桑葚果酒專用酵母的分離、篩選及鑒定

曹倩雯，鄭飛云，趙佳迪，張明芳，李佳泰，王金晶*，李崎

1(江南大學, 工業生物技術教育部重點實驗室，江蘇 無錫，214122) 2(江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫，214122)

桑葚果酒專用酵母的分離、篩選及鑒定

曹倩雯1,2，鄭飛云1,2，趙佳迪1,2，張明芳1,2，李佳泰1,2，王金晶1,2*，李崎1,2

1(江南大學, 工業生物技術教育部重點實驗室，江蘇 無錫，214122) 2(江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫，214122)

以市售桑葚為分離源，從其自然發酵醪液中分離得到42株酵母，通過杜氏小管發酵法初篩，產酒精能力復篩，耐SO2能力及香氣活力值(odor activity value,OAV)三級篩選，最終得到最優菌株JNB-14。采用18S rDNA 序列鑒定，確定其與1株釀酒酵母Saccharomycescerevisiae(序列ID: AFD50639.1)有最高匹配度，為100%。

桑葚果酒；酵母；篩選；鑒定

桑葚又名桑果，是?？坡淙~灌木或小喬木的果實。據醫藥史書記載，桑葚味甘性寒，歸心、肝、腎經, 具有滋陰補血、生津止渴、補肝益腎等功效[1]。桑葚果肉多汁，色澤艷麗并且富含多種生物活性物質如維生素、胡蘿卜素、黃酮醇、花青素、酚酸等酚類化合物[2]，是釀酒的極佳原料。

目前桑葚酒在市場上并不多見，一般都由一些小企業、小作坊采用葡萄酒通用酵母釀造而成。工業上尚無釀造桑葚酒的專用酵母，而在果酒釀造的過程中，酵母起著非常重要的作用，直接影響到所釀果酒的口感、風味以及理化性質，決定了果酒品質的優劣[3]，因此篩選適于桑葚酒發酵的酵母菌株非常重要。本實驗從市售桑葚果發酵液中分離篩選適合釀造桑葚酒的優良酵母，得到了1株發酵性能優良、香氣馥郁、風味優良酵母菌并對其進行了菌株鑒定。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與試劑

桑葚果、白砂糖，市售；酵母基因組DNA提取試劑盒，天根生化科技(北京)有限公司；蛋白胨、瓊脂粉、酵母粉，Thermo Fisher Oxoid；偏重亞硫酸鉀(K2S2O5)，國藥集團化學試劑有限公司。

富集培養基(含抗菌素的YPD液體培養基)：葡萄糖20 g/L，蛋白胨20 g/L，酵母粉10 g/L，青霉素1 g/L[4]。

YPD培養基平板：葡萄糖20 g/L，蛋白胨20 g/L，酵母粉10 g/L，瓊脂粉20 g/L。

斜面保藏培養基(YPD固體培養基)：葡萄糖20 g/L，蛋白胨20 g/L，酵母粉10 g/L，瓊脂粉20 g/L。

1.2 儀器與設備

生化培養箱BSP-250、低溫水浴槽，上海博迅公司；阿貝折光儀，泰光有限公司；PL2002電子天平、AL204分析天平，梅特勒-托利多儀器有限公司；氣相色譜串聯質譜聯用儀，美國瓦里安(Varian)公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 菌種分離

將新鮮成熟的桑葚果榨汁，放入滅完菌的三角瓶中于28 ℃自然發酵，待三角瓶中有大量氣泡產生時，取10 mL發酵醪液接入富集培養基，28 ℃恒溫培養2～3 d，將富集好的菌懸液稀釋5個梯度，采用YPD培養基平板涂布分離，每個梯度3個平行，28 ℃倒置培養2 d。典型的酵母菌菌落表面光滑、濕潤、黏稠，質地柔軟，易挑起，多為乳白或奶油色，有酒香味[5]。據此特征從培養好的平板上選取有典型酵母形態的菌落，分別在YPD培養基平板上劃線分離，直到出現單菌落，將所得單菌落轉接到YPD斜面于4 ℃保存并進行編號命名。

1.3.2 酵母的初篩

將活化好的酵母以5%的接種量接入無菌的桑葚汁中，采用杜氏管發酵法[6]觀察各菌株的產氣速度和產氣量。根據實驗結果初步篩選出發酵能力強、發酵香氣宜人的菌株。

1.3.3 酵母的復篩

將初篩所得發酵力強且發酵氣味較好的菌株活化后按5%的接種量接入含糖22°Bx的桑葚汁中，24 ℃發酵7 d。采用蒸餾法測定每瓶發酵液的酒精度[7]，并對其進行感官品評。

1.3.4 酵母的三級篩選

1.3.4.1 酵母SO2耐受力實驗

采用杜氏管發酵法，調整桑葚汁SO2濃度為40、80、120、160 mg/L，24 ℃下發酵2 d，觀察杜氏管中起泡情況。

1.3.4.2 香氣活力值(OAV)分析風味篩菌

將復篩所得產酒精能力強且感官品評良好的菌株活化后按5%的接種量接入含糖22 °Bx的桑葚汁中，24 ℃發酵7 d。采用氣相色譜-質譜(GC-MS)分析桑葚酒的香氣成分，并對其進行感官品評。

樣品前處理萃取條件：20 mL頂空瓶中，加入8 mL桑葚酒樣品，3.0 g NaCl，在45 ℃預熱5 min，萃取60 min。萃取完成后，將萃取頭插入進樣口，解吸附5 min，進行GC-MS分析[8]。實驗以2-辛醇為內標作半定量分析。

分析條件為：GC條件：PEG-20M彈性石英毛細管柱，30 m×0.25 m×0.25 μm；載氣為高純氦氣，恒定流量為0.8 mL/min；升溫程序：從180 ℃開始，保持2 min，以3 ℃/min升溫到230 ℃，保持10 min；進樣口溫度250 ℃，出樣口溫度200 ℃；檢測電壓350 V。MS條件：EI離子源，發射電流200 μA，電子能量70 eV，掃描范圍20～550 u。

1.3.5 菌株鑒定

以2%接種量取-80 ℃甘油貯存液接種于YEPD培養基中，28 ℃、150 r/min培養24 h。取適量培養液離心1 min(12 000 r/min，4 ℃)，棄盡上清液，得到適量菌體，用酵母基因組DNA提取試劑盒提取基因組DNA。用酵母ITS通用引物對正向引物ITS1、反向引物ITS4擴增基因組DNA，反應條件為：94 ℃預變性5 min后進入以下循環：94 ℃變性45 s，55 ℃退火40 s，72 ℃延伸60 s，35個循環；72 ℃延伸10 min。PCR產物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測。產物送往生工生物工程(上海)股份有限公司測序。

1.3.6 感官品評[9]

組織經過感覺品評培訓的老師及學生對每批桑葚酒進行感官品評，結果取平均值。

2 結果與分析

2.1 菌種分離

從市售桑葚果自然發酵液中共分離出42株酵母菌，可以看出桑葚汁自然發酵過程中可以富集其生長環境中的酵母菌，且種類較多。

2.2 菌種初篩

對分離出的酵母菌進行杜氏小管發酵，發酵溫度為24 ℃。恒溫靜置發酵48 h后，有33株酵母的杜氏小管內都充滿了氣泡，并能聞到淡淡的酒香，說明這些菌株發酵能力旺盛；有31株酵母發酵氣味優良，具備桑葚酒發酵的典型香氣。其中，發酵能力強且發酵氣味愉悅的共有30株。初篩結果如表1。

表1 酵母初篩結果

注：“—”表示產氣很少不足 1/2 試管或者發酵氣味很差有酸敗味；“+”表示產氣較好，達到甚至超過 1/2 試管或者發酵無異味但香氣較淡；“++”表示產氣量充足超過2/3甚至充滿試管或者發酵氣味好、有酒香。

2.3 菌種復篩

對初篩所得的30株酵母進行三角瓶發酵，調整桑葚汁糖度為22°Bx，24 ℃發酵7 d后測定酒精度情況如表2。其中，酒精度最高的桑葚酒為11.3%，酒精度最低的桑葚酒為7.0%。感官品評結果顯示得分較高的菌株共有15株，綜合產酒精情況，最終保留12株品評結果良好且產酒精能力強的酵母。

表2 酵母產酒精能力篩選

2.4 酵母的三級篩選

2.4.1 菌株耐SO2能力篩選

果酒發酵一般會添加SO2，它可以抑制各種微生物的活動(繁殖和發酵)。各種微生物對SO2的敏感性不同，細菌最為敏感，其次是尖端酵母，而釀酒酵母耐SO2的能力較強。通常在發酵前加入適量的SO2，可減少其他微生物對釀酒酵母的影響，確保發酵順利完成。在果酒貯藏過程中，適量SO2可以抑制所有微生物的影響(包括酵母、乳酸菌和醋酸菌)，防止果酒的二次發酵和果酒的腐敗[10]。但是SO2添加太多會影響酵母的活性，使其發酵遲緩，酒體變苦，GB 2760—2014規定了SO2添加劑最大使用量(以SO2殘留量計)為0.25 g/L[11]。本實驗通過添加偏重亞硫酸鉀來調節桑葚汁中SO2的濃度，用杜氏小管發酵法進行酵母的SO2耐受性實驗。實驗結果顯示復篩所得的酵母菌表現出與葡萄酒釀酒酵母D254相當的耐SO2能力，在最大實驗添加量下都生長較旺盛，并且考慮到實際發酵時SO2濃度一般為40～80 mg/L，此輪篩選保留所有菌株。

表3 酵母對SO2耐受性篩選

注：“+++”表示產氣量充滿杜氏管；“++”表示產氣量達到甚至超過2/3杜氏管；“+”表示產氣量達到甚至超過1/2杜氏管。

2.4.2 GC-MS風味分析篩菌

某種香氣物質的絕對含量并不能反映它對酒體整體香氣的貢獻，還需要結合它在酒中的閾值來分析[12]。OAV值是一種表征揮發化合物對酒體的整體風味貢獻大小的參數。OAV值是指揮發性化合物的濃度與其閾值的比值，理論上，只有OAV值大于1的揮發性化合物才對酒體的整體風味有貢獻，并且OAV值越大其香氣貢獻越大[13]。正如FERREIRA指出，酒的特征香氣成分，其含量往往都在閾值以上(OAV>1)，并且去掉這些香氣成分之后，酒原先所具有的典型香氣也會消失[14]。因此，OAV值對確定桑葚酒中的特征香氣和重要香氣成分非常有幫助。

在桑葚酒中共檢測出近50種香氣成分，綜合OAV值分析可知，桑葚酒中的重要香氣物質(OAV>1)有：辛酸乙酯、β-大馬酮、正庚醇、異戊酸乙酯、乙酸異戊酯、己酸乙酯、芳樟醇、乙酸苯乙酯、乙醛二乙縮醛、里哪醇、辛酸和癸酸乙酯，主要呈現水果香和花香，賦予酒體怡人的香氣，對桑葚酒體有很大貢獻。酯類大部分來源于發酵過程中醇和酸的酯化反應，蒸餾過程也有部分酯的產生；貯存過程既有酯化反應，也有水解反應，主要是支鏈酯的酯化反應和高濃度的直鏈酯類的水解反應[15]。由OAV總值分析可知，相比于葡萄酒釀酒酵母D254和其他篩選所得菌株，9號菌的總OAV值最高，且其感官品評結果也最好，其他常規指標檢測均正常。綜合考慮，9號菌更適合桑葚酒的釀造，得到的酒體顏色飽滿透亮，果香馥郁，口味純正，酒體豐滿，故將其命名為JNB-14并申請專利1篇。

表4 十二種桑葚酒的各指標分析結果

2.5 菌種鑒定

2.5.1 菌種鑒定

如圖1所示，PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定結果良好。將擴增產物寄送生工基因測序，在NCBI網站上進行BLAST序列比對，發現JNB-14與1株釀酒酵母Saccharomycescerevisiae(序列ID:AFD50639.1)具有最高的18S rDNA 基因序列相似性( 100%) ，故將其鑒定為釀酒酵母。

2.5.2 生長曲線測定

測定釀酒酵母生長曲線所使用的培養基為YEPD培養基，115 ℃滅菌15 min。以1%接種量取-80 ℃甘油貯存液接種于YEPD培養基中，28 ℃培養測生長曲線，生長期每2 h取樣，穩定期每4 h取樣，紫外分光光度計測2株酵母培養液在600 nm下的吸光值，共培養72 h。

由圖2可以看出，酵母JBN-14在培養第4 h就進入了對數生長期，第16 h進入平穩期且穩定時間長。這說明該酵母的發酵能力較強。

表5 桑葚酒中揮發性成分的閾值和OAV值(僅列出OAV>1的香氣成分)

M-10kb ladder;1-樣品圖1 酵母PCR產物瓊脂糖電泳圖Fig.1 PCR products by agarose electrophoresis of yeast

圖2 酵母JNB-14生長曲線圖Fig.2 Growth curve of yeast JNB-14

3 討論

果酒加工行業面臨的一個較大的問題就是缺少專用水果品種和專用果酒釀造酵母。對于釀造產業而言，菌種是企業的命脈，選用葡萄酒釀酒酵母或者直接將野生型酵母菌投入生產會導致成品酒的質量和產量均存在一定的不足。本實驗主要目的是篩選出能在滿足桑葚酒釀造的基本要求的基礎上擁有較強發酵產香性能的酵母。一級篩選淘汰了發酵能力弱或發酵氣味不愉悅的酵母，二級篩選淘汰了產酒精能力弱的酵母，三級篩選的出發菌株均能滿足桑葚酒釀造基本要求，這就要求在篩選時通過對感官品評和發酵風味綜合評估的方法淘汰那些風味平淡、沒有典型性的酵母菌株，而選擇香氣濃郁、典型性好的菌株。果酒的關鍵香氣化合物是構成酒體香氣感官輪廓的主要因素，但由于呈香物質間存在增效作用、協同作用、抑制作用等，使得多種物質并非都能呈現各自的香氣。要確定所有揮發性成分中哪些化合物加強了桑葚酒的整體香氣，哪些掩蔽了桑葚酒的整體香氣，儀器分析仍難以做到；而大量研究結果證實，經過一定培訓且有果酒基本知識的人員組成的品評小組具有良好的穩定性，且組內成員對同一酒樣的評價具有良好的一致性。感官分析與儀器分析各自存在優勢和一定的局限性，可將二者結合，相互彌補。本實驗中OAV值可以反映酒體中各香氣成分含量及其對酒體的貢獻，通過比較OAV總值，可以很直觀地分析出酵母的產香能力；而感官品評結果可以直接反映酒體的風味協調性。結合兩者結果分析，本實驗成功從桑葚表皮分離篩選出1株發酵性能良好、發酵香氣馥郁、風味優良、OAV值高的釀酒酵母JNB-14。利用這株酵母釀造的桑葚酒香氣優雅且典型性明顯，具有較強的工業應用前景。

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The isolation , screening and identification of yeasts for mulberry wine

CAO Qian-wen1,2, ZHENG Fei-yun1,2, ZHAO Jia-di1,2, ZHANG Ming-fang1,2, LI Jia-tai1,2, WANG Jin-jing1,2*, LI Qi1,2

1(The Key Laboratory of Industrial Biotechnology, Ministry of Education, Jiangnan University, Wuxi 214122, China) 2(School of Biotechnology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China)

A total of 42 yeast strains were isolated from natural fermented mash of commercially available mulberries. Through duchenne tubular screening, alcohol yield ability test, SO2resistance ability test and odor activity value (odor activity value,OAV) screening, the optimal strain JNB-14 was obtained finally. The 18S rDNA sequence amplification was conducted for molecular biology identification of JNB-14 and it turned out to have the highest degree of match (100%) withSaccharomycescerevisiae(sequence ID: AFD50639.1).

mulberry wine; yeast; screening; identification

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201703017

碩士研究生(王金晶副教授為通訊作者,E-mail：jjwang@jiangnan.edu.cn)。

江蘇高校優勢學科建設工程資助項目(PAPD)；國家高新技術研究發展計劃(863計劃，No.2013AA102106-03)；國家自然科學基金(No.31271919，No. 31571942，No.31301539，No.31601558，& No.31601445)；江蘇省自然科學基金(BK20150159)；江蘇基礎研究資助項目(JUSRP51306A, JUSRP51402A & JUDCF13008)

2016-09-06，改回日期：2016-11-07