗脫時間：20 min；(c)檢測波長：UV 220nm。

1.8 數據分析

實驗設計為每樣3個重復。結果采用SPSS10.0軟件進行處理，為3個重復的平均值±標準偏差。采用one way ANOVA進行試驗數據的方差分析，P<0.05 表明結果具有顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 不同來源蛋白胨理化性質分析

基于前期研究結果，以小麥蛋白為原料，采用中性蛋白酶和胰蛋白酶水解，酶解液經板框過濾取清夜，噴霧干燥制成淡黃色粉末狀的小麥蛋白胨樣品。表1匯總了制備的小麥蛋白胨WP與其他不同來源蛋白胨的理化性質。

由表1可知，小麥蛋白胨WP中蛋白含量為74.56%，高于Oxoid(73.76%)和Fluka 93452(67.02%)。小麥蛋白胨WP還含有少量糖(10.60%)，其溶解性能良好，溶液(2%，w/v)外觀為淡黃色，澄清透明。由此可知，該小麥蛋白胨WP的理化性質已基本達到市售蛋白胨的質量標準要求。

表1 不同來源蛋白胨常規理化性質

2.2 不同來源蛋白胨中氨基酸組成分析

不同來源蛋白胨氨基酸組成及含量分析見表2，結果表明，小麥蛋白胨WP的氨基酸種類豐富，與其他幾種市售試劑級蛋白胨一樣，含有17種氨基酸，總量達 71.7%，僅低于胰蛋白胨(85.9%)和Hypep 4601N(79.4%)。

表2 不同來源蛋白胨中氨基酸組成分析

注：*酸水解過程中谷氨酰胺被變成谷氨酸。

表3歸納了6種蛋白胨樣品中含量較高的6種氨基酸種類和比例。各蛋白胨均含有較高量的谷氨酸/谷氨酰胺、脯氨酸和精氨酸；苯丙氨酸、異亮氨酸、絲氨酸的含量也相對較高。在植物源蛋白胨中，谷氨酸的含量均最高，如小麥蛋白胨WP、Fluka 93452、ORG E1和Hypep 4601N中谷氨酸含量分別達到為25.3%、23.0%、25.3%和28.7%，明顯高于胰蛋白胨。一般認為，氨基酸形式的氮源有利于提高微生物的生長和發酵產率[14]。然而，白鳳翎等研究發現，保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌等乳酸菌以大豆蛋白水解物為氮源的生長效果明顯優于僅添加天冬酰胺、谷氨酰胺、谷氨酸等20種氨基酸培養基，可能主要是寡肽而非游離氨基酸顯著影響乳酸菌的生長[7]。本研究制備的小麥蛋白胨富含谷氨酸/谷氨酰胺、脯氨酸和異亮氨酸等，有望為乳酸菌、酵母菌和絲狀真菌等菌體生長和產物合成提供有效氮源。

表3 不同蛋白胨中含量較高的氨基酸

2.3 小麥蛋白胨作為替代氮源對乳酸菌生長性能的影響

為評價制備的小麥蛋白胨WP作為發酵氮源的可行性，將其替代乳酸菌生長培養基(MRS)的蛋白胨，對比考察其對羅伊氏乳桿菌、保加利亞乳桿菌、植物乳桿菌及干酪乳桿菌等乳酸菌生長性能的影響。結果如圖1所示。

(a)乳酸乳球菌; (b)干酪乳桿菌;(c)羅伊氏乳桿菌;(d)植物乳桿菌(a)Lactococcus lactis subsp lactis(b)Lactobacillus casei(c)Lactobacillus reuteri(d)Lactobacillus plantarum圖1 不同蛋白胨對乳酸菌生長量的影響Fig.1 Effect ofpeptones sourced from various companies on the growth of lactic acid bacteria

由圖1可知，乳酸乳球菌可利用6種蛋白胨進行生長(圖1(a))，但不同來源的蛋白胨對其增殖影響顯著。其中，小麥蛋白胨WP替代MRS中蛋白胨發酵12 h后，乳酸乳球菌生長性能達到最大，其OD600nm值、菌體干重和活菌數分別為1.950、1.340 g/L和9.64×108CFU/mL。其次為ORG E1和Fluka 93452。當以小麥蛋白胨WP為替代氮源用于培養干酪乳桿菌、羅伊氏乳桿菌和植物乳桿菌，經12 h發酵后，各菌株生長性能均優于原MRS培養基。與其他市售植物蛋白胨相比，小麥蛋白胨WP實驗組的OD600nm值和菌體干重均為最高；但其活菌數略低于其他市售植物蛋白胨，約為1.14×109～2.30×109CFU/mL(圖1(b-d))。

2.4 乳酸菌對肽段吸收情況的研究

為研究乳酸菌吸收和利用測試蛋白胨中肽段或氨基酸的模式和可能的機理，將小麥蛋白胨WP和其他市售蛋白胨全部替代MRS培養基中氮源(蛋白胨、酵母膏和牛肉膏)進行培養干酪乳桿菌，對比分析發酵12 h前后各發酵醪中肽段分子量分布及其含量。結果如圖2和表4所示。

由圖2可知，當各蛋白胨樣品完全替代MRS培養基中氮源時，干酪乳桿菌的菌體OD600nm值均在1.0左右，顯著低于MRS培養基或部分氮源替代培養基，表明原MRS培養基中酵母膏和牛肉膏等氮源對其生長也起到促進作用。當小麥蛋白胨WP完全替代MRS培養基中的氮源時，干酪乳酸菌表現出良好的生長性能，其OD600nm值、菌體干重和活菌數分別為0.915，0.948 g/L，和2.31×109CFU/mL，高于Oxoid NO.1和Hypep 4601N組。

圖2 不同蛋白胨對干酪乳桿菌生長量的影響Fig.2 Effect ofpeptones sourced from various companies on the growth of Lactobacillus casei

蛋白質經過水解會得到大小不同的多肽片段。蛋白質原料、蛋白酶的種類以及酶解條件均會顯著影響原料的水解效率和產物品質。表4為不同來源蛋白胨經干酪乳桿菌發酵12 h前后肽段的分子量分布。由表4可知，當發酵0 h時，5種植物源蛋白胨中，Fluka 93452、ORG 、Oxoid No.1和Hypep 4601N的肽段分子量均較低，分子量>5 000 u的肽段含量很低，幾乎為0，小于1 000 u的肽段比例為95%以上，而小于500 u的肽段比例為均高于85%，特別是分子量小于180 u的游離氨基酸含量均高于51%，為小麥蛋白胨中游離氨基酸含量的2倍，這表明市售的國外品牌的植物蛋白胨產品的分子量均較低。小麥蛋白胨WP中大分子量肽段含量相對其他蛋白胨較高，其中，分子量>5 000 u的肽含量為0.96%，分子量在3 000～5 000 u的肽含量也略高，是其他植物源蛋白胨的3～10倍，小于3 000 u的小分子肽段，即分子量為500～1 000 u、1 000～2 000 u及2 000～3 000 u的肽段含量均明顯高于其他幾種植物源蛋白胨。

微生物會選擇性吸收蛋白胨中不同分子量(Mw)肽段促進其生長和發酵。由表4可以看出，經干酪乳桿菌發酵12 h后，小麥蛋白胨WP中分子量大于180 u以上的肽段相對含量均有不同程度的降低，而分子量低于180 u的游離氨基酸相對含量則有較大幅度的增加，提示干酪乳桿菌可能主要吸收和/或降解小麥蛋白胨WP中分子量大于180 u的肽段為氮源供其生長。

干酪乳桿菌利用4種市售植物蛋白胨中肽段的模式與小麥蛋白胨基本一致。一般認為，微生物會選擇性吸收蛋白胨中不同分子量的肽段促進其生長和發酵。如MO等發現，釀酒酵母在發酵過程中，幾乎不吸收利用分子量大于10 ku 和 5～10 ku的肽段(利用率小于7%)，而主要利用50%以上的分子量小于1 ku的肽段[15]。在本研究中，雖然制備的小麥蛋白胨WP中分子量小于500 u的肽段含量較低，但并未影響乳酸菌的增殖，這可能與微生物的種類和發酵產物有關。如劉定杭等采用不同酶解條件制備出含有不同分子量肽段的牛骨蛋白胨，其對副干酪乳桿菌生長和發酵產物抑菌效果影響不大，而含低分子量肽段的蛋白胨樣品可提高低溫蛋白酶的酶活[16]。ZHANG等也發現分子量小于3 ku的酪蛋白活性肽對乳酸菌有明顯促生長活性，并能顯著減少酸奶發酵時間，提高成品酸奶中乳酸菌的數量[17]。而乳酸菌主要是依賴于降解蛋白質和多肽來滿足細胞合成代謝對氨基酸的需求。如MCKAY等證實，乳酸乳球菌必須依靠自身蛋白水解系統降解乳中酪蛋白來維持其生長需要[18]。該蛋白水解系統主要包括將大分子酪蛋白水解成多肽的胞外蛋白酶、將多肽轉運進入細胞的轉運系統和將多肽水解形成游離氨基酸的肽酶[19]。如，乳酸乳球菌的寡肽轉運系統Opp主要轉運含有4～11個氨基酸殘基的肽段(分子量約為500～1 000 u)[20]，而在小麥蛋白胨WP培養基中，分子量為500～1 000 u的肽段含量為19.04%，因此，乳酸菌完全可以將其轉運至胞內進一步水解和利用，實現其增殖。

3 結論

本項目以小麥蛋白為原料制備得到的淡黃色粉末狀小麥蛋白胨WP，其蛋白含量為74.56%，溶解性能良好，溶液外觀為淡黃色，澄清透亮。完全(部分)替代氮源發酵實驗結果表明，小麥蛋白胨WP可作為氮源提供干酪乳桿菌等乳酸菌生長必需的寡肽和氨基酸，且菌體主要利用WP所含的分子量大于180 u的肽段實現其快速增殖。綜上，制備的小麥蛋白胨具有良好的理化品質，并可為乳酸菌生長提供充分的氮源。后續將通過改進生產工藝進一步降低大分子肽段的比例，深入探討其促進乳酸菌等微生物增殖和產物合成的相關機理，為開發高品質小麥蛋白胨提供一定的研究基礎。

表4 不同培養基中的肽的分子量分布

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Promoting growth of four lactic acid bacteria by using prepared wheat peptones

SUN Wen-jing1, XIN Xiao-ya1, GUO Wen-jie2, CUI Feng-jie1*, FANG Song-ping2, ZHU Ben-guo2, FENG Yue-qin1, XIA Tong-qian1

1(School of Food and Biological Engineering, Jiangsu University, Zhenjiang 212013, China) 2(Anhui Ruifuxiang Food Co. Ltd.,Bozhou 234800,China)

The physical and chemical features of prepared wheat peptone (WP) and its effect on lactic acid bacteria (LABs) growth were investigated and compared with other commercial peptones. Results showed that the prepared WP met the requirements of peptone quality standards and contained higher percentages of high-molecular-weight peptides (>500 u) than those in other commercial peptones. WP promoted the growth of four LABs includingLactococcuslactissubsp lactis,Lactobacillusreuteri,Lactobacilluscasei, andLactobacillusplantarumwith the highest OD600nmvalues and the microbial viable counts reached to 9.64×108CFU/mL, 2.30×109CFU/mL, 1.60×109CFU/mL, 1.14×109CFU/mL, respectively. Further studies indicated thatL.caseiseemed to preferably utilize high-molecular-weight peptides (>180 u) in WP as the nitrogen source for cell growth.

wheat peptone; nitrogen source; lactic acid bacteria; media; cell growth

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201703012

研究員(崔鳳杰為通訊作者,E-mail:fengjiecui@163.com)。

安徽瑞福祥食品有限公司科技項目; 江蘇省高等學校大學生實踐創新訓練計劃項目(201610299126H) 、 江蘇大學"青年骨干教師培養工程"青年學術帶頭人培育計劃資助.

2016-09-22，改回日期：2016-10-20