Krüppel樣因子5和腫瘤壞死因子受體超家族成員11a在宮頸癌組織及細胞中的表達及其作用

常凌雅，馬 冬，李 鷗，王新月，張 琪，張麗杰，閆錫釗，鄭寰宇

華北理工大學 唐山工人醫院婦二科，河北唐山 063000

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Krüppel樣因子5和腫瘤壞死因子受體超家族成員11a在宮頸癌組織及細胞中的表達及其作用

常凌雅，馬 冬，李 鷗，王新月，張 琪，張麗杰，閆錫釗，鄭寰宇

華北理工大學 唐山工人醫院婦二科，河北唐山 063000

目的 探討Krüppel樣因子5 (KLF5)和腫瘤壞死因子受體超家族成員11a(TNFRSF11a)在宮頸癌組織中的表達及對宮頸癌細胞增殖、遷移和侵襲的作用。方法 利用基因芯片篩查宮頸組織中細胞應答炎癥反應的相關基因mRNA的表達。采用實時熒光定量PCR對芯片檢測的結果進行驗證。免疫雙熒光染色檢測宮頸組織中KLF5和TNFRSF11a的共表達。在人宮頸癌HeLa細胞中，采用脂質體轉染特異性小分子干擾RNA分別敲低KLF5和TNFRSF11a的表達，構建KLF5超表達腺病毒，感染細胞過表達KLF5。Western blot檢測細胞內相關蛋白水平變化。采用雙熒光素酶報告基因檢測轉錄因子KLF5對TNFRSF11a的表達調控作用。CCK8和Transwell實驗檢測細胞增殖和遷移侵襲情況。臨床分析TNFRSF11a的mRNA表達與宮頸癌臨床病理參數的關系。結果 基因芯片結果證實宮頸鱗癌組織中基因TNFRSF11a、KLF5較正常宮頸組織表達上調(P=0.002，P=0.045)，實時熒光定量PCR結果證實與正常宮頸組織相比，宮頸上皮內瘤變(CIN) Ⅰ、CIN Ⅱ-Ⅲ、宮頸鱗癌組織中KLF5和TNFRSF11a的mRNA表達結果均上調(KLF5：F=32.79，P=0.018，P=0.014，P=0.011；TNFRSF11a：F=36.72，P=0.013，P=0.010，P=0.009)。免疫雙熒光染色結果證實與正常宮頸組織相比，CIN Ⅰ、CIN Ⅱ-Ⅲ、宮頸鱗癌組織中KLF5和TNFRSF11a的蛋白表達結果均上調(KLF5：F=42.38，P=0.014，P=0.008，P=0.002；TNFRSF11a：F=35.42，P=0.021，P=0.012，P=0.004)。體外實驗證實KLF5靶向調控TNFRSF11a的表達并促進宮頸癌細胞的增殖和遷移侵襲。臨床分析顯示TNFRSF11a的mRNA表達與腫瘤病理分級、臨床分期、肌層浸潤深度、淋巴結轉移正相關(P<0.05)。結論 KLF5和TNFRSF11a與宮頸癌相關；KLF5通過上調TNFRSF11a的表達促進宮頸癌細胞的增殖和侵襲、轉移。

宮頸癌；Krüppel樣因子5；腫瘤壞死因子受體超家族成員11a；增殖；侵襲

ActaAcadMedSin，2017,39(2)：196-205

近年來宮頸癌發病年輕化的趨勢較為明顯，放化療及靶向新藥物治療預后仍有約30%的患者出現局部復發或遠處轉移[1]。由于宮頸癌的發病機制仍不明確，因此，適當的個體化宮頸癌治療仍難以實現。Krüppel樣因子5(Krüppel like factors 5，KLF5)作為重要的轉錄因子可以通過調控靶基因影響細胞的增殖、遷移侵襲等生物學功能[2]。已有報道KLF5在宮頸癌的發生發展過程中發揮促進作用[3]，而其在宮頸癌中低表達也曾被報道[4]，所以KLF5對宮頸癌的作用仍需探討。腫瘤壞死因子受體超家族(tumor necrosis factor receptor superfamily，TNFRSF)11a是TNFRSF的成員之一，其在骨轉移較多發生的乳腺癌[5]、前列腺癌細胞[6]中被發現高表達，且作為癌癥骨轉移患者的一個不良預后因素[5]。同時研究顯示腫瘤壞死因子超家族(tumor necrosis factor superfamily，TNFSF)11/TNFRSF11a可促進宮頸癌細胞HeLa和SiHa的增殖[7]，提示TNFRSF11a具有促進宮頸癌發生發展的潛在可能性。然而KLF5和TNFRSF11a在宮頸癌組織中的表達和其相互關系是否影響腫瘤的發生發展尚不清楚。因此，本研究旨在通過臨床分析KLF5和TNFRSF11a在宮頸癌變中的表達及采用體外實驗研究KLF5是否通過調控TNFRSF11a影響宮頸癌細胞生物學功能，從而為宮頸癌的臨床診斷、治療及預后提供分子靶點。

材料和方法

芯片組織標本 用于分析基因差異表達的3例宮頸鱗癌組織及3例正常宮頸組織均來自唐山市工人醫院，采用簡單隨機抽樣的抽簽法選取，分別將標本組織提取總RNA送公司用于基因芯片檢測。

宮頸組織標本 選取2013年3月至2015年6月唐山市工人醫院行宮頸活檢及手術治療病例，臨床資料完整，且術前未接受放化療治療，共147例，其中正常宮頸43例、宮頸上皮內瘤變(cervical intraepithelial neoplasia，CIN)66例(其中CIN Ⅰ21例、CIN Ⅱ-Ⅲ 45例)、宮頸鱗癌(cervical squamous cell carcinoma，CSCC)38例?；颊吣挲g、初潮年齡、性伴侶數、妊娠次數、流產次數、抽煙及飲酒情況差異均無統計學意義(P>0.05)。所有研究標本的收集均獲得患者知情同意，并經兩位病理醫師確診診斷。根據WHO細胞分化標準，高、中分化者24例、低分化者14例；國際婦產科聯盟分期，Ⅰ期26例、Ⅱ期12例。有淋巴結轉移11例、無淋巴結轉移者27例。

基因芯片檢測 Trizol試劑提取樣本總RNA，采用NanoDrop- 1000定量及電泳檢測RNA完整性。應用Agilent Scanner G2505C掃描Affymetrix表達譜芯片結果，原始數據用Command Console Software 4.0讀取，質控合格的數據歸一化處理采用NimbleScan軟件，用RMA算法進行計算。差異基因篩選標準為變化幅度≥2為上調基因，變化幅度<-2為下調基因。采用GO分析差異表達基因的生物學功能。實驗由上?？党缮镉邢挢熑喂就瓿?。

體外細胞培養 HeLa人宮頸癌細胞株由河北醫科大學附屬第四醫院腫瘤研究所饋贈，分別以含10%胎牛血清RPMI 1640培養基、5%二氧化碳、37℃恒溫培養箱中常規培養，細胞密度4×104/L，取對數生長期細胞用于以下實驗。293A細胞由河北醫科大學附屬第四醫院腫瘤研究所饋贈，高糖伯克改良伊格爾培養基+10%胎牛血清，5%二氧化碳，37℃恒溫培養箱中培養。

免疫雙熒光法檢測KLF5和TNFRSF11a的表達 所有宮頸組織標本均經4%多聚甲醛液固定，固定好的組織經乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，切片厚4 μm。以上標本采用間接免疫熒光法，按說明書操作。KLF5兔抗人多克隆抗體，TNFRSF11a鼠抗人多克隆抗體，Fluorescein標記的熒光二抗和Rhodamine標記的熒光二抗(KPL公司)及4’，6-二脒基- 2-苯基吲哚(Sigma公司)核染色。激光共聚焦熒光顯微鏡下觀察攝片，Image Pro-Plus 6.0(Media Cybernetics，Inc.，U.S.A)圖像分析軟件分析KLF5和TNFRSF11a表達的熒光強度。

實時熒光定量PCR檢測mRNA表達 按Trizol試劑盒說明書提取組織或細胞總RNA，以RNA為模板，采用PCR逆轉錄試劑盒(美國Invitrogen 公司)逆轉錄合成cDNA后，采用 實時熒光定量PCR反應試劑盒(美國Invitrogen 公司)進行實時熒光定量PCR反應，內參為β-actin。應用 Primer Premier 軟件，分別設計上下游引物：KLF5：正向引物：5’-AAGCTACAATACGCTTGGCCT- 3’；反向引物：5’-TTGGAGAG- ACTGGGATTGC- 3’；TNFRSF11a：正向引物：5’-CC- GCCTAAGTGGAGATAAGGAAA- 3’；反向引物：5’-AAGTTCATCACCTGCCCGCT- 3’；腎連蛋白：正向引物：5’-GTGGCCCAGGCAAATAGTGT- 3’；反向引物：5’-GTTGGCACACAGGCTGACA- 3’；細胞因子信號轉導抑制因子5：正向引物：5’-CTCCTTCGGCCTTCACCTAC- 3’；反向引物：5’-ATAAAATCGTGACCAATAGCAGGC- 3’；睫狀神經營養因子受體：正向引物：5’-GCGCCCGAGAAAGGACTCTA- 3’；反向引物：5’-AGCAGCCATCTCTTCACCAC- 3’；C-X-C趨化因子配體13：正向引物：5’-ACTCTGCTAATGAGCCTGGAC- 3’；反向引物：5’-CCTTGGACTGGAGAGAGGCT- 3’；磷脂酶C β脂：正向引物：5’-GATGAGCCCAGATGGCCG- 3’；反向引物：5’-AGTTGAGTCATCATCCCACTTGA- 3’；白細胞介素6信號傳感器：正向引物：5’-CCTGTGACTTTCAAGGGAACTT- 3’；反向引物：5’-GATTCAGGGCTTCCTGGTCC- 3’；β-actin：正向引物：5’-GAAAGCCTGCCGGTGACTAA- 3’；反向引物：5’-AGGAAAAGCATCACCCGGAG- 3’。擴增反應條件：95℃、2 min，95℃、15 s，72℃、35 s，40個循環。以公式2-△△Ct(Ct為循環閾值)計算目的基因mRNA的表達水平，每組實驗重復3次。

體外細胞實驗 河北醫科大學生物化學研究室饋贈綠色熒光蛋白表達的腺病毒和KLF5表達的腺病毒。293A細胞接種于培養皿，細胞達60%～80%匯合時，加入病毒原液，24 h后觀察熒光表達，3～4 d后約90%細胞表達熒光時離心收集細胞，經反復凍融3次后，高速離心收集上清液得到較高滴度的重組腺病毒，-80℃保存備用。KLF5基因過表達采用腺病毒感染，KLF5和TNFRSF11a基因敲低采用Lipo2000脂質體介導靶向短發夾RNA轉染HeLa細胞。其中KLF5特異性小分子干擾RNA為：正向引物：5’-C- GAUUACCCUGGUUGCACA- 3’，反向引物：5’-AAG- CUCACCUGAGGACUCA- 3’；TNFRSF11a特異性小分子干擾RNA：正向引物：5’-GATCCCCGCGCTGACAG- CTAATTTG- 3’，反向引物：5’-AGCTTAAAAAGCGCTGACAGCTAATTT- 3’。非特異性小分子干擾RNA購自江蘇吉瑪公司。按照Lipo2000說明書操作轉染細胞。

Western blot方法檢測細胞蛋白表達 兔抗KLF5多克隆抗體和鼠抗TNFRSF11a抗體(Sigma 公司)；辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG、羊抗鼠IgG二抗，增強型化學發光底物試劑盒(江蘇碧云天生物技術研究所)；細胞裂解法提取細胞總蛋白，采用BCA法檢測總蛋白含量，10% SDS-PAGE凝膠電泳，硝酸纖維膜轉印，5%脫脂奶粉封閉，一抗(1∶100稀釋)4℃過夜孵育、洗膜、二抗(1∶2000稀釋)避光室溫孵育，洗膜，顯影。β-actin為內參蛋白。通過Image J圖像分析軟件分析條帶灰度值，以目標蛋白條帶灰度值/內參條帶灰度值表示目的基因相對蛋白表達水平，每組實驗重復3次。

雙熒光素酶報告基因分析 克隆TNFRSF11a近端啟動子+1～2000 bp序列并插入到熒光素酶報告基因質粒(pGL3-basic)中。在24孔板中培養293A細胞，當細胞密度為60%～80%時進行轉染。分別轉染TNFRSF11a啟動子報告基因質粒0.6 μg及內參照pRL-β-actin 5 ng。每組設3個復孔。每孔轉染后繼續培養24 h，細胞分別感染綠色熒光蛋白腺病毒和KLF5腺病毒4 h。轉染48 h后應用雙熒光素報告基因檢測熒光素酶活性。

CCK- 8法檢測細胞生長活性 HeLa細胞接種于96孔板，每孔100 μl細胞懸液，待細胞貼壁后進行分組培養，每組設3個復孔，分別培養24、48、72、96 h后，每孔加入10 μl CCK- 8溶液，設置1個無細胞孔調零，培養箱內繼續孵育4 h，酶標儀在450 nm處測定光密度值，繪制細胞生長曲線。

Transwell檢測細胞的侵襲能力 將存活的HeLa細胞種入已鋪好Matrigel基質膠的Transwell小室上層，行無血清培養36 h，吸去孔中培養基，用PBS洗2次，4%多聚甲醛固定30 min，稍微晾干后用結晶紫染色20 min，用棉簽擦去上室面上的細胞，PBS洗3次，取出小室，晾干，鏡下拍照。100倍顯微鏡下計數上下左右中5個隨機不同視野的穿膜細胞數，取平均值。實驗重復3次。細胞遷移實驗：方法同侵襲實驗，但Transwell上室不用基質膠處理，觀察時間為24 h。

統計學處理 應用SPSS 19.0軟件進行數據分析，計數資料采用百分率表示，組間對比采用χ2檢驗；計量資料均經正態性及方差齊性檢驗，以均數±標準差表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用q檢驗，采用Spearman秩相關分析，P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

宮頸組織基因芯片結果分析及驗證 在質量保證的前提下，采用包括22 000個人類基因的 oligo 芯片。GO分析結果顯示，與正常組織相比，宮頸鱗癌組織中細胞應答炎癥反應的相關基因上調表達(圖1、表1)。采用實時熒光定量PCR實驗對芯片檢測結果中的8個上調基因進行驗證，結果顯示宮頸癌組織中KLF5、Npnt、Socs5、TNFRSF11a、Cxcll3、Il6st較正常組織表達顯著上調(t=5.230，P=0.035；t=6.343，P=0.024；t=7.231，P=0.019；t=17.460，P=0.003；t=8.548，P=0.013；t=11.998，P=0.007)，Cntfr、Plcb1表達有上調趨勢，但差異無統計學意義(t=3.721，P=0.065；t=4.109，P=0.054)(圖2)。

宮頸組織中KLF5和TNFRSF11a的mRNA表達水平及相關性 與正常對照組相比，KLF5和TNFRSF11a的mRNA在CINⅠ組、CINⅡ-Ⅲ組和CSCC組中的表達水平逐漸升高，差異有統計學意義(KLF5：F=32.79，P=0.018，P=0.014，P=0.011；TNFRSF11a：F=36.72，P=0.013，P=0.010，P=0.009)，與CINⅡ-Ⅲ組相比，CSCC組中KLF5和TNFRSF11a的mRNA表達水平增高，差異有統計學意義(KLF5：q=2.792，P=0.018；TNFRSF11a：q=2.801，P=0.012)(圖3)。采用Spearman法檢驗不同宮頸組織中KLF5與TNFRSF11a的mRNA表達的相關性，在CINⅠ組中KLF5與TNFRSF11a的mRNA表達無相關性；在CINⅡ-Ⅲ組中KLF5與TNFRSF11a的mRNA表達呈正相關(r=0.360，P=0.015)；在宮頸癌組織中KLF5與TNFRSF11a的mRNA表達呈正相關(r=0.353，P=0.030)。

Adipoq：脂聯素；KLF5：Krüppel樣因子5；Npnt：腎連蛋白；Socs5：細胞因子信號轉導抑制因子5；TNFRSF11a：腫瘤壞死因子受體超家族成員11a；Cntfr：睫狀神經營養因子受體；Cxcl13：C-X-C趨化因子配體13；Plcb1：磷脂酶Cβ1；Il6st：白細胞介素6信號傳感器

Adipoq：adiponectin；KLF5：Krüppel like factors 5；Npnt：neph- ronectin；Socs5：suppressor of cytokine signaling 5；TNFRSF11a：tumor necrosis factor receptor superfamily member 11a；Cntfr：ciliary neurotrophic factor receptor；Cxcl13：C-X-C motif chemokine ligand 13；Plcb1：phospholipase C beta 1；Il6st：interleukin 6 signal transducer

A. 正常宮頸組織；B. 宮頸癌組織

A. normal cervical tissues；B. cervical squamous carcinomas tissues

圖 1 宮頸組織基因芯片測序圖

Fig 1 Heatmap of genes involved in cervical tissues

表 1 正常宮頸組織及宮頸癌組織基因表達差異分析

CSCC：宮頸鱗癌；與正常對照組比較，aP=0.035；bP=0.024；cP=0.019；dP=0.003；eP=0.013；fP=0.007

CSCC：cervical squamous cell carcinoma；aP=0.035，bP=0.024，cP=0.019，dP=0.003，eP=0.013，fP=0.007 compared with control group

圖 2 基因實時熒光定量PCR檢測結果

Fig 2 Result of gene chip in reverse transcription quantitative real-time polymerase chain reaction

宮頸組織中KLF5和TNFRSF11a的表達 4’，6-二脒基- 2-苯基吲哚免疫熒光染色試劑盒檢測不同人宮頸組織中的KLF5和TNFRSF11a的表達顯示，KLF5和TNFRSF11a共表達于宮頸組織，隨著宮頸癌變的進展，KLF5和TNFRSF11a表達增高，熒光強度增加，差異有統計學意義(KLF5：F=42.38，P=0.014，P=0.008，P=0.002；TNFRSF11a：F=35.42，P=0.021，P=0.012，P=0.004)(圖4)。

CINⅠ：宮頸上皮內瘤變Ⅰ級；CINⅡ-Ⅲ：宮頸上皮內瘤變Ⅱ-Ⅲ級；CSCC：宮頸鱗癌；與正常對照組相比，aP=0.018，bP=0.013，cP=0.014，dP=0.010，eP=0.011，fP=0.009；與CINⅡ-Ⅲ組相比，gP=0.018，hP=0.012

CINⅠ：cervical intraepithelial neoplasiaⅠ；CINⅡ-Ⅲ：cervical intraepithelial neoplasiaⅡ-Ⅲ；CSCC：cervical squamous cell carcinoma；aP=0.018，bP=0.013，cP=0.014，dP=0.010，eP=0.011，fP=0.009 compared with control group；gP=0.018，hP=0.012 compared with CINⅡ-Ⅲ group

圖 3 KLF5和TNFRSF11a在不同宮頸組織中的mRNA表達

Fig 3 The mRNA expressions of KLF5 and TNFRSF11a in different cervical tissues

與正常對照組相比，aP=0.014，bP=0.021，cP=0.008，dP=0.012，eP=0.002，fP=0.004

aP=0.014，bP=0.021，cP=0.008，dP=0.012，eP=0.002，fP=0.004 compared with control group

A. KLF5(紅色)和TNFRSF11a(綠色)的免疫熒光染色結果(×200)；B.不同宮頸組織免疫熒光染色后熒光強度統計結果

A. immunofluorescence staining of KLF5 (red) and TNFRSF11a (green) (×200)；B. the statistical results of fluorescence intensity for different cervical tissue

圖 4 不同宮頸組織中KLF5和TNFRSF11a的表達

Fig 4 Expressions of KLF5 and TNFRSF11a in different cervical tissue

KLF5靶向調控TNFRSF11a的表達 HeLa細胞分別感染腺病毒過表達KLF5或采用脂質體轉染小干擾RNA敲低KLF5表達，經檢驗轉染效率達70%～80%。PCR和Western blot研究結果顯示：在基礎水平和TNF-α誘導情況下,HeLa細胞過表達KLF5均能夠顯著增加TNFRSF11a的轉錄(圖5A)和蛋白翻譯水平(與綠色熒光蛋白表達的腺病毒組相比，F=15.32，P=0.034，P=0.029，P=0.009)(圖5C)；相反，敲低HeLa細胞KLF5的表達能夠阻止基礎水平和TNF-α誘導的TNFRSF11a的轉錄(圖5B)和蛋白翻譯水平(與非特異性小分子干擾RNA組相比，F=20.01，P=0.012，P=0.015，P=0.022)(圖5D)。熒光素酶報告基因顯示293A細胞感染KLF5表達腺病毒后熒光素酶活性明顯增強(t=4.11，P=0.015)(圖5E)。

KLF5依賴TNFRSF11a的表達促進HeLa細胞的增殖、遷移和侵襲 CCK8和Transwell實驗證實，盡管在HeLa細胞中感染KLF5，腺病毒過表達KLF5可促進HeLa細胞的增殖和遷移侵襲，脂質體介導轉染TNFRSF11a特異性小分子干擾RNA 敲低TNFRSF11a的內源性表達能夠抑制HeLa細胞的增殖和遷移侵襲，但是敲低TNFRSF11a后再過表達KLF5仍然抑制HeLa細胞的增殖、遷移和侵襲能力[與對照組相比，F48 h=10.04，P=0.072，P=0.036，P=0.057；F72 h=19.16，P=0.061，P=0.029，P=0.017；F96 h=23.51，P=0.012，P=0.022，P=0.020(圖6B)；與對照組相比，F=35.21，P=0.035，P=0.015，P=0.049(圖6C)；與對照組相比，F=28.96，P=0.047，P=0.011，P=0.039(圖6D)]。

TNFRSF11a的mRNA表達與宮頸癌臨床病理參數的關系 將宮頸癌組中TNFRSF11a的mRNA表達結果與臨床病理參數進行相關性分析，結果顯示TNFRSF11a mRNA的表達與腫瘤病理分級、臨床分期、肌層浸潤深度和淋巴結轉移均呈正相關(P<0.05)(表2)。

討 論

宮頸癌在全球女性最常見的癌癥中排第2位[1]，是由前體上皮組織從低度鱗狀上皮內病變到高度鱗狀上皮內損傷，并最終導致癌變[8]。宮頸癌具有較強的侵襲遷移能力，其局部復發和遠處轉移影響宮頸癌患者的治療效果及預后，但有關其增殖及侵襲遷移的分子通路尚不清楚。

Ad-KLF5：KLF5重組腺病毒；Ad-GFP：綠色熒光蛋白重組腺病毒；TNF-α：腫瘤壞死因子α；si-KLF5：KLF5特異性小分子干擾RNA；si-NS：非特異性小分子干擾RNA；pGL3-Basic：熒光素酶報告基因質粒3-Basic；與Ad-GFP組相比，aP=0.034，bP=0.029，cP=0.009；與si-NS組相比，dP=0.012，eP=0.015，fP=0.022；與pGL3-Basic組相比，gP=0.015

Ad-KLF5：adenovirus containing-KLF5；Ad-GFP：adenovirus containing-green fluorescent protein；TNF-α：tumor necrosis factor-α；si-KLF5：small interfering-KLF5；si-NS：small interfering-non-specificity RNA；pGL3-Basic：luciferase reporter gene plasmid 3-Basic；aP=0.034，bP=0.029，cP=0.009 compared with Ad-GFP group；dP=0.012，eP=0.015，fP=0.022 compared with si-NS group；gP=0.015 compared with pGL3-Basic group

A. 過表達KLF5后HeLa細胞內KLF5、TNFRSF11a蛋白水平；B. 敲低KLF5后HeLa細胞內KLF5、TNFRSF11a蛋白水平；C. 過表達KLF5后HeLa細胞內TNFRSF11a的mRNA水平；D. 敲低KLF5后HeLa細胞內TNFRSF11a的mRNA水平；E. 雙熒光素酶報告基因檢測在293A 細胞中KLF5激活TNFRSF11a基因啟動子

A. the protein level of KLF5 and TNFRSF11a in HeLa cells after overexpression KLF5；B. the protein level of KLF5 and TNFRSF11a in HeLa cells after knockdown KLF5；C. the mRNA level of TNFRSF11a in HeLa cells after overexpression KLF5；D. the mRNA level of TNFRSF11a in HeLa cells after knockdown KLF5；E. the TNFRSF11a gene promoter was significantly activated by KLF5 in 293A cells，as determined by dual-luciferase assays

圖 5 KLF5調控TNFRSF11a的表達

Fig 5 KLF5 targeting regulated the expression of TNFRSF11a

炎癥在腫瘤發生發展過程中發揮重要作用，本研究選取正常宮頸組織及宮頸癌組織行基因芯片及實時熒光定量PCR檢測，細胞應答炎癥反應的相關基因TNFRSF11a、Il6st、Cxcll3、Socs5、KLF5、Npnt在宮頸癌中表達較正常組織顯著上調。有研究發現多個信號通路參與宮頸癌的發生與發展，如核轉錄因子κΒ信號通路[9]、Janus激酶-信號傳導及轉錄激活因子信號通路[10]、細胞外調節MAP激酶信號通路[11]，激活的信號轉導通路將胞外信號轉變為核內信號，通過轉錄因子的激活導致下游基因的表達或抑制，并發揮相應的生物學作用。轉錄因子KLF5被發現通過激活ERK通路促進乳腺癌的生長[12]，TNFRSF11a被其配體激活后可誘導細胞外調節MAP激酶通路調控多種病理生理過程[13]。因此有必要進一步研究KLF5和TNFRSF11a是否與宮頸癌變過程有關及二者的相關性。

KLF5在許多腫瘤類型中異常表達，研究顯示其在部分三陰性的乳腺癌病例中特異性高表達[14]；同樣在前列腺癌中，其表達與正常組織相比明顯上調[15]；而在腸道腫瘤和腺瘤性病變中，KLF5的表達下調[16]。這些結果表明在不同的腫瘤細胞中KLF5的表達有所不同。Marrero-Rodríguez等[3]研究顯示KLF5在正常組織、低度鱗狀上皮內病變、高度鱗狀上皮內病變和宮頸癌樣本中的表達有逐漸上調趨勢，而Botezatu等[4]研究顯示轉化生長因子β、含WW結構域的E3泛素蛋白連接酶1在CIN Ⅱ-Ⅲ和宮頸癌樣本中表達上調，而KLF5在宮頸癌中下調。以上研究KLF5在宮頸癌中表達的結果相反，可能是由于其在腫瘤發生中具有環境相關性或者研究方法的不同所致，因此仍需探討其在宮頸癌變中的作用。本研究通過實時熒光定量PCR和免疫雙熒光染色檢測證實隨著宮頸病變的進展，KLF5的mRNA和蛋白表達水平均上調(P<0.05)，提示其可能促進宮頸組織癌變。

si-TNFRSF11a：TNFRSF11a特異性小分子干擾RNA；與對照組相比，aP=0.036，bP=0.029，cP=0.017，dP=0.022，eP=0.020，fP=0.012；與對照組相比，gP=0.035，hP=0.015，iP=0.049；與對照組相比，jP=0.047，kP=0.011，lP=0.039

si-TNFRSF11a：smal linterfering-TNFRSF11a RNA；aP=0.036，bP=0.029，cP=0.017，dP=0.022，eP=0.020，fP=0.012 compared with control group；gP=0.035，hP=0.015，iP=0.049 compared with control group；jP=0.047，kP=0.011，lP=0.039 compared with control group

A. HeLa細胞內KLF5和TNFRSF11a蛋白水平；B. HeLa細胞的增殖情況；C. HeLa細胞的遷移情況；D. HeLa細胞的侵襲情況

A. the protein level of KLF5 and TNFRSF11a in HeLa cells；B. the proliferation of HeLa cells；C. the migration of HeLa cells；D. the invasion of HeLa cells

圖 6 KLF5通過TNFRSF11a促進HeLa細胞的增殖、遷移及侵襲

Fig 6 KLF5 promote proliferation，migration，and invasion of HeLa cells dependant-TNFRSF11a expression

表 2 TNFRSF11a的mRNA表達與宮頸癌臨床病理特征的關系(2-△△Ct，x-±s)

研究顯示TNFRSF11a在乳腺癌中上調，與腫瘤組織病理級別正相關，且作為乳腺癌骨轉移患者的一個不良預后因素[5]；其在前列腺癌細胞中也被發現高表達，并被認為在細胞生存和轉移中發揮重要作用[6]。已有報道TNFRSF11a可異常表達在宮頸癌組織中[17]，同時研究已顯示TNFSF11/TNFRSF11a可促進宮頸癌細胞HeLa和SiHa的增殖[7]。本研究顯示在CSCC和CIN組織中TNFRSF11a表達上調，且與腫瘤病理分級、臨床分期、肌層浸潤深度、淋巴結轉移正相關(P<0.05)，提示其可能與宮頸癌變有關。

目前已證明KLF5可通過增強或抑制許多有關細胞周期、血管生成相關基因的轉錄致癌。例如其可以通過緊密控制成纖維細胞生長因子結合蛋白癌基因表達促進細胞增殖、生存以及腫瘤生長[12]。同時KLF5在多個生長因子的信號通路中發揮重要作用，包括腫瘤壞死因子、蛋白激酶C、轉化生長因子-β、類視黃醇和雄激素等[18]。研究顯示腫瘤壞死因子超家族/腫瘤壞死因子受體超家族成員功能包括監管細胞的分化、增殖和生存[19]。本研究證實KLF5和TNFRSF11a在宮頸病變組織中表達正相關。體外研究顯示KLF5可通過調控TNFRSF11a表達進而促進HeLa細胞的增殖、遷移及侵襲，提示KLF5與TNFRSF11a可能存在上下游關系參與宮頸癌變相關調控機制。

人乳頭瘤病毒的感染與宮頸癌的發生發展關系密切，已有報道在CSCC患者中發現人乳頭狀瘤病毒18感染并將致癌基因整合于KLF5第4外顯子[20]，但其是否影響KLF5的表達，進而參與TNFRSF11a表達調控和相關信號途徑機制未見報道。因此，筆者將進一步研究KLF5調控TNFRSF11a的表達是通過何種信號途徑改變細胞生物學活性，以期發現新的宮頸癌變治療的藥物靶點。

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Expressions and Functions of Krüppel Like Factor 5 and Tumor Necrosis Factor Receptor Superfamily Member 11a in Cervical Cancer Tissues and Cells

CHANG Lingya，MA Dong，LI Ou，WANG Xinyue，ZHANG Qi，ZHANG Lijie，YAN Xizhao，ZHENG Huanyu

Department of Obstetrics and Gynecology，Workers’ Hospital of Tangshan， North China University of Science and Technology，Tangshan，Hebei 063000，China

Corresponding author：ZHENG Huanyu Tel：0315- 3722603，E-mail：zheng_huan_yu@163.com

Objective To investigate the expressions of Krüppel like factor 5 (KLF5) and tumor necrosis factor receptor superfamily member 11a (TNFRSF11a) in cervical cancer tissues and their effect on proliferation，migration，and invasion of HeLa cells. Methods Microarray technology was used to detect the mRNA expression of gene in cytocine stimulusin cervical tissues，and the result was verified by real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction. The expressions of KLF5 and TNFRSF11a in cervical tissues were detected by double immunofluorescence staining. HeLa cells were transfected with specific small interfering RNA to knock down the endogenous TNFRSF11a and KLF5 and were infected with adenovirus containing KLF5 to over-express KLF5，respectively. Protein level was detected by Western blot. The regulatory effect of KLF5 on candidate target gene (TNFRSF11a) was determined by dual-luciferase reporter assay. The activity of the cell proliferation，migration，and invasion was detected by using cell counting kit- 8 assay and Transwell assay. Results The results of microarray technology showed that the expressions of KLF5 and TNFRSF11a were significantly higher in cervical squamous cell carcinoma tissues compared with normal cervical tissues (P=0.002，P=0.045)，and real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction showed that the mRNA expressions of KLF5 and TNFRSF11a were significantly higher in cervical intraepithelial neoplasia (CIN) Ⅰ，CINⅡ-Ⅲ and cervical squamous cell carcinoma tissues compared with normal cervical tissues (KLF5：F=32.79，P=0.018，P=0.014，andP=0.011；TNFRSF11a：F=36.72，P=0.013，P=0.010，andP=0.009) and double immunofluorescence staining showed that the protein expressions of KLF5 and TNFRSF11a were significantly higher in CIN Ⅰ，CIN Ⅱ-Ⅲ and cervical squamous cell carcinoma tissues compared with normal cervical tissues (KLF5：F=42.38，P=0.014，P=0.008，andP=0.002；TNFRSF11a：F=35.42，P=0.021，P=0.012，andP=0.004) and increased with the carcinogenesis. The experimentinvitroconfirmed that KLF5 promotes proliferation，migration，and invasion of HeLa by up-regulating TNFRSF11a expression. Clinical analysis showed that the expression of TNFRSF11a mRNA was positively correlated with tumor pathological grading，clinical stage，depth of invasion，and lymph node metastasis (allP<0.05). Conclusions KLF5 and TNFRSF11a are related to cervical cancer. KLF5 promote the proliferation，migration，and invasion of cervical cancer cells partly by upregulating the transcription of TNFRSF11a.

cervical cancer；Krüppel like factor 5；tumor necrosis factor receptor superfamily member 11a；proliferation；invasion

鄭寰宇 電話：0315- 3722603，電子郵件：zheng_huan_yu@163.com

R737.33

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1000- 503X(2017)02- 0196- 10

10.3881/j.issn.1000- 503X.2017.02.006

2016- 08- 22)